Name: Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Lernen Sie kostengünstige Färbemethoden zur Visualisierung von Glykogen und Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans. Diese Protokolle ermöglichen Studierenden die Untersuchung von Stoffwechsel und Alterungsprozessen.

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HINWEIS: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) Bakterien und Bristol N2 Wildtyp-Stämme können von der CGC, University of Minnesota, USA, oder durch Spende von einem C. elegans-Labor bezogen werden. Für die Sicherheit der Forscher ist es unerlässlich, persönliche Schutzausrüstung zu verwenden. Obwohl die Konzentrationen von Reagenzien wie Hypochlorit und Natriumhydroxid niedrig sind, ist es wichtig, die empfohlene PSA zu tragen, wie im Manuskript hervorgehoben, um mögliche Risiken im Zusammenhang mit diesen Chemikalien zu minimieren.
1. Glykogengehalt
<ol><li>Vorbereitung von Testplatten<ol><li>Bereiten Sie sechs 60 mm x 15 mm große NGM-Agarplatten20 (10 ml Nematoden-Wachstumsmedien-Agar, NGM, wie in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben) pro Wurmstamm vor und lassen Sie sie 1 Tag lang bei Raumtemperatur trocknen. Halten Sie die Platten geschlossen, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μl E . coli OP50 Flüssigkultur (mit einer optischen Dichte = 0,600, ungefähr bei einer Wellenlänge von 600 nm) pro Platte hinzu, um insgesamt vier 60 mm x 15 mm große NGM-Platten pro Stamm in der Strömungshaube zu beimpfen. Lassen Sie die geschlossenen Platten 1 Tag lang bei 37 °C inkubieren, bevor Sie sie verwenden. HINWEIS: Bereiten Sie sechs Platten vor (Schritt 1.1), aber impfen Sie nur 4 mit E. coli OP50-Bakterien. Bewahren Sie die restlichen zwei Platten bei 4 °C für die spätere Verwendung auf, wenn Sie die Würmer unter Hungerbedingungen stellen. Diese Analyse kann doppelt durchgeführt werden.</li>
		<li>Am Testtag werden 200 μl 0,025 M D-Glucose auf zwei (6 mm x 15 mm) NGM-Agarplatten pro Stamm gegeben, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurden. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur in der Strömungshaube trocknen. HINWEIS: Die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelten NGM-Agarplatten können alternativ zur Verwendung einer Strömungshaube auch in der Nähe von Alkohollampen getrocknet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Synchronisation<ol><li>Ca. 3 Tage vor der Synchronisation werden 3-4 Stücke (3 cm x 3 cm) von einem Erhaltungs-NGM-Agar mit C. elegans Bristol N2 (Wildtyp) in verschiedenen Stadien (ca. 500 Würmer pro Stück) auf eine neue Platte (150 mm x 90 mm) übertragen, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurde.</li>
		<li>Stellen Sie die neue Platte mit den Würmern in eine kontrollierte Umgebung bei 20 °C und halten Sie die Luftfeuchtigkeit 3 Tage lang &gt;95 % (72 h lassen die meisten Würmer das trächtige Erwachsenenstadium erreichen). HINWEIS: Die Wachstumstemperatur muss je nach verwendetem/den verwendeten C. elegans-Stamm (en) möglicherweise angepasst werden.</li>
		<li>Sammeln Sie mit einer Pasteurpipette die Würmer aus der vorbereiteten Platte mit destilliertem H2O und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Warten Sie, bis die Würmer durch die Schwerkraft sedimentiert sind (ca. 15 Minuten) und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu eliminieren. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 5 ml.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml Bleichlösung hinzu (Ergänzende Tabelle 1) und schütteln Sie sie ca. 6 Minuten lang kräftig mit den Händen.</li>
		<li>Unmittelbar nach Beendigung des Schüttelns füllen Sie die Röhrchen mit M9-Puffer bis zu einem Fassungsvermögen von 50 ml.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 3 min lang bei 1400 x g , entfernen Sie den Überstand bis zu 5 mL und fügen Sie dann wieder 45 mL M9-Puffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x.</li>
		<li>Reduzieren Sie das Volumen nach dem letzten Waschen auf 15 ml und halten Sie es ca. 14 Stunden lang bei kontrollierter Temperatur (20 °C) und Luftfeuchtigkeit (&gt;95 %). HINWEIS: Der Synchronisationsprozess kann durch die Gewinnung von Eiern durch Eiablage ersetzt werden: Übertragen Sie ca. 20 erwachsene trächtige Würmer auf eine NGM-Platte (6 mm x 15 mm), die zuvor mit 200 μl E. coli OP50 besät wurde. Lassen Sie die Würmer 1 Tag lang Eier legen. Entfernen Sie danach die trächtigen Würmer und warten Sie, bis die Eier geschlüpft sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Würmern<ol><li>Mit einer automatischen Pipette werden 10 μl der synchronisierten Würmer (Schritt 1.2.8) auf einen Objektträger gegeben und die Anzahl der Würmer gezählt. Berechnen Sie, wie viel Volumen pipettiert werden muss, um 500-1000 Würmer/μl zu erhalten.</li>
		<li>500-1000 L1 synchronisierte Würmer (Schritt 1.2.8) werden auf NGM-Agarplatten (150 mm x 90 mm, Ergänzende Tabelle 1), die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind, als Nahrungsquelle übertragen, bis sie bei 20 °C das Larvenstadium 4 (L4) erreichen. HINWEIS: Würmer können mit einer automatischen Pipette übertragen werden. Wenn keine automatische Pipette verfügbar ist, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas, und das Volumen kann mit Mikroröhrchenetiketten oder Messpipetten aus Glas gesteuert werden.</li>
		<li>Nach 48 h Synchronisation20: Sammeln Sie die L4-Larven von den Platten mit M9-Puffer (Ergänzende Tabelle 1), mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette in ein sauberes konisches Röhrchen 50 mL und waschen Sie sie 3x mit frischem M9-Puffer oder wiederholen Sie die Wäschen, bis alle verbleibenden E. coli OP50-Bakterien vollständig entfernt sind (bei Raumtemperatur). HINWEIS: Der Waschschritt ist wichtig, da einige Würmer während des Eingriffs verhungern.</li>
	</ol></li>
	<li>Ausführen des Assays<ol><li>Übertragen Sie 500-1000 L4-Würmer (Schritt 1.3.1) aus jeder der neuen NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm), die zuvor vorbereitet wurden (Schritte 1.1.2 und 1.1.3). Halten Sie sie bis zum Testtag 48 Stunden lang bei 20 °C. Dieser Zeitplan führt zu drei Versuchsgruppen wie folgt, in doppelter Ausführung (Abbildung 1): A- (Hunger): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten ohne E. coli OP50-Bakterien; B- (regulär): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind; C- (hoher Glukosespiegel): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind und 0,025 M D-Glukose enthalten.</li>
		<li>Am Testtag (nach 48 h): Sammeln Sie die Würmer und waschen Sie sie dreimal kurz im M9-Puffer (Schritte 1.2.2 und 1.2.3) HINWEIS: Bereiten Sie hier NGM-Agarplatten unter Zugabe von D-Glukose vor (Schritt 1.3) und stellen Sie sie beiseite, bis es Zeit ist, die Würmer hinzuzufügen.<ol><li>Jodfärbung: Bereiten Sie eine 5%ige (v/v) Lugolsche Jodlösung (Jod/Kaliumiodid-Lösung) mit frischem M9-Puffer vor. HINWEIS: Lugols Jodlösung kann von lokalen Reagenzienlieferanten oder Apotheken bezogen werden, daher kann die Anfangskonzentration variieren. Falls erforderlich, berechnen Sie, um eine 5%ige (v/v) Lösung zu erhalten.</li>
		</ol></li>
		<li>Übertragen Sie ca. 100 μl gewaschene Würmer (Schritt 4.2) aus jeder Gruppe in das 1,5-ml-Mikroröhrchen mit verdünnter Lugol-Lösung (5 % v/v). Mit einer automatischen Pipette im Verhältnis 1:5 werden 100 μl Würmer auf 400 μl Lugol-Lösung übertragen, gefolgt von einem sanften Rühren in einem Mischer für 5 Minuten. HINWEIS: Wenn kein Mischer verfügbar ist, können die Mikroröhrchen vorsichtig mit den Händen geschüttelt werden.</li>
		<li>Gleich nach diesen 5 Minuten zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen (Würmer + Lugol-Lösung) bei 1400 x g für 3 min. HINWEIS: Wenn dieser Assay an Würmern aus dem L4-Stadium oder darüber hinaus durchgeführt wird, ist es möglich, eine Schwerkraftsedimentation anstelle einer Zentrifuge zu erreichen. Lassen Sie die Mikroröhrchen offen in Racks auf der Tischplatte für 10 Minuten, bis sich alle Würmer am Boden des Mikroröhrchens abgesetzt haben.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 ml frischem M9-Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche, bis das restliche Jod aus der Lösung entfernt ist (mindestens 3x).</li>
		<li>Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rückstand von ca. 100 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um die Würmer schonend zu resuspendieren und für mikroskopische Analysen.</li>
		<li>Übertragen Sie ca. 50 μl der resuspendierten Wurmlösung auf Mikroskopie-Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Betrachten Sie die Hellfeldbilder mit einem Stereomikroskop (bei 1,5x). HINWEIS: Wenn kein Stereomikroskop verfügbar ist, kann ein normales Mikroskop verwendet werden, und Bilder können mit einer Handykamera (3,4x) unter Verwendung eines Adapters aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben.</li>
	</ol></li>
	<li>Daten-Inspektion<ol><li>Quantitative Daten: Berechnen Sie den Glykogengehalt anhand der Jodfärbung von Würmern.<ol><li>Speichern Sie Bilder aus dem Stereomikroskop, die mindestens 10 Würmer pro Gruppe enthalten, als .jpeg Datei zur weiteren Verarbeitung. Laden Sie dazu die kostenlose ImageJ-Software herunter. Einzelheiten finden Sie in der Ergänzungsdatei 1, der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2.</li>
			<li>Öffnen Sie das .jpeg Image mit der ImageJ-Software (die unter https://imagej.nih.gov/ij/download.html kostenlos heruntergeladen werden kann). Klicken Sie auf Segmentierte Linie und skizzieren Sie den Wurm (einen Wurm nach dem anderen). Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Messen , um die Fleckenquantifizierung zu erhalten. Die Daten werden als Mittelwert in der Tabelle angezeigt. Der Mittelwert gibt die Daten an, die aus der Färbedichte pro Wurmfläche berechnet werden.</li>
		</ol></li>
		<li>Qualitative Daten: Erhalten Sie Bilder vom Stereomikroskop jeder Gruppe und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer. Erstellen Sie bei Bedarf ein Bewertungssystem, um die Färbung zu analysieren: 0 farblos; 1 leicht gebeizt; 2 fleckig und 3 stark fleckig. Zählen Sie mit dem Stereomikroskop manuell ca. 10 Würmer pro Gruppe (Minimum) mit einem Handzähler.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Abbildung 1: Schema des Assays für den Gesamtglykogengehalt in C. elegans. Ein Schema des hier durchgeführten Experiments zur Durchführung des Glykogengehalts-Assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Bewertung der Darmpermeabilität
<ol><li>Vorbereitung von Würmern<ol><li>Etwa 14 h nach der Synchronisation (Schritt 1.2.8) werden 500-1000 Würmer (Schritt 1.3.1 und ANMERKUNG) im ersten Larvenstadium (L1) auf jede neue NGM-Agarplatte (60 mm x 15 mm) umgefüllt, die zuvor vorbereitet wurde, und bis zum Tag des Tests bei 20 °C aufbewahrt. Dieser Zeitplan führt zu zwei Versuchsgruppen wie folgt (Abbildung 2): A- (jung): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum Larvenstadium 4 (L4); B- (alt): Die Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum 7. Tag des Erwachsenenalters. HINWEIS: Die Würmer, die bis zum 7. Tag des Erwachsenenalters gehalten werden, müssen jeden Tag mit M9-Puffer gewaschen und auf neue NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) mit 200 μl E. coli OP50-Bakterien übertragen werden, die zuvor als Nahrungsersatz und zur Entfernung der Nachkommen ausgesät wurden. Jüngere Würmer schwimmen während des Dekantierens und können durch Entfernen des Überstands abgetrennt werden. Der Anteil der Schlumpfwürmer nimmt mit zunehmendem Alter zu. Die Bewertung der Darmpermeabilität kann jedoch in jedem Stadium und Alter durchgeführt werden, abhängig vom Zweck der Studie.</li>
	</ol></li>
	<li>Ausführen des Assays<ol><li>Am Testtag L4-Würmer (2 Tage nach Schritt 2.1.1) und adulte Würmer am 7. Tag (jetzt am 9. Tag) mit M9-Puffer sammeln (Ergänzende Tabelle 1) und in markierte 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.</li>
		<li>Bei 1400 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1,0 mL M9 hinzufügen und vorsichtig mischen. Wiederhole diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu entfernen. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 500 μL.</li>
		<li>Geben Sie mit einer automatischen Pipette 10 μl des Wurmsediments auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Berechnen Sie das zu pipettierende Volumen, um 100 Würmer/μl zu erhalten.</li>
		<li>Schlumpffärbung: Bereiten Sie eine 25%ige Lösung aus Erioglaucin-Dinatriumsalz (Ergänzende Tabelle 1) mit destilliertem Wasser vor. Verwenden Sie ggf. den Wirbel für eine bessere Solubilisierung.</li>
		<li>In neue, zuvor identifizierte Mikroröhrchen wird mit einer automatischen Pipette das Volumen mit 100 Würmern, 100 μl 25%iger Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung, 200 μl E. coli OP50 und komplett mit M9-Puffer für ein Endvolumen von 500 μl hinzugefügt. HINWEIS: Die Volumina von Erioglaucin, Dinatrium, E. coli und die Anzahl der Würmer sind festgelegt. Das Volumen des M9-Puffers ist variabel und kann verwendet werden, um das endgültige Volumen auf 500 μL zu bringen.</li>
		<li>3 h unter Rühren in einem Mischer, vor Licht geschützt, bei Raumtemperatur inkubieren. HINWEIS: Wenn kein Mixer verfügbar ist, schütteln Sie die Mikroröhrchen alle 15 Minuten vorsichtig mit den Händen.</li>
		<li>Nach 3 h zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen bei 1400 x g für 3 min. Entfernen Sie 1,0 mL Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 mL M9 Puffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Wäschen, bis die restliche Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung aus der Lösung entfernt wurde. Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rest von ca. 250 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um Würmer vorsichtig zu resuspendieren und für die mikroskopische Analyse zu verarbeiten.</li>
		<li>Übertragen Sie ca. 50 Würmer der resuspendierten Wurmlösung auf Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Inkubieren Sie die Objektträger im Kühlschrank bei -20 °C für 10 min, um die Würmer zu lähmen. HINWEIS: Eine weitere Alternative, um die Würmer zu lähmen, besteht darin, 10 μl Levamisolhydrochloridlösung (10 mM ; Ergänzende Tabelle 1) und decken Sie sie mit Deckgläsern ab.</li>
		<li>Beobachten und zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die vollständig gefärbten Würmer mit Hilfe des Hellfeldes in einem Stereomikroskop (bei 1,5x). Bilder können von einer Handykamera (mit 3,4x) in Verbindung mit einem Adapter aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben.</li>
	</ol></li>
	<li>Daten-Inspektion<ol><li>Qualitative Daten: Erhalten Sie Stereomikroskopische Bilder von jeder Gruppe (L4 und 7. Tag des Erwachsenenalters) und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer.</li>
		<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die Anzahl der Schlumpfwürmer (Blauwürmer) mit einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Geben Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Schlumpfwürmer aus, indem Sie die jungen Würmer (L4, als Kontrollgruppe) und die alten Würmer (7. Tag des Erwachsenenalters) vergleichen: A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Dabei ist A = Gesamtzahl der Würmer B= Anzahl der Schlumpfwürmer</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Abbildung 2: Schema des Gesamtpermeabilitätstests für den Darm bei C. elegans. (A) Zubereitung von C. elegans . (B) Färbung mit Erioglaucin-Dinatriumsalz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung des Metabolismus und des Alterungsmusters bei Caenorhabditis elegans

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<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen&nbsp;</td><td>Lokale</td><td></td> Lieferanten-37-Grad-Brutkasten <td></td></tr><tr><td></td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Lokale</td> <td>Lieferanten-6</td><td></td></tr> <tr><td>cm Petriplatten&nbsp;</td><td>Lokale</td> <td>Lieferanten-Agar</td><td></td></tr> <tr><td>bakteriologisch</td><td>Din&acirc; Glimmer Qu&iacute; Glimmer Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (Wildtyp)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; Glimmer Qu&iacute; Glimmer Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose wasserfrei&nbsp;</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes H2O</td><td>Lokale</td><td></td> Lieferanten-Eriogalucin <td></td></tr><tr><td>Dinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusshaube</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Panasonic Healthcare Company of North America, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc; Glimmer Qu&iacute; Glimmer Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Levamisolhydrochlorid</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lösung</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Zentrifuge 5425R Eppendorf SE, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc; Glimmer Qu&iacute; Glimmer Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; Glimmer Qu&iacute; Glimmer Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakteriologisch</td> <td>&ecirc; xodo cient&iacute; fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica S8 Apo Stereomikroskop (S&atilde; o Paulo, Brasilien)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfat</td><td>Estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung kostengünstiger farbstoffe zur visualisierung der glykogenakkumulation und der darmintegrität bei caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Der Glykogengehalt-Assay bietet eine robuste und schnelle Methode für das Screening verschiedener Testbedingungen, wie z. B. vergleichende Studien verschiedener Stämme, die die Glykogensynthese oder den Glykogenabbau beeinflussen können. In dieser Studie wurden L4-Würmer drei verschiedenen Testbedingungen unterzogen: Nüchtern-, Fütterungs- und Glukose-angereicherte Gruppen. Der Assay wurde dreimal durchgeführt, wobei jeder Zustand in jedem Assay zweimal repliziert wurde; In Abbildung 3 ist ein repräsentatives Bild dargestellt. Nach jedem Assay wurden die mit Lugoler Jodlösung gefärbten Würmer mit einem Stereomikroskop beobachtet, und es wurde ein qualitativer Vergleich zwischen den Gruppen bezüglich der Färbung der Würmer durchgeführt. In Bezug auf die visuelle Beobachtung zeigten Würmer in der Fastengruppe (Hunger) eine weniger intensive Färbung im Vergleich zu den Würmern, die mit E. coli OP50 (normal) gefüttert wurden, sowie denen, die mit E. coli OP50 und D-Glukose (hoher Glukosespiegel) gefüttert wurden. Zusätzlich zeigten die Würmer, die mit E. coli OP50 und D-Glucose (hoher Glukosespiegel) gefüttert wurden, die intensivste Färbung.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Bilder aus dem Glykogengehalt-Assay. Die Glykogenspiegel in C. elegans wurden durch Jodfärbung bestimmt. Mikroskopische Bilder zeigen repräsentative C. elegans-Würmer , die 48 Stunden lang (A) Hunger, (B) regelmäßigem oder (C) hohem Glukosespiegel ausgesetzt waren. Die Würmer wurden gefärbt, indem sie 5 Minuten lang in eine Lösung von Lugols Jod/M9-Puffer (1%) getaucht wurden, wobei das in Schritt 1.4 beschriebene Verfahren befolgt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Ergebnisse der Darmpermeabilität zeigen den Unterschied in der Färbung von jungen Würmern (L4) mit intaktem Darm und alten Würmern (7. Tag des Erwachsenenalters) mit altersbedingt geschädigten Darmmembranen (Abbildung 4). Der Darm von C. elegans ist ein Gewebe von zentraler Bedeutung für die Gesundheit, da er eine entscheidende Rolle bei der Verdauung und dem Stoffwechsel spielt und als Signalzentrum für die Stressreaktion und die Alterungsregulation dient21. Bei jungen Würmern besteht der Darm von C. elegans aus einer starken Barriere, die das Austreten von Darminhalt verhindert. Mit zunehmendem Alter dieser Würmer nimmt jedoch die Darmbarrierefunktion ab und wird empfindlicher gegenüber Störungen aufgrund des fortschreitenden Abbaus von Zellen und Mikrovilli und der Ansammlung von Bakterien im alternden Darm21,22. Wenn junge C. elegans den Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz aufnehmen, wird der Darm des Fadenwurms gefärbt (Abbildung 4A). Auf der anderen Seite ist es möglich zu beobachten, dass gealterte Würmer eine Extravasation des Farbstoffs aufwiesen, die den gesamten Körper des Wurms durchdrang, was auf eine Schädigung der Darmmembran hinweist (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentatives Bild von C. elegans bei der Färbung mit Erioglaucin-Dinatriumsalz. Das mikroskopische Bild zeigt C. elegans mit intaktem Darm (Stadium L4) und Würmer mit geplatztem Darm (7. Tag des Erwachsenenalters). Die Würmer wurden durch Eintauchen in eine 25%ige Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung für 3 h nach Schritt 2.2.4 gefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: ImageJ-Screenshot zur Auswahl der C . elegans-Kontur . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: ImageJ-Screenshot zur Berechnung des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Medien-, Puffer- und Kulturrezepturen. Zusammensetzung verschiedener Medien, Puffer und Kulturen, die im aktuellen Protokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Detaillierte Beschreibung der ImageJ Software zur Quantifizierung des Glykogengehalts in Würmern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

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Forschung

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Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in...

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Hier beschreiben wir eine Technik, die zur Visualisierung genomischer DNA in fixierten, intakten Nematoden verwendet wird. Das Video enthält ein Beispielprotokoll zur Zählung von Chromatin in unbefruchteten C. elegans-Eizellen.

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Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen C. elegans

Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA)...

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie eine Protein nuklearen Translokation unter Hitzestress nachverfolgen mithilfe eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein als Marker und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Das DAPI Färbeprotokoll rückt und bewahrt die GFP und Protein subzelluläre Lokalisation Signale.

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegansgemessen wird. Diese Methode ist hilfreich für die biologische Grundlagenforschung zur Darmgesundheit im Zusammenhang mit der Wechselwirkung zwischen Darmbakterien und ihrem Wirt und für das Screening, um probiotische und chemische Wirkstoffe zu identifizieren, um leckartigedarme Syndrome und entzündliche Darmerkrankungen zu heilen.

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Lernen Sie kostengünstige Färbemethoden zur Visualisierung von Glykogen und Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans. Diese Protokolle ermöglichen Studierenden die Untersuchung von Stoffwechsel und Alterungsprozessen.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

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