Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie
November 8th, 2006
Okay, was ich heute tun möchte, ist, Ihnen zu zeigen, wie man eine Strömungskammer konstruiert, eine Fusionskammer für die Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop. Was ich dann mache, ist, dass ich mit Film zwei Räume erschaffe. Was ich also mache, ist, dass ich den Para-Film nehme und ihn in kleine Streifen schneide.
Als nächstes werde ich im Grunde die Kanäle für die Wände bilden und sie mit gekippter Luft trocknen. Ich habe den Deckzettel auf den Para gelegt, Und hier ist das Fertige. Dann erhitze ich es auf einem Heizblock, um den Parameter zu schmelzen und im Grunde eine Versiegelung zu erzeugen.
Das ist also das Deckglas hier, und dann auf dem Deckglas befinden sich zwei Schichten Phim, wie Sie hier sehen. Und dann gibt es dann wieder einen, es ist ein 22 mal zwei Mil Meter großer Deckzettel. Dieser hier, den ich gegen den Param drückte, um das Siegel fallen zu lassen.
Okay, also die Flüssigkeit geht hier in eine Richtung rein und ich kann sie hier mit einem Filterpapier in diese Richtung aussaugen. Und ich zeige Ihnen gleich, wie das geht. Was ich also gerne mache, ist, dass ich es gerne in eine befeuchtete Kammer lege, was sehr einfach ist.
Nehmen Sie zwei Arten von erhöhten Streifen und legen Sie einen Papierfilter darunter. Und um es so laut zu halten, wie ich, lege ich die Abdeckung und den Deckslip auf die Durchflusskammer. Die Art und Weise, wie Sie eine Lösung in die Kammer einführen, besteht darin, dass Sie einfach die Pipettenspitze an den Eingang der Kammer setzen und einfach teilen.
Jetzt inkubiere ich die Kammer bei geschlossenem Deckel für 10 Minuten. Was ich normalerweise mache, um die Flüssigkeit von der anderen Seite herauszusaugen, ist, sie zu verwenden, ein Filterpapier zu holen und sie in dünne Streifen zu schneiden, wie dieser. Und ich nehme einen dieser dünnen Streifen und trage gleichzeitig die Lösung in den Eingang auf, während ich das Filterpapier an den Ausgang lege, um den Austausch, die Lösung, zu saugen.
Sie werden also sehen, wie die Flüssigkeit durch die Lösung fließt. Und dann warte ich fünf Minuten auf den Mid Close. Jetzt bin ich bereit zu tun, das Aktin und das Aktin, ich muss tatsächlich polymerisieren, ich polymerisiere in der Durchflusskammer und es ist genau das gleiche Verfahren vorher.
Denn auf diese Weise, und dann, jetzt, wo die Wirkung polymerisiert ist, wasche ich all die nicht überschüssige, nicht polymerisierte Wirkung mit einem großen Volumen nur Puffer aus. Hier habe ich also etwa hundert Mikroliter und es sind ein paar Reaktionskammervolumen Puffer. Wenn das Filterpapier gesättigt ist, muss ich die Richtung ändern. Okay?
Und so bin ich bereit, damit Bildgebung zu machen. Also Perfusionskammer mit daran befestigtem Aktin. Jetzt nehme ich den Objektträger, montiere ihn unter dem Mikroskop, und da ich mit einem Ölobjektiv bilde, werde ich etwas Immersionsöl auf die Oberseite der Abdeckung auftragen, Gras berühren, wie z.B. die Lösung oder das Protein oder irgendetwas über die Wirkung im Inneren beurteilen.
Was ich also mache, ist, dass ich die Lösungsseite austauschen kann, während ich das Zeitraffer-Imaging mache. Schlechthin.
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Übersicht
Dieser Artikel demonstriert die Konstruktion einer Flusskammer und Fusionskammer für die Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop. Der Prozess beinhaltet die Erstellung von Kanälen mit Parafilm und deren Versiegelung durch Hitze.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
Hintergrund
- Flusskammern sind für verschiedene Bildgebungstechniken unerlässlich.
- Die Konstruktion einer Fusionskammer ermöglicht erweiterte Bildgebungsmöglichkeiten.
- Parafilm wird häufig in Laborumgebungen zum Erstellen von Versiegelungen verwendet.
- Das Verständnis des Konstruktionsprozesses ist für Forscher auf diesem Gebiet entscheidend.
Zweck der Studie
- Um eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Bau einer Flusskammer zu bieten.
- Um den Einsatz von Parafilm beim Erstellen von Bildgebungskammern zu veranschaulichen.
- Um den Zugang zu Bildgebungstechniken für Forscher zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Parafilm in Streifen schneiden, um Kanäle zu bilden.
- Die Streifen mit schräger Luft trocknen.
- Ein Deckglas auf das Parafilm legen.
- Die Baugruppe auf einem Heizblock erhitzen, um eine Versiegelung zu erzeugen.
Hauptergebnisse
- Eine funktionsfähige Flusskammer wurde erfolgreich konstruiert.
- Der Versiegelungsprozess war effektiv bei der Schaffung einer stabilen Umgebung für die Bildgebung.
- Die demonstrierte Methode ist für den Laborgebrauch reproduzierbar.
- Forscher können diese Technik für verschiedene Bildgebungsanwendungen nutzen.
Schlussfolgerungen
- Die Konstruktion von Fluss- und Fusionskammern ist unkompliziert.
- Diese Methode kann fortgeschrittene Bildgebungsstudien erleichtern.
- Der Zugang zu solchen Techniken kann Forschungsergebnisse verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
