Name: Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit CRISPR/Cas9 eine RIPK1-Knockout-U937-Zelllinie erstellen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen und liefert wertvolle Einblicke in zelluläre Signalwege.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Angepasstes DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>Nr. A1593</td><td></td></tr><tr><td>BisBenzimid Hoechst 33342 Trihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>Nr. B2261</td><td></td></tr><tr><td>Komplett RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>Nr. R6504</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC gRNA E.coli Stamm</td><td>transOMIC</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR RIP1 gRNA E.coli Stamm</td><td>transOMIC</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>Ende-über-Ende-Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Fluoreszenzmikroskop</td><td>Lebenstechnologien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper, (H+L) HRP Konjugat</td><td>Sigma</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schüttler für Inkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Lentiviraler Verpackungsmix</td><td>Gibco</td><td>Nr. A43237</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Rot</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Necrostatin-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>Nr. P7255</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-RIP1 mAb</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE und Western-Blot-Geräte</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937 Humane Monozyten</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Assay-System für Zellproliferation</td><td>Takara</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reagenz für DNA-Transfektion</td><td>Roche Diagnostik</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>Nr. A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung einer rip1-knockout-u937-zelllinie mit dem crispr-cas9-system

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

Nach der Produktion einer konfluenten Population von RIP1-CRISPR-mutierten U937-Zellen wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die erfolgreiche Bildung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie zu bestimmen, indem der Verlust der RIP1-Proteinexpressionsniveaus bewertet wurde. Diese Bestimmung erfolgte auf der Grundlage des Vergleichsergebnisses von WT U937-Monozyten und NTC-Zellen. In Abbildung 2 wurde die Expression v...

Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf den Zelltod von Säugetieren, insbesondere auf die Untersuchung des Gleichgewichts zwischen Apoptose und Nekroptose im Zusammenhang mit Hyperglykämie. In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass die Zelltodprotein RIP1-Kinase die Genexpression während der Nekroptose moduliert. Unsere derzeitige experimentelle Herausforderung besteht darin, Immunzellen, die in Suspension wachsen, genetisch zu manipulieren, insbesondere das Gen für die RIP1-Kinase mit CRISPR-Cas9 auszuschalten.Unser Protokoll bietet zwei entscheidende Vorteile. Es verbessert die Transfektionsmethoden für Immunzellen, die in Suspension wachsen, indem es Lentiviren verwendet, und es macht die Klonierung einzelner Zellen während des Prozesses der Erstellung eines genetischen Knockouts mit CRISPR-Cas9 überflüssig. Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für die Untersuchung der Rolle der RIP1-Kinase bei der hyperglykämischen Verschiebung der Nekroptose. Zu Beginn des Quadrantenstreifens leiten Escherichia coli, die die lentivirale Vektor-RNA beherbergen, auf Luria-Bertani- oder LB-Agarplatten, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage, bis einzelne Kolonien im am stärksten verdünnten Bereich der Platte sichtbar sind. Wählen Sie nach der Inkubation mit einer sterilen Schleife eine einzelne Kolonie aus und fügen Sie sie zu fünf Millilitern LB-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Entlüften Sie die Kappe des Schlauchs und kleben Sie sie fest.Inkubieren Sie das Röhrchen acht Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 225 U/min. In der Zwischenzeit 40 Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, in vier 50-Milliliter-Röhrchen geben. Nach der Inkubation werden 40 Mikroliter der gewachsenen Kultur in jedes der vier Röhrchen überführt.Entlüften und kleben Sie die Kappen der Röhrchen ab, bevor Sie sie 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 225 U/min in einem Orbitalschüttler inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.220 x g in einem schwingenden Eimerrotor für 20 Minuten. Die Überstände in ein Abfallbecherglas umfüllen und alle vier Pellets in 10 Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit Ampicillin, mischen.Zentrifugieren Sie die kombinierten Pellets bei maximaler Drehzahl in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten, um ein einzelnes Pellet zu erhalten, und entsorgen Sie so viel Überstände wie möglich in das Abfallbecherglas. HEK293T Zellen werden in einer Konzentration von drei- bis fünfmal 10 hoch sechs Zellen in einen T25-Kolben mit DMEM gegeben. Inkubieren Sie den Kolben über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.In der Zwischenzeit wird die Transfektionsmischung unter Verwendung eines Plasmidverhältnisses von 1:1:1:1 und eines Verhältnisses von Transfektionsreagenz zu Plasmid-DNA von 3:1 mit reduziertem Serummedium hergestellt. Mischen Sie 75 Mikroliter Transfektionsreagenz, 2.500 Mikroliter reduziertes Serummedium und 25 Mikrogramm Gesamtplasmid-DNA. Lassen Sie die Mischung 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Anschließend pipettieren Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig auf die konfluenten HEK293T Zellen in dem Kolben, der das Medium enthält. Der Kolben wird vorsichtig geschwenkt, um eine ausreichende Homogenisierung der Mischung zu gewährleisten, und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach zweitägiger Inkubation wird das Medium vom Hersteller HEK293T Zellkolben in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 x g, um alle verbleibenden HEK293T Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig alle virenhaltigen Überstände, ohne das Pellet zu beschädigen, und geben Sie es in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zählen und berechnen Sie das erforderliche Volumen der U937-Zellsuspension, um ein Pellet von 2 x 10 hoch sechs Zellen zu erhalten.Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 400 x g für 10 Minuten und dekantieren den Überstand, wobei das Zellpellet im Röhrchen verbleibt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem virushaltigen Überstand und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 290 x g für 60 Minuten. Nach der Zentrifugation verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet mit dem virushaltigen Überstand im Röhrchen zu resuspendieren.Legen Sie den Schlauch für 60 Minuten auf einen Ende-über-Ende-Rotator. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 400 x g für 10 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Verhältnis von 1:1 aus dem Virus, das Überstände enthält, und vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS. Die Zellmischung wird in einen neuen T25-Gewebekulturkolben überführt und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.Nach der Inkubation werden die U937-Zellen 10 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie das Pellet mit vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und fünf Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Übertragen Sie die Zellkultur in einen T25-Kolben.Inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius und überprüfen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage auf Anzeichen von Wachstum. Die Western-Blot-Analyse bestätigte den Verlust der RIP1-Proteinexpression in RIP1-CRISPR-Mutantenzellen ohne nachweisbares Signal im Vergleich zu dem starken Signal in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen. Die Behandlung mit TCZ induzierte einen signifikanten nekrotischen Zelltod in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen, der durch die Behandlung mit Necrostatin-1 rückgängig gemacht wurde.Im Gegensatz dazu zeigten RIP1-CRISPR-Knockout-Zellen einen signifikant geringeren Zelltod im Vergleich zu Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen ohne Wirkung von Necrostatin-1s, was auf einen Verlust der RIP1-Funktion hinweist. Die Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen zeigte einen signifikanten Anstieg der mitochondrialen Superoxidproduktion in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen nach TCZ-Behandlung, die nach der Behandlung mit Necrostatin-1 reduziert wurde. RIP1-CRISPR-Knockout-Zellen zeigten eine minimale mitochondriale Superoxidproduktion ohne beobachtbare Wirkung der Necrostatin-1s-Behandlung.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.

Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer maternalen Mutante, das eine stabile zpc: cas9-Knock-in-Linie mit der Tol2-vermittelten Verabreichung von sgRNA-Expressionskassetten koppelt.

Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

Erfahren Sie, wie Sie mit CRISPR/Cas9 eine RIPK1-Knockout-U937-Zelllinie erstellen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen und liefert wertvolle Einblicke in zelluläre Signalwege.

Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

Weitere Videos entdecken