Name: Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Kryoschnitt-Protokoll für Kaninchenaugen zur Immunhistochemie in der Netzhautforschung. Diese Methode minimiert Gewebeartefakte und ermöglicht präzise Visualisierung intakter retinaler Schichten.

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Vielen Dank an Rosanna Calderon, Dominic Shayler und Rosa Sierra für die technische Beratung. Diese Studie wurde teilweise durch einen uneingeschränkten Zuschuss an die Abteilung für Augenheilkunde an der USC Keck School of Medicine von Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), dem Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), einem Research to Prevent Blindness Career Development Award (AN) und der Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN) unterstützt. und die Edward N. and Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Southern California durchgeführt und von diesem genehmigt. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden vierzehn (n = 14) Holländische Gürtelkaninchen im Alter zwischen 4 und 6 Monaten verwendet. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Alle Tiere wogen zwischen 2,0 und 2,5 kg. Alle Tiere wurden einzeln untergebracht. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte finden Sie in der Werkstofftabelle.
1. Vorbereitung
<ol><li>Fixiermittel Vorbereitung.<ol><li>Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Pro Auge sind mindestens 50 ml Fixiermittel erforderlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung von Kryoprotektiven.<ol><li>Bereiten Sie 30 % Massenprozent Saccharose in PBS vor. Mindestens 15 Minuten auf einen Shaker legen, um sicherzustellen, dass sich die Saccharose vollständig aufgelöst hat. Pro Auge sind mindestens 50 ml Kryoprotektivum erforderlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des Präparierinstruments.<ol><li>Sammeln Sie zwei Paar Pinzetten, eine gebogene Schere, eine Skalpellklinge und eine 100-mm-Sezierschale und platzieren Sie sie in der Nähe eines Seziermikroskops. Ein Beispiel für eine Einrichtung ist in Abbildung 1A dargestellt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Anfängliche Fixierung
<ol><li>Nach der transkonjunktivalen Enukleation11 ist das Auge sofort in mindestens 50 ml 4 % PFA in PBS auf Eis zu legen. Stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig untergetaucht ist. Wenn sich Luftblasen auf der Außenseite des Auges ansammeln, entfernen Sie diese durch leichtes Schütteln.</li>
</ol>3. Entfernung von Hornhaut und Iris
<ol><li>Entfernen Sie nach 15 Minuten das Auge von 4% PFA in PBS und legen Sie es in eine 100-mm-Präparierschale unter einem Präpariermikroskop. Füllen Sie die Schale mit PBS, um ein Austrocknen des Auges zu verhindern.</li>
	<li>Entferne die Hornhaut.<ol><li>Beginnen Sie mit einem Schnitt mit einer chirurgischen Klinge 1 mm vor dem Limbus, parallel zur Irisebene, um ein versehentliches Durchstechen der darunter liegenden Strukturen zu vermeiden (Abbildung 1B).</li>
		<li>Führen Sie eine gebogene Schere in den ersten Schnitt ein und schneiden Sie weiter umfangs, während Sie 1 mm vom Limbus entfernt bleiben. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge während des Schneidens zu stabilisieren (Abbildung 1C).</li>
		<li>Sobald der umlaufende Schnitt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Hornhaut mit einer Pinzette und wischen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Labortuch ab. Legen Sie die Hornhaut zur Kryoprotektion in eine 30%ige Saccharoselösung bei Raumtemperatur (RT) oder entsorgen Sie sie. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Hornhaut absinkt, was in der Regel weniger als 1 Stunde dauert.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie die Iris.<ol><li>Beginnen Sie damit, einen ersten Schnitt mit einer gebogenen Schere durch die Iris zu machen. Trennen Sie die Iris vollständig vom restlichen Gewebe, indem Sie ähnlich wie bei der Hornhautentfernung umfangsmäßig schneiden (Abbildung 1D).</li>
		<li>Sobald der umlaufende Schnitt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Iris mit einer Pinzette und wischen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Labortuch ab. Legen Sie die Iris zur Kryoprotektion in eine 30%ige Saccharoselösung bei RT oder entsorgen Sie sie wie oben. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Iris absinkt, was in der Regel weniger als 30 Minuten dauert.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Abschluss der Fixierung
<ol><li>Nachdem die Hornhaut und die Iris entfernt wurden, legen Sie das Auge in mindestens 50 ml frisch zubereitetes 4%iges PFA in PBS und legen Sie es auf einen Shaker, um es sanft zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass das Auge während der Bewegung untergetaucht bleibt.</li>
	<li>Halten Sie das Auge über Nacht in 4 % PFA in PBS bei 4 °C. HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass 4 % PFA bei Verwendung zwischen 16 h und 24 h bei 4 °C zu einer hervorragenden IHC-Färbung führen, wobei längere Fixierungsdauern zu einer erhöhten unspezifischen Hintergrundfärbung und Epitopmaskierung führen.</li>
</ol>5. Entfernen der Linse
<ol><li>Entfernen Sie am nächsten Morgen das Auge von 4% PFA in PBS und legen Sie es in eine 100-mm-Präparierstale unter ein Präpariermikroskop. Füllen Sie die Schale mit PBS, um ein Austrocknen des Auges zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie das Objektiv.<ol><li>Beginnen Sie damit, die vordere Linsenkapsel vorsichtig mit einer Pinzette zu greifen. HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig, nicht mit der Pinzette gewaltsam auf die Linse zu drücken oder zu ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann.</li>
		<li>Führen Sie die Schere vorsichtig in die hintere Kammer ein, wobei die Klingen nach hinten entlang der Linse gebogen sind. Machen Sie mit einer gebogenen Schere einen ersten Schnitt durch die Linsenzonulen. HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie mit der Schere nicht gewaltsam auf die Zonulen drücken oder ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann (Abbildung 1E).</li>
		<li>Machen Sie weiterhin kleine Schnitte durch die Linsenzonulen in einem umlaufenden Muster. Machen Sie drei bis fünf Schnitte pro Stundenstunde.</li>
		<li>Um zu überprüfen, ob die Linse vom restlichen Gewebe getrennt ist, fassen Sie die vordere Linsenkapsel vorsichtig mit einer Pinzette und versuchen Sie, sie vorsichtig anzuheben. Wenn sich die Linse nicht sofort anhebt, versuchen Sie nicht, mehr zu ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann. Machen Sie stattdessen weitere Schnitte durch die verbleibenden Linsenzonulen und versuchen Sie es erneut.</li>
		<li>Sobald die Linse vom Rest des Gewebes getrennt ist, legen Sie sie zur Kryoprotektion in 30%ige Saccharoselösung bei RT oder entsorgen Sie sie wie oben. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Linse einsinkt, was in der Regel einige Stunden dauert.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie das Auge zur Kryoprotektion in mindestens 50 ml 30%ige Saccharose in PBS bei 4 °C. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn das Auge sinkt, was in der Regel 24-48 Stunden dauert. Um die Kryoprotektion zu beschleunigen, tauschen Sie die ursprüngliche Saccharoselösung nach 8-12 h gegen eine frische aus und/oder halten Sie das Auge in Saccharoselösung bei RT.</li>
</ol>6. Einbettung
<ol><li>Sobald die Kryoprotektion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Auge aus der 30%igen Saccharoselösung und legen Sie es in eine 100-mm-Sezierschale unter ein Präpariermikroskop. Drehe das Auge vorsichtig nach unten, um überschüssige Saccharoselösung aus dem inneren Teil des Auges zu entfernen. HINWEIS: Versuchen Sie nicht, überschüssige Lösung mit einem Labortuch aus dem inneren Teil des Auges zu entfernen, da das Tuch am Glaskörper haften bleiben und zu einer Netzhautablösung führen kann.</li>
	<li>Wischen Sie mit dem Auge nach unten überschüssige Saccharoselösung vorsichtig mit einem Tuch vom äußeren Teil des Auges ab.</li>
	<li>Füllen Sie eine Einweg-Einbettungsform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) bis zu einer Tiefe von 0,5-1,0 cm. HINWEIS: Diese Basis stellt sicher, dass das Auge den Boden der Form nicht berührt, was die spätere Kryosektion beeinträchtigt.</li>
	<li>Platzieren Sie das Auge mit dem Gesicht nach oben in der Einweg-Einbettungsform. Füllen Sie den inneren Teil des Auges langsam mit OCT und achten Sie besonders darauf, Blasenbildung im Auge zu vermeiden. Wenn sich Blasen bilden, entfernen Sie diese vorsichtig oder schieben Sie sie mit einer Pinzette an den Rand der Form.</li>
	<li>Füllen Sie die Einweg-Einbettform mit OCT. Stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig in OCT eingetaucht ist und nicht die Innenflächen der Form berührt oder der Luft ausgesetzt ist. Wickeln Sie die Einweg-Einbettform, die das Auge enthält, in OCT in Parafilm ein. Über Nacht bei 4 °C aufstellen. HINWEIS: Unserer Erfahrung nach erlauben kürzere Inkubationszeiten es der OCT nicht, den Glaskörper vollständig zu infiltrieren. Infolgedessen verbleibt oft eine Schicht Saccharose zwischen der Netzhaut und der OCT. In diesem Fall löst sich die Netzhaut während der Kryosektion oft vom restlichen Gewebe ab oder reißt sich vollständig ab, da gefrorene Saccharose wahrscheinlich weniger strukturelle Unterstützung bietet als gefrorene OCT, was es schwierig oder sogar unmöglich macht, qualitativ hochwertige Schnitte zu erhalten.</li>
	<li>Am nächsten Morgen legen Sie die Einbettungsform, die das Auge in OCT enthält, in eine 100-mm-Präparierschale unter einem Präpariermikroskop. Vergewissern Sie sich, dass die hintere Hyaloidmembran von der inneren Netzhaut nach oben angehoben erscheint. HINWEIS: Dieses Anheben nach oben kann die Sicht auf die Netzhaut verdecken, wodurch die Ausrichtung schwer zu bestimmen ist.</li>
	<li>Um die Ausrichtung des Auges besser bestimmen zu können, fassen Sie die hintere Hyaloidmembran vorsichtig nach vorne und versuchen Sie, sie mit einer Pinzette abzuziehen, um die darunter liegende Netzhaut während der OCT freizulegen. HINWEIS: Gelegentlich kann der Hyaloidkanal sichtbar sein, der am Sehnervenkopf ansetzt und zur Orientierung verwendet werden kann, da sich der Sehnervenkopf im oberen Teil der Netzhaut befindet (Abbildung 2A). Es ist nicht notwendig, die hintere hyaloide Membran vollständig zu entfernen, da die OCT bereits in den Glaskörper eingedrungen ist, um die innere Netzhaut auszukleiden, und eine verbleibende Membran die Kryosektion nicht beeinträchtigt (Abbildung 2B). Die hintere Hyaloidmembran sollte nur zur Orientierung entfernt werden, falls erforderlich. Weitere Optionen zur Bestimmung der Orientierung sind das Platzieren einer Naht oder einer anderen Art von Markierung vor der Enukleation.</li>
	<li>Übertragen Sie das Auge in eine neue Einbettungsform mit neuem OCT, das bis zu einer Tiefe von 0,5-1,0 cm gefüllt ist, und füllen Sie es dann mit neuem OCT wie in den Schritten 6.3-6.5, um sicherzustellen, dass das endgültige Einbettmedium frei von Schmutz und/oder anderen Unvollkommenheiten ist, die sich möglicherweise über Nacht angesammelt haben. Wenn möglich, entfernen Sie OCT vorsichtig mit einem Tuch auch von der Innenseite des Auges, obwohl dies nicht erforderlich ist.</li>
	<li>Beschriften Sie die Form zur Orientierung (Abbildung 2C). Wenn Sie das Auge in der Kryoform mit dem Auge nach oben ausrichten, wird sichergestellt, dass die OCT die innere Netzhaut auskleidet. Der Hyaloidkanal, der am Kopf des Sehnervs ansetzt, ist ein wichtiger Orientierungspunkt für die Bestimmung des oberen Teils des Auges (Abbildung 2A).</li>
	<li>Legen Sie die beschriftete Einbettungsform, die das Auge in OCT enthält, auf Trockeneis. Stellen Sie sicher, dass das Auge keine der Innenflächen der Einbettungsform berührt oder der Luft ausgesetzt ist. Stellen Sie sicher, dass die Form das Trockeneis direkt berührt, um den Gefrierprozess zu beschleunigen (Abbildung 2D).</li>
	<li>Bringen Sie das eingebettete Auge in einen -80 °C-Gefrierschrank oder direkt in den Kryostaten, um es zu schneiden (Abbildung 2E).</li>
</ol>7. Kryosektion
<ol><li>Montieren Sie den Block mit dem oberen Teil des Auges nach oben und dem unteren Teil des Auges nach unten, wobei die verbleibende Hornhaut und Iris nach rechts (wie in Abbildung 2E) oder links (nicht gezeigt) zeigt. Alternativ können Sie den Block je nach Wunsch in einer anderen Ausrichtung montieren. Brechen Sie bei Bedarf die Form, um den Block zu mobilisieren, indem Sie vorsichtig jede Seite der Form einzeln abbrechen und den Block direkt markieren, um die Ausrichtung des Auges nicht zu verlieren.</li>
	<li>Lassen Sie den Block 30-60 Minuten lang an die Temperatur im Kryostaten anpassen. -20 °C sind ein guter Ausgangspunkt.</li>
	<li>Platzieren Sie nach der Montage eine frische Klinge im gewünschten Winkel, in der Regel parallel zur vertikalen Achse des Auges.</li>
	<li>Stellen Sie die Profildicke wie gewünscht ein: 10-20 μm dicke Profile sind ein guter Ausgangspunkt. Ein Beispiel für einen 14 μm dicken Querschnitt ist in Abbildung 3A-C dargestellt.<ol><li>Beginnen Sie langsam und kontrolliert mit dem Durchschneiden des Blocks. Stellen Sie sicher, dass die Klinge den Block parallel zur vertikalen Achse des Auges schneidet. Wenn nicht, passen Sie den Winkel, in dem die Klinge den Block oder die Tischausrichtung berührt, entsprechend an.</li>
		<li>Verhindern Sie beim Schneiden des Blocks mit einer Bürste die Faltenbildung oder das Kräuseln des Abschnitts. Drehen Sie die Partie schnell um und üben Sie mit einer langhaarigen Bürste sanften Druck nach unten aus, um die Partie abzuflachen und Faltenbildung oder Kräuseln zu minimieren. Forme einen separaten Pinsel mit einer spitzen Spitze, um die Manipulation des Abschnitts zu erleichtern.</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigen Sie den Abschnitt an einem geladenen Objektträger, indem Sie den Objektträger langsam nach unten in Richtung des Objektträgers bewegen. Verhindern Sie, dass sich das Profil während der Befestigung auf sich selbst faltet oder sich anderweitig verformt, indem Sie den Glasschieber vorsichtig über das Profil rollen. HINWEIS: Bewegen Sie die Folie nicht direkt über den Abschnitt und drücken Sie sie nicht gegen den Abschnitt, da dies den Abschnitt beschädigen oder verzerren kann.</li>
	<li>Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen, bevor Sie sie in einen -80 °C-Gefrierschrank umfüllen oder direkt mit einem Standard-Immunfluoreszenzprotokoll fortfahren.</li>
</ol>

Kaninchenaugendissektion und Kryosektion für immunhistochemische Studien

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<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
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<li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).</li>
<li>Baiza-Durán, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+%28PRO-169%29+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li>
<li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Vor der Implementierung des oben genannten Protokolls hatten wir immer wieder Schwierigkeiten bei der Gewebeverarbeitung von Kaninchenaugen für IHC. Wir hatten mehrere Protokolle aus den Augen kleinerer Tiere, wie z. B. Mäuse, angepasst, stellten aber fest, dass diese zu einer unzureichenden Fixierung und Schwierigkeiten bei der Gewebeschnittung führten. Es gibt mehrere wichtige Überlegungen, die konsistente, qualitativ hochwertige Schnitte der Netzhaut des Kaninchens ermöglichen.
Eine Überleg...

Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten spezialisierter Zellen im Auge, die zusammen Licht in neuronale Signale umwandeln. Da die Netzhaut eine entscheidende Rolle für das Sehvermögen spielt, kann das Verständnis ihrer Struktur und Funktion wertvolle Einblicke in einige der häufigsten Ursachen für Sehverlust liefern, wie z. B. Makuladegeneration und diabetische Retinopathie.
Kaninchen dienen als praktisches Tiermodell in der Netzhautforschung, da sie im Vergleich zu anderen Modellen mehrere Vorteile bieten. Kaninchenaugen sind in ihrer Anatomie den menschlichen Augen relativ ähnlich 1,2. Kaninchen haben zum Beispiel einen Bereich mit erhöhter Photorezeptordichte, der als horizontaler visueller Streifen bekannt ist und der der Fovea beim Menschen entspricht. Andere häufig verwendete Tiermodelle, wie z. B. Nagetiere, haben keine anatomische Entsprechung. Darüber hinaus ist das retinale Gefäßsystem bei Kaninchen im Vergleich zu Nagetieren dem des Menschen ziemlich ähnlich. Kaninchenaugen sind auch relativ groß. Dies macht sie besonders geeignet für Studien, die die Verabreichung von Medikamenten oder chirurgische Eingriffe in den Glaskörper oder die Netzhaut beinhalten, die sonst bei einem kleineren Auge schwierig oder unmöglich sein könnten3.
Die Immunhistochemie (IHC) ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Lokalisierung von Antigenen in einem Gewebe und findet breite Anwendung in der Netzhautforschung 4,5,6. Da es sich bei der Netzhaut um eine empfindliche Struktur handelt, ist eine sorgfältige Gewebeaufbereitung erforderlich, um brauchbare Ergebnisse mit IHC zu erzielen. Netzhautablösungen und andere Gewebeartefakte wie Netzhautbrüche oder -falten treten häufig während der Verarbeitung auf und können die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Die erfolgreiche Verarbeitung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Gewebemanipulation, der Art und Dauer der Fixierung, der Art des Einbettungsmediums und der Schnitttechniken 7,8,9,10. Trotz der Vorteile der Verwendung von Kaninchen als Tiermodell in der Netzhautforschung gibt es nur sehr wenige Protokolle, die eine erfolgreiche Gewebeverarbeitung der Kaninchennetzhaut beschreiben. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Netzhautschnitte aus ganzen Kaninchenaugen für den Einsatz in der IHC beschrieben.

<table><tbody><tr><td>100-mm-Kulturschale</td><td>Corning</td><td>353025</td><td>Für die Dissektion (Schritte 1.3, 3 und 5)</td></tr><tr><td>50-ml-Röhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-106</td><td>Für die Fixierung und Kryoprotektion (Schritt 1)</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Für die Kryosektion (Schritt 7)</td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Für die Dissektion (Schritte 1.3, 3 und 5)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Verdünnt 1:1.000 in Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Zur Dissektion (Schritte 1.3, 3 und 5)</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Verdünnt 1:1.000 in Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>Verdünnt 1:1.000 in Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Wird zum Sezieren verwendet (Schritte 1.3, 3 und 5)</td></tr><tr><td>Glas-Objektträgerabdeckung</td><td>VWR</td><td>48404-453</td><td>Zum Kryoschneiden (Schritt 7)</td></tr><tr><td>Ziege Anti-SOX2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2018</td><td>Verdünnt 1:100 in Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Hochkarätige Einweg-Kryostatenklingen</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>14035838926</td><td>Für Kryosektionen (Schritt 7)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Zum Abwischen von überschüssigem PBS oder OCT (Schritte 3 und 6)</td></tr><tr><td>Maus Anti-RPE65</td><td>Novus Bio</td><td>NB100-355SS</td><td>Verdünnt 1:100 in Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>OmniPur Saccharose</td><td>Millipore</td><td>167117</td><td>Zur Kryoprotektion (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 20%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713</td><td>Wird als Gewebefixiermittel verwendet (in Schritt 1.1 auf 4 % verdünnt)</td></tr><tr><td>Peel-A-Away Einweg-Einbettungsform (22x22x20 mm tief)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td>Zur Verwendung als Einbettungsform (Schritt 6)</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Zur Herstellung von Fixiermittel (Schritt 1.1) und Kryoprotektivum (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Skalpellklinge Nr. 15</td><td>Feder</td><td>08-916-5D</td><td>Zur Dissektion (Schritte 1.3, 3 und 5)</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Zur Kryosektion (Schritt 7)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Wird als Einbettungsmedium verwendet (Schritt 6)</td></tr></tbody></table>

gewinnung hochwertiger kryoschnitte von ganzem kaninchenauge 

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye

Dieses Protokoll beschreibt, wie man hochwertige Netzhautkryosektionen bei größeren Tieren, wie z. B. Kaninchen, erhält. Nach der Enukleation wird das Auge kurz in das Fixiermittel getaucht. Dann werden die Hornhaut und die Iris entfernt und das Auge über Nacht bei 4 °C fixiert. Nach der Fixierung wird die Linse entfernt. Das Auge wird dann in eine Kryoform gelegt und mit einem Einbettmedium gefüllt. Durch das Entfernen der Linse hat das Einbettmedium einen besseren Zugang zum Glaskörper und führt zu einer besseren Netzhautstabilität. Wichtig ist, dass das Auge über Nacht in Einbettmedium inkubiert wird, um eine vollständige Infiltration im gesamten Glaskörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation über Nacht wird das Auge auf Trockeneis eingefroren und in Stücke geschnitten. Ganze Netzhautschnitte können für die Verwendung in der Immunhistochemie gewonnen werden. Standard-Färbeprotokolle können verwendet werden, um die Lokalisation von Antigenen im Netzhautgewebe zu untersuchen. Die Einhaltung dieses Protokolls führt zu qualitativ hochwertigen Netzhautkryosektionen, die in jedem immunhistochemischen Experiment verwendet werden können.

Nach der Gewebeverarbeitung kann ein Standard-Immunfluoreszenzprotokoll verwendet werden, um eine beliebige Anzahl biologischer Prozesse in der Netzhaut zu untersuchen. Abbildung 3A-C zeigt repräsentative Fluoreszenzbilder eines Netzhautschnitts, die mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden. Der Netzhautschnitt wurde nach einem zuvor beschriebenen Protokollimmungefärbt 12.
Die in <strong class="xfi...

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte ganzer Kaninchenaugen. Es beschreibt Verfahren zur Dissektion, Fixierung, Einbettung und Sektion von Kaninchenaugen, die leicht für den Einsatz in jeder Studie angepasst werden können, bei der die Immunhistochemie bei größeren Augen eingesetzt wird.

Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge 

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf neuartige Ansätze zur Regeneration des retinalen Pigmentepithels. Es wird angenommen, dass die Dysfunktion des retinalen Pigmentepithels eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie vieler Augenkrankheiten, wie z. B. der Makuladegeneration, spielt, so dass die Regeneration dieser Zellschicht aus therapeutischer Sicht attraktiv ist. Die Visualisierung der strukturellen Anatomie der Netzhaut mittels Immunhistochemie hat breite Anwendungen in der Netzhautforschung.In unserem Labor haben wir festgestellt, dass es aufgrund von Gewebeartefakten wie Netzhautansätzen und Netzhautfalten schwierig ist, brauchbare Ergebnisse aus Kaninchenaugen zu erhalten. Trotz dieser Herausforderungen gibt es nur sehr wenige Protokolle, die eine erfolgreiche Gewebeverarbeitung der Netzhaut von Kaninchen beschreiben. Dieses Protokoll nimmt mehrere wichtige Änderungen an den Standard-Gewebeverarbeitungstechniken vor, die zu hervorragenden Gewebeschnitten der Netzhaut des Kaninchens führen.Diese Studie kann es Forschern ermöglichen, bessere Ergebnisse aus ihrer Forschung zu erzielen, die den Einsatz von Immunhistochemie in Kaninchenmodellen beinhaltet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel zeigt die Präparation und Inkubation von Kaninchen-Netzhaut und Partikel-vermittelte Gentransfer von Plasmiden GFP oder eine Vielzahl von subzellulären Marker in retinalen Ganglienzellen.

Organotypischen Kultur der Adult Kaninchen Retina

Kaninchen werden häufig verwendet, um die Pharmakokinetik von intraokularen Arzneimitteln zu untersuchen. Wir beschreiben ein Verfahren zur Durchführung pharmakokinetischer Studien von intraokularen Arzneimitteln mit Kaninchenaugen.

Die Verwendung von Kaninchenaugen in pharmakokinetischen Studien von intraokulare Drugs

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC).  Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur histologischen Präparation von Objektträgern aus Augäpfeln von Nagetieren vor. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die innere Netzhaut einfach sichtbar gemacht und unter einem Lichtmikroskop beurteilt werden. Das Verfahren wird für die Augäpfel von Mäusen und Ratten vorgestellt.

Präparation und Analyse histologischer Objektträger von Augäpfeln von Ratten und Mäusen zur Beurteilung der Netzhaut

Es wird ein Protokoll zur Vorbereitung von Kryoschnitten der Maus-Netzhaut und zur Durchführung von Immunfärbungen an Photorezeptoren beschrieben. Dieser Artikel ermöglicht es Forschern, konsistente Schnellschnitte der Netzhaut von Mäusen mit gut erhaltener Morphologie und qualitativ hochwertigen Immunfärbeergebnissen zu erstellen.

Kryosektion und Immunfärbung der Netzhaut der Maus

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Die Eier von Xenopus laevis intakt, lysiert und / oder fraktionierte sind nützlich für eine Vielzahl von Experimenten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Eiablage zu veranlassen, zu sammeln und dejelly die Eier, und sortieren Sie die Eier, um beschädigte Eier zu entfernen.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

Lernen Sie ein optimiertes Kryoschnitt-Protokoll für Kaninchenaugen zur Immunhistochemie in der Netzhautforschung. Diese Methode minimiert Gewebeartefakte und ermöglicht präzise Visualisierung intakter retinaler Schichten.

Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge

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