Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Unser Ziel ist es, zu verstehen, wie mechanische und biochemische Signale die Morphogenese von Tieren korrelieren, einschließlich der Erkennung und Reaktion auf Kräfte durch Zellen und Moleküle. Es wurden weitere Moleküle entdeckt, die mechanosensitiv sind und unter unterschiedlichen Spannungsniveaus unterschiedlich funktionieren. Der physiologische Kontext und die Funktion dieser kraftsensitiven Ereignisse sind jedoch noch weitgehend unbekannt.

Aufgrund der dynamischen Natur kraftsensitiver Ereignisse stützt sich unser Feld weitgehend auf Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildgebung und Zeitrafferaufnahmen, um molekulares und zelluläres Verhalten zu erfassen. Viele fluoreszenzmarkierte Proteine sind nicht hell genug, um abgebildet zu werden, und es erfordert eine räumliche und zeitliche Auflösung ohne signifikante Bleichmittel. Auf der anderen Seite können herkömmliche Immunfluoreszenzmethoden nach der Fixierung nur eine Momentaufnahme der molekularen und zellulären Fixierung erfassen.

Diese Methode ebnet den Weg, um die Lokalisation vieler Proteinrezeptoren mit geringer Häufigkeit wichtiger Signalwege wie Notch, Wnt und der BMP-Signalwege dynamisch zu verfolgen. Schließlich können wir zusätzlich zu den traditionellen linearen Signalkaskaden genau bestimmen, wo die Signalereignisse auf den subzellulären Skalen auftreten.