Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung
November 10th, 2023
Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.
Eine häufige Herausforderung bei der Probenvorbereitung in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche, wodurch die Partikel bevorzugte Orientierungen annehmen und denaturieren. Stattdessen ist es besser, die Partikel auf der Gitteroberfläche ruhen zu lassen, die dünne Schichtträger wie Graphen fördern. Eine weitere Herausforderung ist die Anforderung an relativ hohe Probenkonzentrationen, die auch durch Graphen adressiert werden könnten.
Graphenbeschichtete Gitter bieten zahlreiche Vorteile für die Bestimmung der KryoEM-Struktur, waren aber in der Vergangenheit schwierig im eigenen Haus reproduzierbar herzustellen und in der kommerziellen Anschaffung unerschwinglich. Dieses Protokoll ermöglicht die robuste Abscheidung von einschichtigem Graphen und senkt damit die Hürde für Benutzer, diese Gitter in ihrer Forschung zu verwenden. Graphen ist aufgrund seiner Materialeigenschaften einzigartig.
Es handelt sich um eine Monolage aus Kohlenstoff und weist daher ein minimales Hintergrundrauschen auf. Andere KryoEM-Gitterträger, wie z. B. eine dünne Schicht aus amorphem Kohlenstoff oder Graphenoxidflocken, können nicht als einzelne Monoschicht aufgetragen werden und tragen mehr Hintergrundsignal bei. Nachdem wir nun ein robustes Protokoll für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter etabliert haben, möchten wir die Funktionalisierung von Graphen-beschichteten Gittern mit Affinitätsgriffen für die On-Grid-Erfassung direkt aus Zelllysaten verfolgen.
Dies könnte einen weiteren Engpass bei der Vorbereitung von KryoEM-Proben beheben.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Beschichtung von kryogenen Elektronenmikroskopie (cryoEM)-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen vor. Die Verwendung von Graphen erhöht die Partikeldichte, minimiert Interaktionen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche und verbessert die Partikelorientierungsverteilung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Kryogene Elektronenmikroskopie
- Materialwissenschaft
- Probenpräparationstechniken
Hintergrund
- Die Partikellokalisation an der Luft-Wasser-Grenzfläche ist eine häufige Herausforderung in der Cryo-EM.
- Bevorzugte Orientierungen können zur Denaturierung von Partikeln führen.
- Graphen-Träger können Partikeln helfen, auf der Gitteroberfläche zu ruhen.
- Historisch waren graphenbeschichtete Gitter schwierig und kostspielig herzustellen.
Zweck der Studie
- Ein robustes Protokoll für die Abscheidung von Monolayer-Graphen auf cryoEM-Gittern bereitzustellen.
- Die Hürden für Forscher zu senken, graphenbeschichtete Gitter zu nutzen.
- Die Vorteile der Cryo-EM-Strukturbestimmung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Entwicklung eines Protokolls für die Graphenbeschichtung.
- Evaluierung der Partikeldichte und -orientierung.
- Vergleich von graphenbeschichteten Gittern mit herkömmlichen Gittern.
- Bewertung der Reproduzierbarkeit in der Gitterherstellung.
Hauptergebnisse
- Graphenbeschichtete Gitter verbessern die Partikellokalisation erheblich.
- Die erhöhte Partikeldichte ermöglicht eine bessere Strukturbestimmung.
- Das robuste Protokoll erleichtert die Herstellung von Graphengittern im eigenen Labor.
- Niedrigere Kosten und verbesserte Zugänglichkeit für Forscher.
Schlussfolgerungen
- Die Verwendung von Graphen in Cryo-EM-Gittern adressiert wichtige Herausforderungen in der Probenpräparation.
- Dieses Protokoll ermöglicht eine breitere Anwendung von graphenbeschichteten Gittern in der Forschung.
- Die einzigartigen Eigenschaften von Graphen verbessern die Cryo-EM-Fähigkeiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
