Name: Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für Gewebemodellierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen im Herzen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Erzeugung von Myokard-imitierender extrazellulärer Matrix für die Zellkultur

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Laborflasche</td><td>VWR</td><td>215-1595</td> Vor <td>Gebrauch reinigen und autoklavieren</td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>steril,&nbsp; Polystyrol</td></tr><tr><td>100 mm Glasplatte&nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>Vor Gebrauch reinigen und autoklavieren</td></tr><tr><td>100 mm Platten</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Behandelte, sterile Zellkulturschale</td></tr><tr><td>15 mL sterile Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Zentrifugen sterile Röhrchen, Polypropylen</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Deckgläser</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>steril, &nbsp; Polystyrol</td></tr><tr><td>250 mL Laborflasche</td><td>VWR</td><td>215-1593</td> Vor <td>Gebrauch reinigen und autoklavieren</td></tr><tr><td>35-mm-Platten</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Behandelte, sterile Zellkulturschale</td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td>Sterile sterile Röhrchen aus Polystyrol</td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Zentrifugensterile Röhrchen aus Polypropylen</td></tr><tr><td>500 mL</td><td>Laborflasche VWR</td><td>215-1594</td><td>Reinigen und Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>60 mm Platten</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Behandelte, sterile Zellkulturschale</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (NH4OH)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>338818</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Einwegskalpelle</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>Steril und einmalig</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Bei 2-8 Grad lagern; C; Vermeiden Sie Lichteinwirkung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Bei -20 °C lagern. Das Serum sollte in kleinere Arbeitsvolumina aliquotiert werden</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>Vor Gebrauch reinigen und autoklavieren</td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Commercial Powder</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Große chirurgische Schere</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>Reinigen und vor Gebrauch autoklavieren</td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td> Vor <td>Gebrauch reinigen und autoklavieren</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Bei -20°C lagern. Die Lösung&nbsp; sollte in kleinere Arbeitsvolumina aliquotiert werden</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasic</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Stericup Filter</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>Sterile und Einweg-Filtermembranen von 0,22 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Flüssiges</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Bei -20 °C lagern. Es sollte in kleinere Arbeitsvolumina aliquotiert werden</td></tr></tbody></table>

herstellung von kardialer extrazellulärer matrix aus adulten humanen fibroblasten für die beschichtung von kulturschalen

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

Das Auswachsen von Fibroblasten aus den kleinen Fragmenten des nativen Myokards, die in Kultur gebracht wurden, wurde innerhalb von 3-5 Tagen beobachtet (Abbildung 1).
In den folgenden Tagen stieg die Anzahl der Fibroblasten weiter an, möglicherweise aufgrund des anhaltenden Auswachsens aus der Herzgewebeprobe und der Vermehrung migrierter Fibroblasten auf der Oberfläche der Schale. Es sollte nicht erwartet werden, dass alle Myokardfragmente, die durch mechanische Disaggregation mit einem Skalpell gewonnen werden, die gleiche Anzahl von Fibroblasten in der gleichen Zeit liefern, da die resultierenden Gewebefragmente leicht unterschiedliche Volumina und Zellüberlebensraten aufweisen können. Insbesondere können Myokardfragmente mit bestätigter Wachstumsaktivität zurückgehalten und neu plattiert werden, so dass sie mindestens zweimal für die Fibroblastenisolierung verwendet werden können.
Die Fibroblasten können über mehrere Passagen subkultiviert werden, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen, die für weitere Experimente zur Verfügung stehen. Sobald sie jedoch den Zusammenfluss erreichen, hören die Fibroblasten auf, sich in vitro zu vermehren, und übernehmen die Synthese- und Sekretionsaktivität, wodurch sie extrazelluläre Matrix ablagern. Bei der anschließenden Dezellularisierung bleibt die Oberfläche der Platte mit einem kardialen EZM-Netz bedeckt (Abbildung 2). Die visuelle Beobachtung der Kulturschale mit bloßem Auge und unter Verwendung eines inversen Phasenkontrastmikroskops während der Fibroblastenentfernung ist unerlässlich, um die Inkubationszeit in der Dezellularisierungslösung auf das notwendige und ausreichende Minimum zu minimieren. Das Vorhandensein eines schwimmenden Schleiers während der Inkubation deutet auf eine Permeabilisierung und Ablösung der Monoschicht von Fibroblasten hin, und die Dezellularisierungslösung sollte unmittelbar danach verdünnt und entfernt werden.
Die Zusammensetzung der aus Fibroblasten gewonnenen kardialen EZM hängt von der Quelle der Fibroblasten ab. In unseren Experimenten hatte die kardiale EZM, die von Fibroblasten produziert wurde, die aus normalen menschlichen Herzen und aus menschlichen Herzen mit ischämischer Kardiopathie isoliert wurden, unterschiedliche Proteingehalte und übte unterschiedliche Einflüsse auf die primitive kardiale Zellproliferation, Apoptose und Migration aus11,12. Obwohl der Verlust von EZM-Proteinen während des Dezellularisierungsprozesses unvermeidlich ist, bewahrte die im vorliegenden Protokoll verwendete Methode die Zusammensetzung und Architektur der in vitro produzierten kardialen EZM weitgehend (Abbildung 3).
In diesem Protokoll wurde Vorhofgewebe verwendet, da es sowohl aus normalen (Spender-) als auch aus pathologischen (Empfänger-) Herzen gewonnen werden kann. Während das gesamte pathologische (Empfänger-)Herz geschnitten und für Forschungszwecke verwendet werden kann (nach den Prinzipien der Deklaration von Helsinki und mit Genehmigung der lokalen Ethikkommission), ist es nicht möglich, zum Zeitpunkt der Transplantation Proben von Ventrikeln aus dem Spenderherz zu gewinnen. Aus diesem Grund ist die beste Probenquelle, wenn der Zweck der Studie darin besteht, Unterschiede zwischen Herzgewebe unter normalen und pathologischen Zuständen zu untersuchen, die Vorhofwand. Abhängig von der Verfügbarkeit anderer lebensfähiger kardialer Gewebequellen können Proben aus Vorhof- oder Ventrikelwänden des normalen oder pathologischen Herzens nach dem gleichen Protokoll für die Beschichtung der kardialen EZM-Schale verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg"> Abbildung 1: Isolierung von kardialen Fibroblasten. Fibroblastenauswuchs aus Myokardfragmenten nach 4 Tagen (A), 8 Tagen (B) und 12 Tagen (C) Kultur. Maßstabsleisten: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg"> Abbildung 2: Dezellularisierung der extrazellulären Matrix. Fibroblasten nach etwa 10 s (A), 20 s (B), 30 s (C), 40 s (D), 50 s (E) und 60 s (F) Inkubation in der Dezellularisierungslösung. Maßstabsleisten: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg"> Abbildung 3: Zusammensetzung der extrazellulären Matrix vor und nach der Dezellularisierung. Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von repräsentativen kardialen extrazellulären Matrixproteinen, einschließlich Kollagen vom Typ III (A,E) und Typ IV (B,F), Laminin (C,G) und Fibronektin (D,H), vor (A-D) und nach (E-H) Fibroblastenentfernung. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) angefärbt. Maßstabsleisten: (A-C,E-G) 50 μm; (D,H) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lösungen</td>
			<td colspan="2">Zusammensetzung der Lösungen</td>
			<td>Letzter Band</td>
			<td>Kommentare</td>
		</tr><tr><td>Hank's Ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td>
			<td colspan="2">Kommerziell betriebene Salze + doppelt destilliertes steriles Wasser + 0,35 g Natriumbicarbonat</td>
			<td>1 L</td>
			<td>Sterilisiert durch Filtration/Lagerung bei 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Lösung für die Dezellularisierung</td>
			<td colspan="2">0,25 % Triton X-100 + 10 mM NH4OH+ PBS</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>Sterilisiert durch Filtration/Lagerung bei 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td colspan="2">223,75 ml DMEM + 25 ml fötales Rinderserum + 1,25 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung</td>
			<td>250 mL</td>
			<td>Bei 4 °C lagern</td>
		</tr><tr><td>Gelatine-Lösung</td>
			<td colspan="2">0,2 g Gelatinepulver + 100 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>Sterilisiert durch Filtration/Lagerung bei 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0,1 g Kaliumphosphat einbasisch + 0,1 g Kaliumchlorid + 4,0 g Natriumchlorid + 0,575 g Natriumphosphat zweibasisch + zweifach destilliertes steriles Wasser</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>Sterilisiert durch Filtration/Lagerung bei 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Trypsin-Stopp-Lösung (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 mL fötales Rinderserum + 45 mL Hank's Balanced Salt Solution</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>Bei 4 °C lagern</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Die Komponenten und die jeweiligen Konzentrationen für jede in der Studie verwendete Lösung.

Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

Dieses Protokoll beschreibt die komplette Decellularization des menschlichen Myokard unter Beibehaltung seiner Komponenten der extrazellulären Matrix. Weiterverarbeitung der extrazellulären Matrix Ergebnisse bei der Herstellung von Mikropartikeln und einer zellschützenden selbstorganisierende Hydrogel.

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Das Ziel dieser Methode ist es, fibroblast-abgeleitete 3D-Matrizen als natürliches Gerüst für nachfolgende zelluläre Assays zu erhalten. Fibroblasten werden in einer vorbehandelten Kulturplatte gesät und mit Ascorbinsäure für die Matrixgenerierung stimuliert. Matrizen werden dezellularisiert und an kulturrelevante Zellen (z. B. Endothelzellen) blockiert.

Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay

Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Erfahren Sie die Herstellung kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für Gewebemodellierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen im Herzen.

Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen

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