Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung
10. November 2023
Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.
Eine häufige Herausforderung bei der Probenvorbereitung in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche, wodurch die Partikel bevorzugte Orientierungen annehmen und denaturieren. Stattdessen ist es besser, die Partikel auf der Gitteroberfläche ruhen zu lassen, die dünne Schichtträger wie Graphen fördern. Eine weitere Herausforderung ist die Anforderung an relativ hohe Probenkonzentrationen, die auch durch Graphen adressiert werden könnten.
Graphenbeschichtete Gitter bieten zahlreiche Vorteile für die Bestimmung der KryoEM-Struktur, waren aber in der Vergangenheit schwierig im eigenen Haus reproduzierbar herzustellen und in der kommerziellen Anschaffung unerschwinglich. Dieses Protokoll ermöglicht die robuste Abscheidung von einschichtigem Graphen und senkt damit die Hürde für Benutzer, diese Gitter in ihrer Forschung zu verwenden. Graphen ist aufgrund seiner Materialeigenschaften einzigartig.
Es handelt sich um eine Monolage aus Kohlenstoff und weist daher ein minimales Hintergrundrauschen auf. Andere KryoEM-Gitterträger, wie z. B. eine dünne Schicht aus amorphem Kohlenstoff oder Graphenoxidflocken, können nicht als einzelne Monoschicht aufgetragen werden und tragen mehr Hintergrundsignal bei. Nachdem wir nun ein robustes Protokoll für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter etabliert haben, möchten wir die Funktionalisierung von Graphen-beschichteten Gittern mit Affinitätsgriffen für die On-Grid-Erfassung direkt aus Zelllysaten verfolgen.
Dies könnte einen weiteren Engpass bei der Vorbereitung von KryoEM-Proben beheben.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Beschichtung von kryogenen Elektronenmikroskopie-(cryoEM-)Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen vorgestellt. Die Verwendung von Graphen erhöht die Partikeldichte, minimiert Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche und verbessert die Partikelorientierungsverteilung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kryogene Elektronenmikroskopie
- Materialwissenschaft
- Probenvorbereitungstechniken
Hintergrund
- Die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche ist eine häufige Herausforderung in der Kryo-EM.
- Bevorzugte Orientierungen können zur Denaturierung der Partikel führen.
- Graphenunterstützungen können dabei helfen, dass Partikel auf der Gitteroberfläche aufliegen.
- Bisher waren Graphen-beschichtete Gitter schwierig und kostspielig herzustellen.
Zweck der Studie
- Eine robuste Protokollanleitung für die Abscheidung von einlagigem Graphen auf Cryo-EM-Gittern bereitstellen.
- Die Hürden für Forscher senken, die beschichtete Gitter mit Graphen verwenden möchten.
- Die Vorteile der Strukturbestimmung mittels Kryo-EM verbessern.
Verwendete Methoden
- Entwicklung eines Protokolls für die Graphenbeschichtung.
- Beurteilung der Partikeldichte und -orientierung.
- Vergleich von graphenbeschichteten Gittern mit herkömmlichen Gittern.
- Bewertung der Reproduzierbarkeit bei der Gitterherstellung.
Hauptergebnisse
- Graphenbeschichtete Gitter verbessern die Partikellokalisierung deutlich.
- Eine höhere Partikeldichte ermöglicht eine bessere Strukturbestimmung.
- Ein robuster Protokollablauf erleichtert die in-house-Herstellung von Graphen-Gittern.
- Niedrigere Kosten und verbesserte Zugänglichkeit für Forschende.
Schlussfolgerungen
- Die Verwendung von Graphen in Kryo-EM-Gittern behebt zentrale Herausforderungen bei der Probenvorbereitung.
- Dieses Protokoll ermöglicht eine breitere Anwendung von Graphen-beschichteten Gittern in der Forschung.
- Die einzigartigen Eigenschaften von Graphen verbessern die Leistungsfähigkeit der Kryo-EM.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Engpässe bei der Probenvorbereitung in der Kryoelektronenmikroskopie (KryoEM) beschränken die Durchsatzrate und Zuverlässigkeit der Strukturbestimmung mit hoher Auflösung in frühen Entdeckungsphasen und strukturbiologischen Arbeitsabläufen. Der Einsatz von einkristallinem Graphen auf KryoEM-Rastern behebt entscheidende Herausforderungen hinsichtlich Partikellokalisierung, Orientierungsverzerrung und Anforderungen an die Probenkonzentration und wirkt sich damit direkt auf das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung und mechanistischen Untersuchungen aus. Robuste, reproduzierbare Protokolle für Graphenraster ermöglichen eine breitere Etablierung in der Industrie und unterstützen die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Portfoliovorhaben sowie eine effiziente Ressourcenallokation.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine hochpräzise strukturelle Untersuchung makromolekularer Zielstrukturen bei nahezu atomarer Auflösung.
- Verringert die Denaturierung der Probe und Orientierungsartefakte und unterstützt so die mechanistische Risikominimierung.
- Erleichtert eine zuverlässige Zielvalidierung durch Verbesserung der Partikeldichte und Bildkonsistenz.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt standardisierte, reproduzierbare Gitterträger für nachgeschaltete Kryo-EM-Arbeitsabläufe.
- Verbessert die Zuverlässigkeit von Assays, indem Hintergrundrauschen minimiert und quantitative Bildgebungsdaten verbessert werden.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung strukturell diverser Komplexe bei niedrigeren Probenkonzentrationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht strukturelle Untersuchungen krankheitsrelevanter Komplexe und unterstützt die translationale Biomarker-Abstimmung.
- Bietet Kontinuität von der strukturellen Aufklärung im Entdeckungsstadium bis zur präklinischen Validierung molekularer Mechanismen.
- Verringert das Risiko eines biologischen Versagens in späteren Stadien, indem die Qualität der strukturellen Daten sichergestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Herstellung von Einzelatomlagen-Graphenrastern ist in den Kryo-EM-Arbeitsablauf von der frühen Entdeckung bis hin zur Leitstrukturfestlegung und präklinischen Forschung integriert und unterstützt die hypothesengetriebene Strukturaufklärung sowie mechanistische Einblicke.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt eine robuste Nullhypothesenprüfung, indem genaue strukturelle Vergleiche unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare Gitter mit geringem Hintergrund für die quantitative Bildgebung und die Standardisierung von Assays.
- Analytik: Stellt hochwertige Beugungsmuster und Dichtekarten für statistische Analysen und fundierte Entscheidungen bereit.
- Translationale Forschung: Gewährleistet die Kontinuität struktureller Daten für krankheitsrelevante Zielstrukturen und Komplexe.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare und reproduzierbare Kapazität zur Herstellung von Gittern für vielfältige Forschungs- und Entwicklungsprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und verringert mechanistische Unklarheiten in strukturellen Studien.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gitterpräparation, verbessert die Reproduzierbarkeit und senkt den Probenaufwand.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitaleffizienz, indem Engpässe in der Probenvorbereitung reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung strukturell validierter Zielstrukturen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Graphen und bei der Herstellung von Cryo-EM-Rastern.
- Benötigt Zugang zu Spin-Coatern, Glühentladungsgeräten und UV-Ozon-Reinigern.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene makromolekulare Systeme oder Probentypen notwendig.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit des Materials und die Sicherstellung der Integrität der Monolage während des Transfers.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
