Name: Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse von Siderophoren aus Pseudomonas aeruginosa mittels spektrophotometrischer Methoden. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die vereinfachte Bestimmung von Pyoverdin und Pyochelin in klinischen Isolaten.

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Die Autoren danken für die Finanzierung durch DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program und FIST. MR bedankt sich für das von SHODH erhaltene Stipendium. HP bedankt sich für das vom CSIR erhaltene Stipendium.

Alle Bakterienisolate von P. aeruginosa wurden aus medizinischen mikrobiologischen Labors in Vadodara und Jaipur, Indien, bezogen. Alle ausgewählten klinischen Isolate wurden in der Biosicherheitswerkbank (BSL2) gehandhabt und beim Umgang mit Bakterienisolaten während der Experimente wurde äußerste Sorgfalt walten lassen. Die kommerziellen Details aller Reagenzien/Lösungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Herstellung von Chrom-Azurolsulfonat (CAS)-Farbstoff und Agar-Agar-Medien
<ol><li>CAS-Farbstoff (100 ml) mit der folgenden Zusammensetzung herstellen:<ol><li>60 mg CAS werden in 50 ml destilliertem Wasser (Lösung 1) gelöst.</li>
		<li>2,7 mg FeCl3·6H2Owerden in 10 ml 10 mM HCl (Lösung 2) gelöst.</li>
		<li>73 mg Cetrimoniumbromid (HDTMA) werden in 40 ml destilliertem Wasser (Lösung 3) gelöst.</li>
		<li>Mischen Sie Lösung 1, Lösung 2 und Lösung 3 vorsichtig. Bewahren Sie es in einer Glasflasche auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie CAS-Agar vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:<ol><li>100 ml MM9-Salzlösung in 750 ml destilliertes Wasser geben.</li>
		<li>32,24 g Piperazin-N,N'-BIS(2-ethansulfonsäure)-freie Säure (PIPES) werden gelöst.</li>
		<li>Fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklavieren und abkühlen lassen.</li>
		<li>Geben Sie 30 ml sterile Casaminosäurelösung und 10 ml sterile 20%ige Glukoselösung in die Mischung.</li>
		<li>Fügen Sie 100 ml CAS-Farbstoff hinzu, mischen Sie ihn und gießen Sie ihn unter aseptischen Bedingungen ein. ANMERKUNG: Die Herstellung von MM9-Medien, Casaminosäurelösung und 8-Hydroxychinolin ist in der Zusatzdatei 1 enthalten. PIPES-Puffer ist pH-empfindlich. Es löst sich erst auf, wenn ein pH-Wert von 5,6 erreicht ist. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ständig überwacht wird, denn wenn sich PIPES in Wasser aufzulösen beginnt, wird der pH-Wert weiter gesenkt. Extrakt Casaminosäure mit dem gleichen Volumen von 3% 8-Hydroxychinolin, gelöst in Chloroform. Lassen Sie die nicht mischbare Lösung ca. 20 min bei 4 °C stehen und fangen Sie die obere Phase der Lösung vorsichtig auf, ohne die untere Phase zu stören.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Qualitative Analyse der Produktion von Siderophoren
<ol><li>Stellen Sie den OD600 nm auf 0,2 für 24 h gewachsene Kulturen von P. aeruginosa ein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Bakterienkultur auf eine CAS-Agarplatte zu streichen.</li>
	<li>24 h bei 30 °C inkubieren. HINWEIS: Zur Verdünnung der Bakterienkultur können Pepton-Wassermedien oder 0,8 % normale Kochsalzlösung verwendet werden. Wenn nach 24 Stunden kein Bakterienwachstum beobachtet wird, werden die CAS-Platten 48 bis 72 Stunden lang inkubiert.</li>
</ol>3. Quantitative Schätzung der gesamten Siderophore
<ol><li>24-Stunden-Kulturen von P. aeruginosa werden in Pepton-Wassermedien erneut inokuliert, nachdem der OD600 nm auf 0,25 eingestellt wurde, und 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.</li>
	<li>Nach 48 h zentrifugiert man die Bakterienkultur bei 4650 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation werden 100 μl zellfreier Überstand auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 100 μl CAS-Farbstoff hinzugefügt.</li>
	<li>Die Platte mit Alufolie abdecken und bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation werden spektrophotometrische Messungen bei 630 nm durchgeführt.</li>
	<li>Berechnen Sie die erhaltenen Ergebnisse für die Quantifizierung der gesamten Siderophore als prozentuale Siderophoreinheit (PSU). HINWEIS: Das Netzteil kann wie folgt berechnet werden: [(Ar - As)/Ar] x 100 wobei Ar = Absorption der Referenz bei 630 nm, As = Absorption des zellfreien Überstandes der Probe. Als Referenz sollte der CAS-Farbstoff zu nicht inokulierten Pepton-Wassermedien hinzugefügt werden. Füllen Sie alle Gläser wie Reagenzgläser, Kolben usw. 2 h lang mit 6 M HCl und spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren von Eisen zu entfernen.</li>
</ol>4. Quantitative Schätzung von Pyoverdin
<ol><li>24 h gezüchtete Kulturen von P. aeruginosa in Pepton-Wassermedien nach Einstellung von OD600 nm auf 0,25 erneut inokuliert und 48 h bei 30 °C inkubiert.</li>
	<li>Messen Sie nach 48 Stunden den OD600 nm des Bakterienwachstums, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Die Bakterienkultur wird bei 4650 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation werden 100 μl zellfreier Überstand auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) hinzugefügt.</li>
	<li>Führen Sie spektralphotometrische Messungen bei OD405 nm durch.</li>
</ol>5. Pyochelin-Extraktion und Spektrophotometrie
<ol><li>24-h-gezüchtete Kulturen von P. aeruginosa werden in King's B-Medien (Ergänzungsdatei 1) erneut inokuliert, nachdem OD600 nm auf 0,25 eingestellt wurde, und 24 h lang bei 30 °C inkubiert.</li>
	<li>Nach 24 h werden 100 ml Kultur entnommen und bei 4650 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation werden 5 ml 1 M Zitronensäure in den Überstand gegeben. Zweimal mit 50 ml Ethylacetat extrahieren.</li>
	<li>Die organische Phase mit Magnesiumsulfat durch einen Spritzenvorsatzfilter filtrieren. Lagern Sie die filtrierte organische Phase bei -20 °C.</li>
	<li>Führen Sie spektralphotometrische Messungen bei 320 nm durch. HINWEIS: Da Pyochelin bei Raumtemperatur eine sehr instabile Verbindung ist, führen Sie den Extraktionsprozess auf Eis durch. Verwenden Sie eine sterile 50-ml-Spritze für die Filtertrennung. Legen Sie Watte auf die Spitze der Spritze und geben Sie 1 g Magnesiumsulfat darauf. Befestigen Sie einen sterilen Spritzenfilter an der Spitze der Spritze und sammeln Sie das Filtrat in einem sterilen Röhrchen.</li>
</ol>

Bewertung der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa-Isolaten

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
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<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
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<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Gesamtzahl der Siderophore und zwei verschiedene Siderophore von P. aeruginosa, nämlich Pyoverdin und Pyochelin, aus dem bakteriellen zellfreien Überstand zu quantifizieren. Im CAS-Agarplatten-Assay bilden der CAS-Farbstoff undFe3+-Ionen einen Komplex. Wenn Bakterien Siderophore produzieren, löschen sieFe-3+-Ionen aus dem CAS-Fe3+-Komplex, was zu einer Farbänderung um das Bakterienwachstum herum führt. Diese Veränderung führt zu einem deutlichen orangefarbenen Halo um das Bakterienwachstum14,15. Während Bakterien direkt auf CAS-Agarplatten gestreift werden können, können die Gesamtergebnisse beeinträchtigt werden. Das Streifen einer hohen Anzahl von Bakterienzellen kann einen breiten orangefarbenen Halo um das Bakterienwachstum erzeugen, während die Verwendung von weniger Bakterienzellen zu einer schmalen, klaren Zone führen kann. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine einheitliche Anzahl von Bakterienzellen gestreift, indem wir den OD600 angepasst haben. Anspruchsvolle Bakterien können innerhalb von 24 Stunden Ergebnisse zeigen, während langsam wachsende Bakterien mehr als 72 Stunden brauchen können, um die Siderophorproduktion nachzuweisen.
Für die quantitative Bestimmung von Gesamtsiderophoren wurde zunächst die klassische Spektroskopie eingesetzt, die für die Detektion von Siderophoren eine erhebliche Menge an Überständen erfordert, was sie unpraktisch macht. Die Quantifizierung der gesamten Siderophore erfolgt nun unter Verwendung einer 96-Well-Platte mit einem modifizierten CAS-Assay. Dieser Ansatz hat im Vergleich zu herkömmlichen spektroskopischen Methoden zu einer Reduzierung des Verbrauchs von Reagenzien, bakteriellen Überständen und Zeit sowie zu einer höheren Genauigkeit geführt16. Andere Studien haben auch über die Verwendung von Mikrotiterplatten als zeitsparende und effizientere Methode berichtet17. Die Quantifizierung der gesamten Siderophore mit Hilfe einer Mikrotiterplatte hat sich als effizienter Ansatz erwiesen. In dieser Studie wurden 48 Stunden alte Bakterienkulturen, die in eisenfreien Medien gezüchtet wurden, für die Untersuchung ausgewählt. Es wurde auch eine vergleichende Studie durchgeführt, um die Siderophorproduktion in verschiedenen Wachstumsmedien wie Luria-Brühe, Luria-Bouillon (extrahiert mit 3% 8-Hydroxychinolin), King's B-Medien (extrahiert mit 3% 8-Hydroxychinolin) und Peptonwassermedien (extrahiert mit 3% 8-Hydroxychinolin) zu bewerten. Es wurde beobachtet, dass Pepton-Wassermedien die höchste Menge an Siderophorproduktion aufwiesen, und daher wurde es für weitere Experimente ausgewählt. Ein Diagramm, das die Siderophorproduktion in verschiedenen Nährmedien darstellt, ist in der ergänzenden Abbildung 1 enthalten.
Pyoverdin kann mit spektrofluorimetrischen Messungen nachgewiesen und quantifiziert werden, aber nur Pyoverdin ist bekannt, dass es Fluoreszenz aufweist. Pyoverdin im Komplex mitFe3+-Ionen zeigt keine Fluoreszenz18,19. Für den Nachweis und die Quantifizierung von Pyoverdin wurden 48 Stunden alte Bakterienkulturen für die Untersuchung ausgewählt. Es ist bekannt, dass P. aeruginosa unter anfänglich eisenarmen Bedingungen Pyochelin produziert und nach starker Eisenbelastung auf die Pyoverdin-Produktion umschaltet. Es wurde gezeigt, dass Pyoverdin andere metallische Kationen wie Aluminium, Gallium, Mangan und Chrom chelatieren kann, aber nur Eisen erfolgreich zur Zellmembrantransportiert wird 19.
Ähnlich wie Siderophore und Pyoverdin kann Pyochelin nicht direkt aus zellfreiem Überstand quantifiziert werden und muss mit Dichlormethan20 extrahiert werden. Dichlormethan ist mit dem zellfreien Überstand nicht mischbar und bildet unten eine separate Schicht. In dieser Studie wurden verschiedene Nährmedien getestet, darunter Luria-Brühe, Peptonwasser und Casaminosäure-Medien, aber eine signifikante Menge an Pyochelin wurde aus King's B-Medien gewonnen. Während Hoegy et al. CAA-Medien in ihrem Protokoll verwendet hatten, modifizierten wir sie mit King's B-Medien, da CAA-Medien das Bakterienwachstum nicht unterstützten21. Das Verfahren wurde weiter modifiziert, indem Nährmedien mit 8-Hydroxychinolin extrahiert wurden, um Eisenreste aus dem Medium zu entfernen, wodurch ein eisenarmes Medium erzeugt wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Inkubationszeit die Pyochelinproduktion signifikant beeinflusst. Dumas et al. zeigten, dass P. aeruginosa unter schweren eisenlimitierenden Bedingungen von der Pyochelin- auf die Pyoverdinproduktion umstellt12. In dieser Studie wurde die Pyochelin-Extraktion und der Nachweis aus 24 h alten Bakterienkulturen durchgeführt, da Pyochelin in 48-h-Kulturen nicht nachgewiesen wurde. Das Volumen des Überstandes beeinflusst auch die Pyochelin-Detektion, und daher wurden 100 ml zellfreier Überstand für die Extraktion verwendet. Darüber hinaus war die Pyochelinproduktion in MR1-, TL7- und J3-Isolaten signifikant höher, was möglicherweise auf Bakterienstämme zurückzuführen ist, die trotz starker Eisenchelatoren nicht in der Lage sind, Pyoverdin zu produzieren22.
Ji et al. stellten einen neuartigen und sensitiven Ansatz zur Quantifizierung von Pyochelin vor und validierten ihn mittels LC/MS/MS. Diese Methode galt jedoch nur für P. aeruginosa-Isolate aus dem Sputum von Mukoviszidose-Patienten. LC/MS/MS ist ein kostspieliger Aufbau, der für die meisten Labore möglicherweise nicht erschwinglichist 23. Visaggio et al. entwickelten einen biolumineszierenden Biosensor auf Basis ganzer Zellen, der eine schnelle, empfindliche und einstufige Quantifizierung von Pyochelin ermöglicht. Nichtsdestotrotz kann diese Methode keine Quantifizierung für Gesamtsiderophore und Pyoverdin24 liefern.
Siderophor-Eisenaufnahmesysteme könnten eine antimikrobielle Anwendung bei der Verabreichung von Medikamenten für multiresistente Bakterien haben, da sie eine entscheidende Rolle für das Überleben und die Virulenz von Bakterien spielen. Dieser Ansatz könnte einen neuen Weg zur Bekämpfung multiresistenter Bakterien bieten25. Arzneimittel, die die bakterielle Zellmembran nicht durchdringen können, können mit einem Siderophor verknüpft werden, und der resultierende Fe-siderophor-Komplex kann innerhalb der bakteriellen Membran26 transportiert werden.

Organismen benötigen Eisen, um verschiedene lebenswichtige Funktionen zu erfüllen, wie z. B. den Elektronentransport und die DNA-Replikation1. Es ist bekannt, dass Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegativer opportunistischer Erreger, eine Vielzahl von Virulenzfaktoren besitzt, um eine Infektion im Wirt zu etablieren, von denen ein Mechanismus die Siderophorbildungist 2. Unter eisenabbauenden Bedingungen setzt P. aeruginosa spezialisierte Moleküle frei, die als Siderophore bezeichnet werden und Eisen aus der Umgebung abschrecken. Siderophore chelatieren Eisen extrazellulär, und der resultierende Eisen-Siderophor-Komplex wird aktiv zurück in die Zelletransportiert 3.
Es ist bekannt, dass P. aeruginosa zwei Siderophore, Pyoverdin und Pyochelin, produziert. Es ist bekannt, dass Pyoverdin eine höhere Eisenchelat-Affinität (1:1) hat, während Pyochelin eine geringere Eisen-Chelat-Affinität (2:1)4 aufweist. Pyochelin wird auch als sekundärer Siderophor bezeichnet, da es eine geringere Eisenchelataffinität aufweist5. Die Produktion und Regulation von Siderophoren wird aktiv durch Quorum Sensing (QS)-Systeme in P. aeruginosa6 gesteuert.
Neben der Eisenlöschung sind Siderophore auch an der Regulation von Virulenzfaktoren beteiligt und spielen eine aktive Rolle bei der Biofilmbildung7. Siderophore erfüllen weitere wichtige Rollen, darunter die Beteiligung an der Zellsignalisierung, die Abwehr von oxidativem Stress und die Erleichterung von Interaktionen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften8. Siderophore werden in der Regel nach den spezifischen funktionellen Gruppen kategorisiert, durch die sie Eisen chelatisieren. Die drei primären zweizähnigen Liganden in dieser Klassifikation sind Catecholat, Hydroxamat und α-Hydroxycarboxylat3. Pyoverdine sind Kennzeichen fluoreszierender Pseudomonas-Arten wie P. aeruginosa und P. fluorescens5. Sie bestehen aus einem gemischten grün fluoreszierenden Chromophor, der an ein Oligopeptid gekoppelt ist, das 6-12 Aminosäuren enthält. An ihrer Synthese sind mehrere nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPs) beteiligt9. Vier Gene, die an der Produktion und Regulation von Pyoverdin beteiligt sind, sind pvdL, pvdI, pvdJ und pvdD10. Pyoverdin ist auch für Infektionen und Virulenz bei Säugetieren verantwortlich11. Es ist bekannt, dass P. aeruginosa Pyochelin unter mäßig eisenlimitierenden Bedingungen produziert, während Pyoverdin unter schweren eisenlimitierenden Umgebungen produziert wird12. Zwei Operone, die an der Pyochelinproduktion beteiligt sind, sind pchDCBA und pchEFGHI13. Es wird darauf hingewiesen, dass Pyochelin (Katecholat) in Gegenwart von Pyocyanin oxidative Schäden und Entzündungen induziert und Hydroxylradikale erzeugt, die für das Wirtsgewebe schädlich sind11.
Der Chrom-Azurolsulfonat-Assay (CAS) ist aufgrund seiner Umfassendheit, seiner hohen Sensitivität und seines größeren Komforts im Vergleich zu mikrobiologischen Assays, die zwar empfindlich, aber überspezifisch sein können, weit verbreitet14. Der CAS-Assay kann auf Agaroberflächen oder in einer Lösung durchgeführt werden. Es beruht auf der Farbänderung, die auftritt, wenn das Eisen-Ion von seinem intensiven blauen Komplex zu orange übergeht. Der kolorimetrische CAS-Assay quantifiziert die Verarmung von Eisen aus einem ternären Fe-CAS-Tensidkomplex. Dieser spezielle Komplex, bestehend aus Metall, organischem Farbstoff und Tensid, hat eine blaue Farbe und weist einen Absorptionspeak bei 630 nm auf.
In diesem Bericht wird eine Methode zum qualitativen Nachweis der Siderophorproduktion vorgestellt, bei der die Produktion von Siderophoren auf einer Agarplatte nachgewiesen werden kann. Eine Methode zur quantitativen Abschätzung der gesamten Siderophorproduktion in einer Mikrotiterplatte und zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von zwei Siderophoren, Pyoverdin und Pyochelin, aus P. aeruginosa wird ebenfalls bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar, Typ I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-Hydroxychinolin</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Casaminosäure</td><td>SRL Chemikalien</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>Chromazurolsulfonat</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose-Monohydrat</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Eisenchlorid-Hexahydrat</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>Glas Reagenzgläser</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King's Medium B Base</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Minimal Medium Salze</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO UV-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Typ I, bakteriologisch</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES freie Säure</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Pepton</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Shimadzu</td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

qualitative und quantitative analyse der siderophorproduktion aus pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist dafür bekannt, dass er eine Vielzahl von Virulenzfaktoren produziert, um Infektionen im Wirt zu etablieren. Ein solcher Mechanismus ist das Abfangen von Eisen durch Siderophorproduktion. P. aeruginosa produziert zwei verschiedene Siderophore: Pyochelin, das eine geringere Eisenchelat-Affinität aufweist, und Pyoverdin, das eine höhere Eisenchelat-Affinität aufweist. Dieser Bericht zeigt, dass Pyoverdin direkt aus bakteriellen Überständen quantifiziert werden kann, während Pyochelin vor der Quantifizierung aus Überständen extrahiert werden muss.
Die primäre Methode zur qualitativen Analyse der Siderophorproduktion ist der Chrom-Azurolsulfonat-Agarplatten-Assay (CAS). In diesem Assay führt die Freisetzung des CAS-Farbstoffs aus demFe3+-Farbstoffkomplex zu einem Farbwechsel von Blau zu Orange, was auf eine Siderophorproduktion hinweist. Für die Quantifizierung der gesamten Siderophore wurden bakterielle Überstände zu gleichen Teilen mit CAS-Farbstoff in einer Mikrotiterplatte gemischt, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 630 nm. Pyoverdin wurde direkt aus dem bakteriellen Überstand quantifiziert, indem es zu gleichen Teilen mit 50 mM Tris-HCl gemischt wurde, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse. Ein Peak bei 380 nm bestätigte das Vorhandensein von Pyoverdin. Was Pyochelin betrifft, so war eine direkte Quantifizierung aus dem bakteriellen Überstand nicht möglich, so dass es zuerst extrahiert werden musste. Die anschließende spektrophotometrische Analyse ergab das Vorhandensein von Pyochelin mit einem Peak bei 313 nm.

Vor der Quantifizierung von Siderophoren aus klinischen Isolaten wurde ein qualitatives Screening auf die Siderophorproduktion durchgeführt, um die Produktion von Siderophoren sicherzustellen. Der qualitative Nachweis von Siderophoren aus klinischen Isolaten wurde durch streifende Bakterien auf CAS-Agarplatten beobachtet. Drei klinische Isolate, nämlich MR1, TL7, J3, sowie PAO1 (der Referenzstamm), wurden für die Studie ausgewählt. Alle drei klinischen Isolate und PAO1 zeigten positive Ergebnisse für die Siderophorproduktion, wobei ein klarer orangefarbener Halo um das Bakterienwachstum auf der blauen Agaroberfläche auf eine positive Siderophorproduktion hinwies (Abbildung 1). Die Halobildung auf dem CAS-Agar (Abbildung 1) ergab eine grobe Abschätzung der Siderophorproduktion durch klinische Isolate. Daher wurde eine quantitative Abschätzung der Siderophorproduktion unter Verwendung von CAS-Reagenz und flüssigen Medien durchgeführt.
Die Quantifizierung des gesamten Siderophors wurde direkt aus dem zellfreien Überstand durchgeführt. Nach der Inkubation wurde eine Farbänderung beobachtet, bei der die gelbe Farbe auf die Entfernung des CAS-Farbstoffs aus dem Fe-Komplex hinwies. Hier wurde CAS-Farbstoff mit unbeimpftem Nährmedium als Kontrolle verwendet, der für die Berechnung der Siderophore herangezogen wurde. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtsiderophorproduktion in den Isolaten MR1 und TL7, während es in J3 im Vergleich zu PAO1 eine signifikante Gesamtsiderophorproduktion gab (Abbildung 2).
Als nächstes wurde die Pyoverdin-Quantifizierung direkt aus zellfreien Überständen durchgeführt. Pyoverdine werden in Zellumgebungen freigesetzt, daher wurde der zellfreie Überstand für die Pyoverdin-Quantifizierung verwendet. Es wurde auch ein UV-Bereichsscan mit dem Spektralphotometer durchgeführt, bei dem der Peak bei 380 nm das Vorhandensein von Pyoverdin bestätigte (Abbildung 3A). Die spektralphotometrischen Messungen wurden bei 405 nm durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als OD405/OD600 nm interpretiert. Alle Isolate zeigten eine Pyoverdin-Produktion, wobei die Isolate MR1 und J3 im Vergleich zu PAO1 einen signifikant niedrigeren Pyoverdin-Gehalt aufwiesen, während für TL7 kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde (Abbildung 3B).
Pyochelin kann nicht direkt aus dem zellfreien Überstand quantifiziert werden. Es war nicht möglich, Pyochelin aus 1 ml zellfreiem Überstand zu extrahieren, daher wurde es aus 100 ml zellfreiem Überstand extrahiert. Es wurde mit 1 M Zitronensäure angesäuert. Da es sich bei Pyochelin um eine sehr instabile Verbindung handelt, wurde der Extraktionsprozess auf Eis durchgeführt. Der Pyochelin-Nachweis wurde durch einen UV-Bereichsscan von einem Bereich von 300 bis 600 nm durchgeführt, wobei der Peak bei OD320 nm das Vorhandensein von Pyochelin bestätigte (Abbildung 4A). Die Quantifizierung von Pyochelin erfolgte durch spektrophotometrische Messungen bei OD320 nm. Die Berechnungen erfolgten durch Division von OD320/OD600. Die Isolate MR1, TL7 und J3 zeigten eine signifikant höhere Produktion von Pyochelin im Vergleich zum Referenzisolat PAO1 (Abbildung 4B).
Es wurde eine vergleichende Siderophorproduktion in verschiedenen bakteriellen Wachstumsmedien durchgeführt, um die Gesamtmenge der in verschiedenen Wachstumsmedien produzierten Siderophore zu überprüfen. Es wurden vier verschiedene Medien ausgewählt, wobei Luria-Brühe, King's B-Medien und Peptonwasser mit 3% 8-Hydroxychinolin extrahiert wurden, und unextrahierte Luria-Bouillon für die Studie ausgewählt wurde. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Siderophorproduktion in extrahierter Luria-Brühe, King's B-Medien und Pepton-Wassermedien, während ein signifikanter Unterschied für die Siderophorproduktion in nicht extrahierter Luria-Brühe beobachtet wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Siderophorproduktion auf CAS-Agar. Das Wachstum von P. aeruginosa auf CAS-Agarplatten von 24-h-gezüchteten Kulturen wurde auf CAS-Agarplatten gespottet und bei 30 °C für 24 h inkubiert. Das Vorhandensein von Siderophoren wird durch einen orangefarbenen Halo um die Bakterienkolonie (PAO1, MR1, TL7 und J3) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Gesamtproduktion von Siderophoren. Die gesamte Siderophorproduktion wurde auf PAO1 und drei klinische Isolate (MR1, TL7 und J3) untersucht. 100 μl zellfreier Überstand (von PAO1, MR1, TL7 und J3, die 24 h lang in Peptonwasserbrühe gezüchtet wurden) wurden zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, danach wurden 100 μl CAS-Farbstoff hinzugefügt. Ein unidirektionaler ANOVA-Test wurde auf statistische Signifikanz durchgeführt. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung (SD) zwischen drei biologischen Replikaten dar. *entspricht p &lt; 0,05; ns entspricht p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Pyoverdin-Produktion. Pyoverdin-Produktion von P. aeruginosa-Stamm PAO1 und klinischen Isolaten (MR1, TL7 und J3) nach 24 Stunden Wachstum in Pepton-Wassermedien. Die Bakterienkulturen wurden zentrifugiert, und 100 μl zellfreier Überstand wurden zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte hinzugefügt. Danach wurden 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) zugegeben. Die Detektion von Pyoverdine erfolgte mittels UV-Spektrophotometrie mit einem Bereich von 350 nm bis 600 nm. Spektrometrische Analyse bei 380 nm Pyoverdinproduktion (A). Quantifizierung der Pyoverdin-Produktion (B). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler über dem Mittelwert von dreifachen Experimenten an. Fehlerbalken stellen ± SD zwischen drei biologischen Replikaten dar. entspricht p &lt; 0,0001, **entspricht p &lt; 0,01 und ns entspricht p &gt; 0,05 basierend auf dem Einweg-ANOVA-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Pjochelin-Produktion. Pyochelinproduktion von PAO1 (als Referenz) und klinischen Isolaten (MR1, TL7 und J3) durch Extraktion mit Ethylacetat und Magnesiumsulfat. Spektrophotometrische Analyse mit einem Bereich von 230 nm bis 400 nm (A). Quantifizierung von Pyochelin (B). Für jedes Isolat wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Fehlerbalken stellen ± SD zwischen drei biologischen Replikaten dar. entspricht p &lt; 0,001 basierend auf dem Einweg-ANOVA-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Vergleichende Produktion von Siderophoren in verschiedenen bakteriellen Wachstumsmedien. Gesamtproduktion von Siderophoren in vier verschiedenen Wachstumsmedien, wobei King's B-Medien, Peptonwassermedien und Luria-Bouillon mit 3% 8-Hydroxychinolin extrahiert wurden, um Spuren von Eisen daraus zu entfernen, und Luria-Bouillon (nicht extrahiert) ausgewählt wurden. Die Extraktion durch 3% 8-Hydroxychinolin wurde durchgeführt, indem ein gleiches Volumen von 3% 8-Hydroxychinolin zu dem Medium zugegeben wurde. Fehlerbalken stellen ± SD zwischen drei biologischen Replikaten dar. **entspricht p &lt; 0,001 und ns entspricht p &gt; 0,5 basierend auf dem Einweg-ANOVA-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Medienrezepte, die für die vorliegende Studie verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Datei anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.

Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Siderophore bilden Komplexe mit Eisen und transportieren es unter eisenlimitierenden Bedingungen in die Zelle. Siderophore sind potente Virulenzfaktoren, die bei der Etablierung schwerer Infektionen im Wirt helfen und von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle bei der Regulierung des Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa spielen. Unsere Forschung zielt darauf ab, die Siderophorproduktion in Pseudomonas quantitativ abzuschätzen.Siderophore sind extrazelluläre Moleküle, so dass die Gesamtmenge der Siderophore zusammen mit Pyoverdin und Pyochelin mit zellfreiem Überstand quantifiziert wird. Da Pyochelin nicht in kleinen Mengen nachgewiesen wird, wird die Extraktion aus einem großen Volumen zellfreien Überstandes durchgeführt. In jüngster Zeit wurden LCMS und Biosensoren zur Quantifizierung von Pyochelin entwickelt.LCMS ist ein kostspieliger Aufbau für kleine Labore, während Biosensoren nur in der Lage sind, Pyochelin zu quantifizieren. Dieses einfache und illustrierte Protokoll verwendet ein Minimum an Laborreagenzien und -instrumenten und ermöglicht die Schätzung von Siderophoren aus zellfreiem Überstand in kürzerem Zeitaufwand.

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Biology

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