Name: Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie die Ex-vivo-Live-Bildgebung mit Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen im adulten Mäuse-Schneidezahn. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse dynamischer Zellverhaltensweisen.

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Wir danken dem UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory und dem Leica Microsystems Center of Excellence am California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) für die Bereitstellung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. AS wurde durch ISF 604-21 der Israel Science Foundation unterstützt. JH wurde von R03DE030205 und R01DE030471 des NIH/NIDCR unterstützt. AS und JH wurden auch durch Zuschüsse 2021007 der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF) unterstützt.

Alle Mäuse wurden in pathogenfreien Tiereinrichtungen an der University of California Los Angeles (UCLA) oder der Hebrew University of Jerusalem (HUJI) gehalten. Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den Vorschriften und Protokollen durchgeführt, die vom jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden (ARC-2019-013; UCLA) oder (MD-23-17184-3; HUJI). Ein allgemeiner Ablauf der Versuchsschritte ist in Abbildung 2A dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Instrumenten, Reagenzien und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Herstellung von Lösungen und Gelen
<ol><li>Präpariermedium: Frisches DMEM/F12 mit 0,5 % Glukose zubereiten und bei 37 °C warm halten, bis es in Schritt 2.4 benötigt wird. HINWEIS: Wir verwenden DMEM/F12 ohne Phenolrot, um die Autofluoreszenz während der Live-Bildgebung zu reduzieren.</li>
	<li>1x Nährmedium: Frisches Medium mit 50 % DMEM/F12, 50 % Rattenserum, 1x Glutaminersatz, 1x MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Glukose, 0,1 mg/ml L-Ascorbinsäure und 0,5 % Penicillin-Streptomycin herstellen. Halten Sie es bei 37 °C warm, bis Sie es in Schritt 5.5 benötigen. Dieses Medium wird für die Kultivierung von Schneidezahn-Explantaten während der Live-Bildgebung verwendet. HINWEIS: Das Rattenserum sollte von hoher Qualität sein und speziell für die Kultivierung des gesamten Gewebes durch Forscher oder aus einer kommerziellen Quelle vorbereitet werden. Insbesondere muss das Blut zentrifugiert werden (für 5 min bei 1.200 × g bei Raumtemperatur), bevor sich eine Gerinnung bildet. Nach der Zentrifugation sollte das entstandene Fibringerinnsel gequetscht und verworfenwerden 33.</li>
	<li>Kulturgel: Das Gel dient der Immobilisierung von Proben während der Bildgebung und wird frisch zubereitet.<ol><li>Stellen Sie 2% Gel in DMEM/F12 her, indem Sie 200 mg Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 10 ml DMEM/F12 in einer Mikrowelle auflösen. Bewahren Sie das 2%ige Gel bei 37 °C auf.</li>
		<li>Stellen Sie 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) her, indem Sie 50% Rattenserum, 1x Glutaminersatz, 1x MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Glukose, 0,1 mg/ml L-Ascorbinsäure und 0,5% Penicillin-Streptomycin mischen. Das 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) auf 37 °C erwärmen.</li>
		<li>Stellen Sie 1 % Kulturgel her, indem Sie gleiche Mengen von 2 % Gel und 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) mischen. Das 1%ige Kulturgel wird bei 37 °C aufbewahrt, bis es in Schritt 5.1 benötigt wird. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen vor dem Mischen warm sind, um ein Gelieren zu vermeiden. Wir fanden heraus, dass 1%iges Gel für die Kultivierung des Schneidezahns der erwachsenen Maus geeignet ist. Der Gelprozentsatz sollte empirisch bestimmt werden, wenn andere Gewebe kultiviert werden sollen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Entnahme der adulten Maus-Mandibeln
<ol><li>Euthanasieren Sie Mäuse im gewünschten Alter mit Standardverfahren, die von der IACUC genehmigt wurden. HINWEIS: Hier verwenden wir eine CO2 -Erstickung mit anschließender Zervixluxation. Die Vorschriften für die Euthanasie von Tieren können in verschiedenen Regionen unterschiedlich sein. Forscher sollten vor der Durchführung von Experimenten die erforderliche institutionelle Genehmigung einholen und die Einhaltung der lokalen Tierpflegevorschriften sicherstellen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Maus mit 70%igem Ethanol.</li>
	<li>Enthaupte die Maus und ziehe den linken und rechten Unterkiefer heraus.<ol><li>Lege die Maus auf den Bauch und schneide dann mit einer #9 einschneidigen Industrierasierklinge in den Halsbereich und trenne den Mauskopf vom Rest des Körpers. HINWEIS: Wenn auch Gewebe aus dem Rachen oder der Halsregion entnommen werden soll, sollte keine Enthauptung durchgeführt werden, und man kann direkt mit Schritt 2.3.2 fortfahren.</li>
		<li>Drehen Sie die Maus so, dass die Bauchseite nach oben zeigt und die Mandibeln leicht zugänglich sind.</li>
		<li>Befestigen Sie den Kopf des Tieres, indem Sie ihn sanft zwischen Daumen und Zeigefinger halten.</li>
		<li>Verwende die Rasierklinge, um einen mittleren sagittalen Schnitt zu machen, der über die Haut des Unterkiefers von der Unterlippe in Richtung Dekolleté schneidet. HINWEIS: Eine chirurgische Klinge #15 kann auch verwendet werden, um den Schnitt und die anschließenden Dissektionen vorzunehmen (Schritte 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Während der Schnitt gemacht wird, spreizen Sie die geschnittene Haut mit Daumen und Zeigefinger, um die darunter liegenden Muskeln und den Kieferknochen freizulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die Rasierklinge, um die Kaumuskeln auf der bukkalen Seite des Unterkiefers zu durchtrennen, so dass die Außenseite der linken und rechten Hemimandible nun frei von Muskelansätzen ist.</li>
		<li>Durchtrennen Sie die mylohyoiden Muskeln entlang der Innenseite des Unterkiefers, um dort Muskelansätze zu entfernen.</li>
		<li>Machen Sie einen weiteren Schnitt an der Unterkiefersymphyse, die die beiden Hemimandiblen verbindet. Nach dem Durchtrennen wird der Unterkiefer in die linke und rechte Hälfte geteilt.</li>
		<li>Klemmen Sie die Rasierklinge zwischen den Unterkieferkondylus und das temporale Unterkiefergelenk und sezieren Sie vorsichtig das Hemimandible vom Rest des Kopfes. HINWEIS: Wir fanden es hilfreich, während des Schneidens gleichzeitig sanft am Schneidezahn zu ziehen. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Unterkiefer nicht bricht und das darin befindliche Weichgewebe nicht beschädigt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Die präparierten Mandibeln werden sofort mit dem vorgewärmten Dissektionsmedium in eine Petrischale überführt (Schritt 1.1) und das verbleibende Muskelgewebe mit einer chirurgischen Klinge #15 entfernt. HINWEIS: Das Aufbewahren von Proben in kalten Medien verlangsamt die Zellaktivitäten, was zu einer verzögerten oder sogar fehlgeschlagenen Wiederherstellung bestimmter Zellaktivitäten, wie z. B. Proliferation oder Zellbewegung, während der Live-Bildgebung führt.</li>
</ol>3. Isolierung der gesamten Mausschneidezähne
HINWEIS: Die weitere Isolierung des Schneidezahns erfolgt unter einem Hellfeld-Dissektionsmikroskop.
<ol><li>Identifizieren Sie visuell den ovalen Bereich des Unterkiefers, der die Schneidezahnpfanne bedeckt und den apikalen Teil des Schneidezahns beherbergt.</li>
	<li>Positionieren Sie den Unterkiefer so, dass die innere (linguale) Oberfläche nach oben zeigt.</li>
	<li>Während Sie den Unterkiefer mit einer gezackten Pinzette an Ort und Stelle halten, erzeugen Sie ein Fenster im ovalen Bereich, indem Sie den darüber liegenden Membranknochen mit einer chirurgischen Klinge #15 in einer Richtung abrasieren, die vom Kondylus zu den Backenzähnen führt. Dadurch wird das Weichgewebe des apikalen Schneidezahns auf der Innenfläche freigelegt.</li>
	<li>Drehen Sie den Unterkiefer um, so dass die äußere (bukkale) Oberfläche nach oben zeigt.</li>
	<li>Erzeugen Sie ein Fenster im ovalen Bereich des äußeren Unterkiefers, wie in Schritt 3.3 beschrieben, und entfernen Sie mit der Spitze des Skalpells alle verbliebenen Knochenfragmente am Rand. Achten Sie darauf, dass das apikale Ende des Zahns von beiden Seiten sichtbar ist. HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßigen Druck beim Rasieren der Knochen, um Schäden am darunter liegenden Weichgewebe zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie systematisch die Knochen um den Schneidezahn herum weg, um den gesamten Zahn zu isolieren.<ol><li>Machen Sie einen sauberen Schnitt an einer Ebene, die unmittelbar an den apikalen Schneidezahn angrenzt, um zuerst den Kondylenfortsatz zu entfernen. HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in den Schneidezahn zu schneiden.</li>
		<li>Machen Sie einen zweiten Schnitt direkt hinter dem 3. Backenzahn, aber dorsal zum Schneidezahn, ohne den Zahn zu beschädigen. Dadurch wird der Knochen entfernt, der den Coronoidfortsatz enthält.</li>
		<li>Seriell von der Spitze des Winkelfortsatzes in Richtung Schneidezahn schneiden, um den ventralen Unterkiefer schrittweise zu entfernen. HINWEIS: Das Zahnepithel und das zugehörige parodontale Gewebe sind oft am Knochen kleben und leicht abgerissen, wenn ein großer Teil des ventralen Knochens auf einmal durchtrennt wird. Um den Knochen vom Schneidezahnweichgewebe zu trennen, kann man das Skalpell (oder eine scharfe, nicht gezackte Pinzette) zwischen die beiden Gewebe am apikalen Ende des Schneidezahns einführen und das Instrument vorsichtig nach vorne schieben.</li>
		<li>Schneiden Sie den Alveolarknochen mit den Backenzähnen und alle verbliebenen Knochen, die noch am Schneidezahn befestigt sind, weg.</li>
		<li>Der gesamte Schneidezahn ist nun isoliert. Den vollständig präparierten Schneidezahn in eine Schale mit sauberem, warmem Seziermedium überführen (Schritt 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6, um bei Bedarf weitere Schneidezähne zu isolieren. HINWEIS: Die oberen/oberen Schneidezähne der Maus enthalten auch adulte Stammzellen und können zur Untersuchung der Zahnregeneration verwendet werden34. Zahnforscher konzentrieren sich in der Regel auf die unteren Schneidezähne, da sie leichter zugänglich sind und leichter präpariert werden können als die oberen Schneidezähne. Die Unterschiede zwischen den Vorläuferzellen des Unterkiefers und des oberen Schneidezahns müssen noch ermittelt werden.</li>
</ol>4. Entfernung von parodontalem Gewebe zur Freilegung der Schneidezahn-Epithelschlinge
<ol><li>Während der gesamte Schneidezahn auf der lingualen Seite liegt und während Sie den Zahn mit einer gezackten Pinzette an Ort und Stelle halten, beginnen Sie mit einer feinen Pinzette #5 mit dem Anziehen des Parodontalgewebes, das den apikalen Schneidezahn und die Halsschlingenregion bedeckt.</li>
	<li>Ziehen Sie das parodontale Gewebe vorsichtig von der apikalen Knospe ab, so dass die laterale Seite der Zervixschlinge (oder andere interessante Regionen) unter dem Endoskop sichtbar wird. HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass das Zahnepithel nicht beschädigt oder vom Mesenchym abgelöst wird. Wenn der Schneidezahn Fluoreszenzsignale in der interessierenden Region aufweist und ein Fluoreszenzdissektionsmikroskop zur Verfügung steht, können Fluoreszenzsignale verwendet werden, um zwischen Gewebetypen zu unterscheiden und die Dissektion zu unterstützen. Es ist wichtig, die Abschnitte 2-4 effizient durchzuführen, damit die Proben schnell in die Nährmedien überführt und durch die Explantat-Kultivierung angemessen gepflegt werden können (siehe unten).</li>
</ol>5. Gewebeeinbettung für die Explantatkultur
<ol><li>Geben Sie 500 μl warmes, nicht verfestigtes Kulturgel in eine Vertiefung in einer 24-Well-Platte und übertragen Sie die präparierten ganzen Schneidezähne schnell in die Vertiefung. Schwenken Sie die Platte einige Male, um die Schneidezähne zu spülen.</li>
	<li>Geben Sie 400 μl warmes, nicht verfestigtes Kulturgel in eine Kulturschale und geben Sie die gespülten Schneidezähne in die Schale. HINWEIS: Wir verwenden eine handelsübliche Kulturschale, die mit dem Perfusionsaufbau kompatibel ist. Siehe Schritt 6.4 für alternative Optionen.</li>
	<li>Richten Sie den Schneidezahn so aus, dass er die zervikale Schleifenregion (oder andere interessierende Regionen) in der Mitte der Schale positioniert (Abbildung 2A,B) und passen Sie die Neigung des apikalen Schneidezahns für die gewünschte Abbildungsebene an. HINWEIS: Die Gewebeorientierung sollte vor der vollständigen Gelierung schnell erfolgen.</li>
	<li>Nachdem das Gel ausgehärtet ist, entfernen Sie mit einer feinen Pinzette das Gel auf der gewünschten Region, damit sie nicht vom Gel bedeckt ist.</li>
	<li>Fügen Sie eine ausreichende Menge warmes Nährmedium hinzu, indem Sie es langsam gegen den Rand der Schale pipettieren, um die Probe nur zu bedecken (~150 μl).</li>
	<li>Bringen Sie die Explantatkultur in einen 37 °C warmen Zellkultur-Inkubator, damit sich das Gewebe 1 Stunde lang absetzen und an den Kulturzustand angepasst werden kann.</li>
</ol>6. Zeitraffer-Mikroskopie von Schneidezahn-Explantaten
HINWEIS: In diesem Experiment haben wir ein aufrechtes Mikroskop verwendet, das mit einem 25-fachen Wassertauchobjektiv ausgestattet ist, das eine numerische Apertur von 1 hat. Im Allgemeinen eignet sich ein Wassertauchobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur am besten für die Bildgebung von tiefem Gewebe.
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop und den Zwei-Photonen-Laser ein.</li>
	<li>Befestigen Sie die Kulturschale am Bühnenadapter und montieren Sie den Perfusionsadapterring darauf (Abbildung 2C).</li>
	<li>Schließen Sie den Tischadapter an einen Temperaturregler an, der die Kultur auf 37 °C hält.</li>
	<li>Verbinden Sie den Einlass und den Auslass des Adapterrings mit einer Mikroperfusionspumpe und beginnen Sie mit der Perfusion des Nährmediums, wobei die Perfusionsgeschwindigkeit an der Pumpe auf 20 eingestellt ist. Dadurch wird ein langsamer Fluss (~5 ml/h) des Nährmediums über die Proben erzeugt (Abbildung 2C). HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten über das System, um das Gewebe in einer stabil kontrollierten Umgebung zu halten. Es können auch andere Systeme verwendet werden. Es kann auch eine Kombination aus einer 37 °C-Heizplatte und einer selbstgebauten Perfusionskulturschale (Ergänzungsbild S1) mit einem Ein- und Auslass verwendet werden, die mit Spritzenpumpen verbunden sind.</li>
	<li>Platzieren Sie einen atmosphärischen Barrierering (ACBR) auf dem Adapterring und senken Sie das Objektiv durch den ACBR ab, um gerade noch Kontakt mit dem Nährmedium herzustellen (Abbildung 2D).</li>
	<li>Stellen Sie die Laserwellenlänge auf 920 nm ein, um sowohl GFP- als auch rote Fluoreszenzsignale (z. B. tdTomato) sichtbar zu machen.</li>
	<li>Lokalisieren Sie Proben durch Okulare und dann über die Software des Mikroskops.</li>
	<li>Richten Sie mit der Software Z-Stapel, Bildgebung mit mehreren Positionen und Zeitintervalle ein. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie eine z-Schrittweite von 4 μm und ein Zeitintervall von 5 Minuten für 14 Stunden. HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass ein Zeitintervall von mehr als 5 Minuten oft nicht ausreicht, um reibungslose Zellbewegungen und -teilungen zu erfassen.</li>
	<li>Initiieren Sie die Zeitraffer-Aufnahme. HINWEIS: Die Probenposition kann sich während der ersten Stunde verschieben und weitere Anpassungen können erforderlich sein.</li>
	<li>Speichern Sie Dateien für die nachgelagerte Datenverarbeitung und Analysen.</li>
</ol>

Live-Tracking von Zahnzellen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Bildgebung von Live-Gewebe ist eine wichtige Technik, die es uns ermöglicht, die dynamischen Prozesse und Verhaltensweisen von Zellen zu untersuchen, wenn sie in ihrer Nischenumgebung gehalten werden41. Im Idealfall wird die Live-Bildgebung in vivo mit hoher raumzeitlicher Auflösung durchgeführt. Die In-vivo-Bildgebung von Säugetierorganen kann jedoch aufgrund der Unzugänglichkeit des Gewebes, der optischen Undurchsichtigkeit und der Schwierigkeit, das Tier oder das Organ übe...

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Schneidezahn der Maus zu einer unschätzbaren Plattform für die Erforschung der Prinzipien der Regulation adulter Stammzellen und der Zahnregeneration entwickelt 1,2. Der Schneidezahn der Maus wächst kontinuierlich und erneuert sich während des gesamten Lebens des Tieres. Dies geschieht durch die Erhaltung sowohl epithelialer als auch mesenchymaler Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelltypen des Zahns differenzieren können 1,2. Während aus dentalen Epithelstammzellen Ameloblasten entstehen, die die Schmelzmatrix absondern, entstehen aus dentalen mesenchymalen Stammzellen Odontoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten, die Dentin, Zement bzw. Parodontalband bilden 3,4,5,6. Diese konstante Zufuhr neuer Zellen hält die Gewebehomöostase aufrecht und ermöglicht den Ersatz alter Zellen, die durch Kauverschleiß oder Verletzungen verloren gehen 7,8. Die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Erhalt und die Differenzierung von dentalen Stammzellen regulieren, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Zahnregeneration, einem Bereich von wachsendem Interesse.
Anatomisch gesehen ist ein großer Teil des Schneidezahns der erwachsenen Maus vom Kieferknochen umhüllt. Während die Schneidekante des Zahns freiliegt, passt das apikale Ende des Schneidezahns in eine Alveole und ist über parodontale Bänder und Bindegewebe fest mit dem umgebenden Knochen verbunden (Abbildung 1A,B). Das apikale Ende des Schneidezahns ist auch die Wachstumsregion des Zahns und erhält Zahnstamm- und Vorläuferzellen sowohl in der Epithelschicht als auch in der mesenchymalen Pulpa 9,10,11,12,13. Insbesondere werden dentale Epithelstammzellen am knolligen Ende des Epithels gehalten, der sogenannten apikalen Knospe, die auch als labiale zervikale Schleife bezeichnet wird (Abbildung 1C). Ähnlich wie im Darmepithel und in der Epidermis wird die Epithelerneuerung im Schneidezahn in erster Linie durch aktiv zyklische Stammzellen und ihre hochproliferativen Zwischennachkommen, die sogenannten transitverstärkenden Zellen 14,15,16,17, unterstützt, die sich beide im inneren Teil der Zervixschlinge befinden. Ob das Schneideepithel während der Regeneration ruhende Stammzellen enthält und verwertet, muss jedoch noch geklärt werden. Im Gegensatz dazu wurden sowohl aktive als auch ruhende mesenchymale Stammzellen in der apikalen Pulpa identifiziert, und die ruhenden Stammzellen fungieren als Reservepopulation, die während der Verletzungsreparatur aktiviert wird13,18.
Viele der Entdeckungen über die Biologie der Erneuerung und Regeneration der Schneidezähne von Mäusen sind das Ergebnis histologischer Untersuchungen, bei denen Proben an bestimmten zeitlichen Punkten entnommen, fixiert, verarbeitet und dann entlang einer bestimmten Ebene in mikrometerdünne Scheiben geschnitten werden. Durch die detaillierte Analyse histologischer Schnitte aus verschiedenen Mausmodellen, die eine Rückverfolgung der Abstammungslinie oder genetische Störungen ermöglichen, haben die Wissenschaftler die Zelllinien verschiedener Vorläuferpopulationen sowie die genetischen und Signalwege identifiziert, die die Homöostase der Schneidezähne und die Reparatur von Verletzungen steuern 19,20,21. Die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder von nicht-vitalen Zellen in Schnitten können jedoch nicht das gesamte Spektrum zellulärer Verhaltensweisen und räumlicher Organisationen in lebendem Gewebe erfassen, wie z. B. Zellformveränderungen, Bewegungen und zelluläre Kinetik. Das Erkennen und Messen dieser schnellen zellulären Veränderungen, die in einer Zeitskala auftreten, die durch Gewebeschnitte nicht aufgelöst werden kann, erfordert eine andere Strategie. Darüber hinaus ist die Erfassung solcher Informationen auch entscheidend, um zu verstehen, wie Zahnzellen miteinander interagieren, auf verschiedene Signalreize reagieren und sich selbst organisieren, um Gewebestrukturen und -funktionen aufrechtzuerhalten.
Das Aufkommen der vierdimensionalen (4D) Tiefengewebebildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie22, einer Technologie, die drei räumliche Dimensionen mit zeitlicher Auflösung integriert, überwindet die inhärenten Einschränkungen der histologischen Analyse, indem sie eine raumzeitliche Untersuchung von kultivierten Gewebeexplantaten, Organoiden oder sogar Geweben in situ ermöglicht 23,24,25,26 . Zum Beispiel hat die 4D-Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zahnepithels die raumzeitlichen Muster von Zellteilungen und -migrationen enthüllt, die das Gewebewachstum, die Bildung von Signalzentren und die Morphogenese des dentalen Epithels koordinieren 27,28,29,30,31,32. Im Schneidezahn der erwachsenen Maus wurde die 4D-Bildgebung kürzlich angepasst, um das zelluläre Verhalten während der Reparatur von Zahnepithelverletzungen zu untersuchen. Live-Bildgebung zeigte, dass Stratum-Intermedium-Zellen in der suprabasalen Schicht direkt in Ameloblasten in der Basalschicht umgewandelt werden können, um das geschädigte Epithel zu regenerieren, was das traditionelle Paradigma der Reparatur von Epithelverletzungen in Frage stellt15.
Hier beschreiben wir die Dissektion, Kultivierung und Bildgebung des adulten Mausschneidezahns, wobei wir uns auf Epithelzellen in der labialen Zervixschleife konzentrieren (Abbildung 1). Diese Technik bewahrt die Vitalität der Zahnzellen für mehr als 12 Stunden und ermöglicht das Live-Tracking von fluoreszenzmarkierten Zellen mit Einzelzellauflösung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegungen und -migrationen sowie dynamische Veränderungen der Zellform und Teilungsorientierung unter normalen Kulturbedingungen oder in Reaktionen auf genetische, physikalische und chemische Störungen.

<table><tbody><tr><td>24 Well, flacher Boden Gewebekulturplatte</td><td>Olympus plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25x HC IRAPO motCORR Wassertauchobjektiv</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure (Vitamin C)</td><td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Delta T System&nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>Inklusive Temperaturregelung, Kulturschalen und Perfusionseinrichtung</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop - LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>Basalmedien ohne Phenolrot</td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge Feder (#15)</td><td>Feder</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Glutaminersatz</td></tr><tr><td>Leica SP8-DIVE ausgestattet mit einem 25X HC IRAPO motCORR Wassertauchobjektiv&nbsp;</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>niedrigschmelzende Agarose</td><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Gen Klon</td><td>32-107G</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Valley Biomedical</td><td>AS3061SC</td><td>Verarbeitet für Live-Imaging</td></tr><tr><td>Rasierklinge #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>F.S.T</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>gezackte Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>F.S.T</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von ex-vivo-live-bildgebung zur untersuchung von zellteilungen und -bewegungen während der zahnerneuerung von mäusen

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

Der kontinuierlich wachsende Maus-Schneidezahn entwickelt sich zu einem sehr handhabbaren Modellsystem, um die Regulation adulter epithelialer und mesenchymaler Stammzellen und die Zahnregeneration zu untersuchen. Diese Vorläuferpopulationen teilen, bewegen und differenzieren sich aktiv, um die Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten und verlorene Zellen regenerieren. Herkömmliche Analysen mit fixierten Gewebeschnitten konnten jedoch die dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen nicht erfassen, was unsere Fähigkeit, ihre Regulationsmechanismen zu untersuchen, einschränkte. In dieser Arbeit wird ein Protokoll beschrieben, um ganze Mausschneidezähne in einem Explantatkultursystem zu erhalten und dentale Epithelzellen mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffermikroskopie live zu verfolgen. Diese Technik ergänzt unseren bestehenden Werkzeugkasten für die zahnmedizinische Forschung und ermöglicht es Forschern, raumzeitliche Informationen über das Verhalten und die Organisation von Zellen in einem lebenden Gewebe zu gewinnen. Wir gehen davon aus, dass diese Methodik den Forschern helfen wird, die Mechanismen weiter zu erforschen, die die dynamischen zellulären Prozesse steuern, die sowohl während der Zahnerneuerung als auch der Zahnregeneration stattfinden.

Die apikale Region des adulten Mausschneidezahns ist vom Unterkiefer umhüllt (Abbildung 1) und daher nicht direkt zugänglich, um die Vorläuferzellen, die sich in der Wachstumsregion befinden, zu visualisieren und live zu verfolgen. Daher haben wir eine Methode entwickelt, um den gesamten Schneidezahn aus dem Kieferknochen zu extrahieren und in einem Explantatkultursystem für die Zwei-Photonen-Zeitraffermikroskopie zu erhalten (Abbildung 2). Hier beschreiben wir ...

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Um die korrekte Zellorganisation während der Organerneuerung aufrechtzuerhalten, bewegt sich das Gewebe, das sich den Zellen nähert, und teilt bestimmte Orientierungen und Muster. Daher ist es wichtig, die Regeln und Vorschriften dieser dynamischen zellulären Ereignisse zu verstehen. Der Schneidezahn der Maus ist ein aufstrebendes Modell für die Forschung an adulten Stammzellen, und das System verfügt über viele genetische Werkzeuge, um Genfunktionen zu untersuchen und Zellen für die Rückverfolgung der Abstammungslinie zu markieren.Die meisten bisherigen Studien verwenden erwachsene Zahnproben, die zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und festgelegt wurden, und dies hindert uns daran, das Verhalten von lebenden Zellen zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Verfolgung des Lebensstils des erwachsenen Mausschneidezahns, und diese Technik wird zukünftige Studien ermöglichen, die darauf abzielen, zu verstehen, wie dynamisches Zellverhalten zur Erneuerung und Reparatur von Zahngewebe beiträgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen und Methoden zur 3D-Visualisierung der Kollagenfasern und Blutgefäße von Parodontalbändern ohne Schnitt.

3D-Bildgebung von PDL-Kollagenfasern während kieferorthopädischer Zahnbewegungen im Unterkiefermine modell

Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.

Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

Die immunfluoreszierende Bildgebung ist durch die Fähigkeit eingeschränkt, komplexe, zeitabhängige biologische Prozesse in nur einer einzigen Momentaufnahme zu beobachten. Diese Studie skizziert einen Live-Imaging-Ansatz, der an präzisionsgeschnittenen Unterkieferdrüsenschnitten von Mäusen durchgeführt wird. Dieser Ansatz ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Zell-Zell-Interaktionen während der Homöostase und der Regenerations- und Reparaturprozesse.

Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in der Speicheldrüse mittels ex vivo Lebendzell-Bildgebung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultivierung von Rachenbögen, um die Biologie von Herz- und Muskelvorläuferzellen und ihrer Mikroumgebung zu untersuchen.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Durch die Kombination von Zelltransplantation, Zytoskelettmarkierung und Funktionsverlust/-gewinn beschreibt dieses Protokoll, wie die migrierende Zebrafisch-prospektive prächordale Platte verwendet werden kann, um die Funktion eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Lernen Sie die Ex-vivo-Live-Bildgebung mit Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen im adulten Mäuse-Schneidezahn. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse dynamischer Zellverhaltensweisen.

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

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