Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System
April 11th, 2025
Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.
Unsere Forschung konzentriert sich auf den Zelltod von Säugetieren, insbesondere auf die Untersuchung des Gleichgewichts zwischen Apoptose und Nekroptose im Zusammenhang mit Hyperglykämie. In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass die Zelltodprotein RIP1-Kinase die Genexpression während der Nekroptose moduliert. Unsere derzeitige experimentelle Herausforderung besteht darin, Immunzellen, die in Suspension wachsen, genetisch zu manipulieren, insbesondere das Gen für die RIP1-Kinase mit CRISPR-Cas9 auszuschalten.
Unser Protokoll bietet zwei entscheidende Vorteile. Es verbessert die Transfektionsmethoden für Immunzellen, die in Suspension wachsen, indem es Lentiviren verwendet, und es macht die Klonierung einzelner Zellen während des Prozesses der Erstellung eines genetischen Knockouts mit CRISPR-Cas9 überflüssig. Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für die Untersuchung der Rolle der RIP1-Kinase bei der hyperglykämischen Verschiebung der Nekroptose. Zu Beginn des Quadrantenstreifens leiten Escherichia coli, die die lentivirale Vektor-RNA beherbergen, auf Luria-Bertani- oder LB-Agarplatten, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage, bis einzelne Kolonien im am stärksten verdünnten Bereich der Platte sichtbar sind. Wählen Sie nach der Inkubation mit einer sterilen Schleife eine einzelne Kolonie aus und fügen Sie sie zu fünf Millilitern LB-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Entlüften Sie die Kappe des Schlauchs und kleben Sie sie fest.
Inkubieren Sie das Röhrchen acht Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 225 U/min. In der Zwischenzeit 40 Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, in vier 50-Milliliter-Röhrchen geben. Nach der Inkubation werden 40 Mikroliter der gewachsenen Kultur in jedes der vier Röhrchen überführt.
Entlüften und kleben Sie die Kappen der Röhrchen ab, bevor Sie sie 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 225 U/min in einem Orbitalschüttler inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.220 x g in einem schwingenden Eimerrotor für 20 Minuten. Die Überstände in ein Abfallbecherglas umfüllen und alle vier Pellets in 10 Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit Ampicillin, mischen.
Zentrifugieren Sie die kombinierten Pellets bei maximaler Drehzahl in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten, um ein einzelnes Pellet zu erhalten, und entsorgen Sie so viel Überstände wie möglich in das Abfallbecherglas. HEK293T Zellen werden in einer Konzentration von drei- bis fünfmal 10 hoch sechs Zellen in einen T25-Kolben mit DMEM gegeben. Inkubieren Sie den Kolben über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
In der Zwischenzeit wird die Transfektionsmischung unter Verwendung eines Plasmidverhältnisses von 1:1:1:1 und eines Verhältnisses von Transfektionsreagenz zu Plasmid-DNA von 3:1 mit reduziertem Serummedium hergestellt. Mischen Sie 75 Mikroliter Transfektionsreagenz, 2.500 Mikroliter reduziertes Serummedium und 25 Mikrogramm Gesamtplasmid-DNA. Lassen Sie die Mischung 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend pipettieren Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig auf die konfluenten HEK293T Zellen in dem Kolben, der das Medium enthält. Der Kolben wird vorsichtig geschwenkt, um eine ausreichende Homogenisierung der Mischung zu gewährleisten, und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach zweitägiger Inkubation wird das Medium vom Hersteller HEK293T Zellkolben in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 x g, um alle verbleibenden HEK293T Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig alle virenhaltigen Überstände, ohne das Pellet zu beschädigen, und geben Sie es in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zählen und berechnen Sie das erforderliche Volumen der U937-Zellsuspension, um ein Pellet von 2 x 10 hoch sechs Zellen zu erhalten.
Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 400 x g für 10 Minuten und dekantieren den Überstand, wobei das Zellpellet im Röhrchen verbleibt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem virushaltigen Überstand und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 290 x g für 60 Minuten. Nach der Zentrifugation verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet mit dem virushaltigen Überstand im Röhrchen zu resuspendieren.
Legen Sie den Schlauch für 60 Minuten auf einen Ende-über-Ende-Rotator. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 400 x g für 10 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Verhältnis von 1:1 aus dem Virus, das Überstände enthält, und vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS. Die Zellmischung wird in einen neuen T25-Gewebekulturkolben überführt und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Nach der Inkubation werden die U937-Zellen 10 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie das Pellet mit vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und fünf Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Übertragen Sie die Zellkultur in einen T25-Kolben.
Inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius und überprüfen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage auf Anzeichen von Wachstum. Die Western-Blot-Analyse bestätigte den Verlust der RIP1-Proteinexpression in RIP1-CRISPR-Mutantenzellen ohne nachweisbares Signal im Vergleich zu dem starken Signal in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen. Die Behandlung mit TCZ induzierte einen signifikanten nekrotischen Zelltod in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen, der durch die Behandlung mit Necrostatin-1 rückgängig gemacht wurde.
Im Gegensatz dazu zeigten RIP1-CRISPR-Knockout-Zellen einen signifikant geringeren Zelltod im Vergleich zu Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen ohne Wirkung von Necrostatin-1s, was auf einen Verlust der RIP1-Funktion hinweist. Die Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen zeigte einen signifikanten Anstieg der mitochondrialen Superoxidproduktion in Wildtyp- und Nicht-Ziel-Kontrollzellen nach TCZ-Behandlung, die nach der Behandlung mit Necrostatin-1 reduziert wurde. RIP1-CRISPR-Knockout-Zellen zeigten eine minimale mitochondriale Superoxidproduktion ohne beobachtbare Wirkung der Necrostatin-1s-Behandlung.
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Überblick
Diese Studie befasst sich mit der Anwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Herstellung einer receptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-humanen Zelllinie. Sie hebt den Nutzen von CRISPR hervor und konzentriert sich gleichzeitig auf die Komplikationen, die unter bestimmten experimentellen Bedingungen auftreten können.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Genetik
- Zellbiologie
- Signalwege
Hintergrund
- Bedeutung von CRISPR/Cas9 bei genetischen Modifikationen
- Rolle von RIPK1 in der zellulären Signalübertragung
- Herausforderungen bei CRISPR-Anwendungen
Verwendete Methoden
- CRISPR/Cas9-Genbearbeitung
- Biogenese menschlicher Zelllinien
- Analyse der Wirksamkeit des Knockouts
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung der RIPK1-Knockout-Zelllinie
- Identifizierung von Herausforderungen während der Genbearbeitung
- Diskussion der Auswirkungen für zukünftige Forschung
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert die Wirksamkeit von CRISPR/Cas9 zur Herstellung spezifischer Gen-Knockouts.
- Sie trägt zum Verständnis von RIPK1 bei und unterstreicht die Notwendigkeit, experimentelle Herausforderungen in der genetischen Forschung anzugehen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated knockout of RIP1 in U937 cells enables precise interrogation of cell death pathways, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This capability strengthens predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions for programs focused on regulated cell death. The approach is adaptable for functional genomics across diverse cell death regulators, enhancing translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional validation of RIP1 as a cell death regulator.
- Supports mechanistic de-risking by isolating RIP1-dependent pathways.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of necroptosis and related mechanisms.
- Provides a platform for evaluating the impact of gene knockout on cellular phenotypes.
Screening & Assay Development
- Generates validated knockout cell lines for downstream viability and ROS assays.
- Improves assay reproducibility by standardizing genetic backgrounds.
- Enables quantitative assessment of cell death and mitochondrial ROS outputs.
- Supports scalable screening of compounds targeting cell death pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cell death mechanisms.
- Provides continuity from genetic perturbation to functional phenotypic readouts.
- Enables risk-adjusted advancement of cell death modulators into preclinical models.
- Supports identification of translational biomarkers linked to RIP1 activity.
Pipeline & Workflow Integration
This knockout workflow integrates at the early discovery and target validation stages, providing a foundation for lead identification and preclinical evaluation of cell death modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of RIP1 function in cell death.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell systems for quantitative viability and ROS assays.
- Analytics: Enables robust measurement of cell death and mitochondrial ROS as functional readouts.
- Translational Research: Bridges genetic perturbation with disease-relevant phenotypes for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable knockout platform adaptable to other cell death regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death research.
- Operational Value: Standardizes knockout generation and functional validation workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell death-targeted programs and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and functional pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design and lentiviral delivery.
- Needs access to fluorescence microscopy and viability assay platforms.
- Demands rigorous validation of knockout efficiency and functional loss.
- May require adaptation for other cell lines or death regulators.
- Potential pitfalls include off-target effects and incomplete knockout, as addressed in the protocol.
