Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie
8. November 2006
Okay, was ich heute zeigen möchte, ist, wie man eine Durchflusskammer, eine Fusionskammer zur Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop, konstruiert. Dazu erzeuge ich zwei Bereiche mithilfe von Folie. Dazu nehme ich die Parafolie und schneide sie in kleine Streifen.
Danach werde ich im Wesentlichen die Kanäle für die Wände bilden und trockne sie mit schrägem Luftstrom. Ich lege den Deckglaser auf das Para. Hier ist das fertige Präparat. Anschließend erhitze ich es auf einem Heizblock, um das Para zu schmelzen und im Wesentlichen eine Abdichtung zu erzeugen.
Das hier ist also das Deckglas, und darauf befinden sich, wie Sie hier sehen, zwei Schichten aus Phim. Darüber liegt erneut ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas, genau dieses hier, das ich gegen das Param drückte, um die Abdichtung zu erzielen.
Okay, die Flüssigkeit wird hier in die eine Richtung eingeführt, und ich kann sie hier mit einem Filterpapier in dieser Richtung abziehen. Ich zeige Ihnen gleich, wie das funktioniert. Was ich gerne mache, ist, es in eine befeuchtete Kammer zu stellen, was sehr einfach ist.
Nehmen Sie zwei Arten erhöhter Streifen und legen Sie ein Filterpapier darunter. Und um es geräuschvoll zu halten, lege ich das Deckglas auf die Durchflusskammer. Um eine Lösung in die Kammer einzubringen, setzen Sie die Pipettenspitze einfach am Eingang der Kammer an und geben die Flüssigkeit ab.
Jetzt inkubiere ich die Kammer mit geschlossenem Deckel für 10 Minuten. Um die Flüssigkeit von der anderen Seite abzusaugen, nehme ich normalerweise ein Filterpapier und schneide es in dünne Streifen wie diesen. Einen dieser dünnen Streifen verwende ich, um gleichzeitig die Lösung am Eingang zuzugeben und das Filterpapier am Ausgang anzusetzen, um den Austausch, also die Lösung, abzusaugen.
Sie werden sehen, wie die Flüssigkeit durch die Lösung fließt. Dann warte ich fünf Minuten auf den mittleren Abschluss. Nun bin ich bereit, das Aktin tatsächlich in die Flusskammer einzubringen; das Aktin muss ich polymerisieren, und zwar direkt innerhalb der Flusskammer, wobei die gleichen Verfahren wie zuvor angewendet werden.
Da nun die Aktion polymerisiert ist, wasche ich die überschüssige, nicht polymerisierte Aktion mit einem großen Puffer-Volumen aus. Hier habe ich etwa hundert Mikroliter, was einigen Reaktionskammer-Volumina an Puffer entspricht. Einfach so, wie Sie wissen, wenn das Filterpapier gesättigt ist, muss ich die Richtung wechseln. Okay?
Und so bin ich bereit, damit die Bildgebung durchzuführen. Die Perfusionskammer mit an ihr befestigtem Aktin liegt vor. Nun nehme ich den Objektträger, befestige ihn unter dem Mikroskop und da ich mit einem Öl-Objektiv abbilde, gebe ich etwas Immersionsöl auf die obere Oberfläche des Deckglases, sodass der Öltropfen die Lösung, das Protein oder jegliches Material auf dem Aktin im Inneren erreicht.
Was ich also mache, ist, dass ich die Lösung während der zeitraffenden Bildaufnahme tatsächlich austauschen kann. So eben.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Konstruktion einer Durchflusskammer und einer Fusionskammer zur Abbildung an einem aufrechten Mikroskop beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Erzeugung von Kanälen mittels Parafilm und deren Versiegelung durch Wärme.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
Hintergrund
- Flusskammern sind für verschiedene Abbildungstechniken unerlässlich.
- Die Konstruktion einer Fusionskammer ermöglicht verbesserte Abbildungsmöglichkeiten.
- Parafilm wird üblicherweise in Laborumgebungen zum Erstellen von Dichtungen verwendet.
- Das Verständnis des Konstruktionsprozesses ist entscheidend für Forscher auf diesem Gebiet.
Zweck der Studie
- Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Aufbau einer Durchflusskammer.
- Veranschaulichung der Verwendung von Parafilm zur Herstellung von Abbildungskammern.
- Verbesserung der Zugänglichkeit von Abbildungstechniken für Forschende.
Verwendete Methoden
- Schneiden von Parafilm in Streifen, um Kanäle zu bilden.
- Trocknen der Streifen mit geneigter Luftzufuhr.
- Auflegen eines Deckgläschens auf das Parafilm.
- Erhitzen der Anordnung auf einem Heizblock, um eine Dichtung zu erzeugen.
Hauptergebnisse
- Eine funktionelle Flusskammer wurde erfolgreich konstruiert.
- Der Versiegelungsprozess erwies sich als effektiv bei der Schaffung einer stabilen Umgebung für die Bildgebung.
- Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar und für den Laborgebrauch geeignet.
- Forscher können diese Technik für verschiedene bildgebende Anwendungen nutzen.
Schlussfolgerungen
- Die Herstellung von Durchfluss- und Fusionskammern ist unkompliziert.
- Diese Methode kann fortgeschrittene Abbildungsstudien erleichtern.
- Der Zugang zu solchen Techniken kann die Forschungsergebnisse verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Herstellung kontrollierter Mikroumgebungen für die Live-Cell-Bildgebung und unterstützt damit mechanistische Untersuchungen der Zytoskelettdynamik. Durch die Standardisierung des Flusskammer-Aufbaus wird die Variabilität in perfusionsbasierten Assays verringert und die Datenkonsistenz zwischen verschiedenen Forschungsteams verbessert. Die Methode erlaubt die quantitative Analyse der Aktin-Disassemblierungskinetik, einem zentralen Prozess der Zellmotilität und Signaltransduktion, der für die Target-Validierung in Onkologie und Immunologie von Bedeutung ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der Aktin-Depolymerisationsdynamik, um Regulatoren der Umgestaltung des Cytoskeletts zu untersuchen.
- Operativer Wert: Bietet eine standardisierte Plattform zur Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf den Aktin-Umsatz in lebenden Zellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung fluoreszenzbasierter Messgrößen für Aktin-Disassemblierungsraten als funktionellen Assay-Endpunkt.
- Operativer Wert: Ermöglicht den Lösungsaustausch während der Zeitrafferaufnahme, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen unter Perfusionsbedingungen zu bewerten.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Aktindynamik mit zellulären Phänotypen, die für Metastasierung, Invasion und die Bildung des immunologischen Synapses relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die präklinische Bewertung von Signalweginhibitoren unter Verwendung quantifizierbarer bildgebender Biomarker.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Bindungs-Screening bis zur funktionalen Validierung in krankheitsrelevanten zellulären Systemen ein.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Zytoskelettregulatoren durch Echtzeit-Visualisierung des Aktin-Flusses.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Messungen der Aktin-Disassemblierung unter kontrollierten Perfusionsbedingungen.
- Analytik: Erzeugt zeitlich aufgelöste Fluoreszenzintensitätsdaten, die eine kinetische Modellierung des Aktin-Umbaus ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Mechanismen mit zellulären Phänotypen in präklinischen Modellen der Zellmigration.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Perfusionsplattform, die an verschiedene zytoskelettale Zielstrukturen und Zelltypen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung von Zielstrukturen, die an der Aktinregulation beteiligt sind, durch direkte funktionelle Nachweise.
- Operationaler Wert: Standardisierte Kammerpräparation verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene Standorte und Bediener hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühere Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Modulation von Zielstrukturen mit funktionellen zytoskelettalen Ergebnissen verknüpft wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Wirkung auf Zellmotilität und Invasionseigenschaften.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung und der Mikrofluidik-Flusssteuerung.
- Setzt den Zugang zu aufrechten Mikroskopen mit Umweltkontrolle und Perfusionsfähigkeit voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Parafilm-Dicke und der Versiegelungsparameter für eine Kammern-zu-Kammer-Konsistenz.
- Kann bei der Anpassung an verschiedene Zelltypen eine Optimierung der Oberflächenbeschichtung und der Aktinpolymerisationsbedingungen notwendig machen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche Scherspannungseffekte auf Zellen während längerer Perfusionszeiten, wie im Protokoll beschrieben.
