Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Im Pseudolabor kultivieren wir Rückenzellneuronen aus dem marinen Mollusken Plegia California car. Diese Neuronen bilden sehr große Wachstumskonen aus, wodurch sie ein hervorragendes Modellsystem für hochauflösende Untersuchungen der Wachstumskonen-Motilität und -Lenkung darstellen, insbesondere zur Analyse der Zytoskelettdynamik. In diesem Video demonstrieren wir, wie man eine Plegia-Dissektion und die Kultur von Rückenzellen durchführt.

Hallo, ich bin Daniel Suter vom Fachbereich Biowissenschaften der Purdue University. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Dissektion, Kultur und Bildgebung von Plegia-Rücken-Zell-Neuronen. Neuronen aus der C. her apia CAA wurden umfassend für Studien zum Lernen und Gedächtnis verwendet.

Da Apia über ein einfaches Nervensystem und große Neuronen verfügt, die sich für die Elektrophysiologie eignen, nutzen wir in unserem Labor diese Neuronen, weil ihre Wachstumskonen groß sind und sich besonders gut für hochauflösende Bildgebung der Proteindynamik im Zusammenhang mit Wachstumskonen-Motilität und -Orientierung eignen. Der vollständige Vorgang umfasst die folgenden Schritte.

Am ersten Tag wird das Tier geopfert und seziert, um die Bauchganglien zu gewinnen. Am zweiten Tag werden die Kulturplatten vorbereitet. Rückenständige Zellkluster werden isoliert und einzelne Neuronen ausplattiert.

Am dritten Tag wird eine Abbildungskammer zur zeitraffenden Bildgebung der Zellen mit DIC-Differentialinterferenzkontrastmikroskopie aufgebaut, wobei die Durchführung demonstriert und erläutert wird. Die heutige Prozedur wird iTune Lee durchführen, eine Doktorandin in meinem Labor. Sie wird Ihnen nun zeigen, wie man Rückenzellneuronen präpariert.

Beginnen wir. Die Bag-Zell-Neurone sind Teil des Bauchganglions des plegischen Nervensystems, daher werden wir das gesamte Bauchganglion zur enzymatischen Verdauung herauspräparieren. Anschließend trennen wir die beiden Bag-Zell-Cluster vom übrigen Ganglion ab.

Das Bauchganglion wird in dieser zweistufigen Lösung 15 bis 16 Stunden lang inkubiert, um das Bindegewebe aufzulösen. Nun müssen wir eine große 60-Milliliter-Spritze vorbereiten, die mit 0,5 mol Magnesiumchlorid gefüllt ist, um das Tier zu töten, sowie die chirurgischen Instrumente reinigen: eine Pinzette, eine Schere und eine große Schere. Wir verwenden Aplysia californica von der kalifornischen Küste, die etwa 150 Gramm schwer sind.

Wir halten die Tiere maximal drei bis vier Wochen lang in einem Hummerbehälter. Das Tier wird nahe am Kopf in die Körperhöhle mit der Magnesiumchloridlösung injiziert. Durch Reiben des Tieres wird die Verteilung der Lösung unterstützt und verhindert, dass es sich zusammenzieht.

Fixieren Sie das Tier mit Spritzenkanülen am Kopf und Schwanz auf einer Styroporplatte. Heben Sie die Körperwandmuskulatur mit einer Pinzette an und öffnen Sie die Körperhöhle mit einer großen Schere. Schneiden Sie dann die Körperwand entlang der Seite vom Kopf bis zum Schwanz auf und heften Sie die Muskulatur mit Nadeln an der Platte fest.

Danach muss das abdominale Ganglion unterhalb des Eierstocks gefunden werden, welches ein borstenartiges, gelbliches Organ ist. Das abdominale Ganglion kann lokalisiert werden. Trennen Sie das Ganglion ab, indem Sie die Nerven mit der Präzisionsschere an der vorderen und hinteren Seite des Ganglions durchschneiden.

Überführen Sie dann das Ganglion in ein Reagenzglas mit einem Milliliter der Dissoziationslösung und stellen Sie es für 15,5 Stunden in ein Wasserbad bei 22 Grad. Während dieser Inkubation löst sich das Bindegewebe so weit, dass die Hinterzellenansammlungen leicht entfernt werden können. Vor Beginn der Hinterzellkultur bereiten wir die Deckgläser vor, auf denen die Neuronen kultiviert werden.

Wir kultivieren Rückenmarksneuronen auf beschichteten Deckgläsern in 35-Millimeter-Petri-Schalen. Anschließend werden sie in L-15-A-SW-Medium, einem Kulturmedium mit hohem Salzgehalt, eingetaucht. Für diese Zelltypen bereiten wir typischerweise acht bis zehn Petri-Schalen mit Deckgläsern pro Tier vor.

Jetzt erläutern wir die Werkzeuge, die zum Platten der Bag-Zell-Neurone verwendet werden. Für die Dissektion von Bag-Zell-Clustern benötigen wir drei peachfarbene Schalen ohne Deckgläser, gefüllt mit L 15 A SW, feine Pinzette und Schere, die mit Alkohol sterilisiert wurden, sowie eine gebogene gelbe Spitze, die an eine P 20-Pipette angebracht ist. Die gelbe Spitze wird durch schnelles Überführen über die Flamme eines Bunsenbrenners erhitzt und mit Hilfe einer Pinzette gebogen.

Seien Sie vorsichtig, um den Biegeteil nicht zu zerquetschen. Andernfalls könnte der Bag-Zellverbund später dort hängen bleiben. Die Dissektion und das Ausplattieren von plegischen Bag-Zellen erfolgen bei Raumtemperatur unter dem Stereomikroskop.

Jetzt ist die 15,5-stündige Enzyminkubation beendet, und wir können das Bauchganglion vom Scheibenraum in eine der Arbeitsschalen mit L 15 A SW-Medium überführen. Bevor wir zeigen, wie die Bag-Zellen isoliert werden, betrachten wir zunächst eine schematische Darstellung. Um zu veranschaulichen, wie das Bauchganglion präpariert wird, schneiden wir zunächst das Bauchganglion mittig durch.

Wie Sie an dieser Linie erkennen können, führen wir dann zwei Schnitte vorne und hinten am Rücken durch. So entsteht ein Bündel, wie Sie hier sehen können.

Nun betrachten Sie durch das Stereomikroskop, dass das Bauchganglion in der Mitte durchtrennt ist und dass nun zwei Schnitte vorne und hinten am hinteren Zellcluster angelegt wurden. Anschließend verwenden Sie die Pinzette, um eine Öffnung im Bindegewebe zu finden, und drücken vorsichtig die das Bag-Zellcluster umgebende Bindegewebshülle nach unten. Entfernen Sie das Bindegewebe, wenn möglich, mit der Schere als ein einziges Stück vom Cluster.

Achten Sie jedoch darauf, den Bag-Zell-Cluster nicht zu beschädigen. Mit einer mittleren Menge, die in die gebogene Spitze aufgenommen wurde, übertragen Sie den Bag-Zell-Cluster vorsichtig in eine andere Arbeitsschale. Lösen Sie den Bag-Zell-Cluster vorsichtig mit einer gelben Spitze, um einzelne Bag-Zellen aus dem Cluster zu entfernen.

Führen Sie dazu den Zellhaufen in die Pipettenspitze ein und geben Sie ihn blasenfrei wieder ab. Überführen Sie lebende Zellen aus dem Haufen in Schalen mit poly-beschichteten Deckgläsern. Tote Zellen erscheinen im Zentrum schwarz, während lebende Zellen weiß sind.

Es ist wichtig, die Zellen für die Mikroskopie in der Mitte des Deckgläschens zu platzieren und Zelltrümmer sowie tote Zellen so schnell wie möglich zu entfernen. Durch Aufnehmen des unerwünschten Materials oder Wegblasen heften sich gesunde Zellen rasch an die Polylysin-Platte an. Etwa 15 bis 25 Zellen pro Deckglas.

Wenn alle Zellen aus dem ersten Cluster positioniert wurden, wird das Bindegewebe des zweiten Clusters entfernt und das gleiche Zellplattierungsverfahren fortgesetzt. Nachdem alle Platten fertiggestellt sind, lassen Sie sie mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Labormöbelplatte stehen, damit sich die Zellen ordnungsgemäß anheften können, wobei jegliche Vibrationen vermieden werden müssen. Danach stellen Sie die Schalen auf eine Styropor- oder Kunststoffschale und bringen Sie sie vor der weiteren Verwendung in einen 14-Grad-Inkubator.

Wir bilden die Wachstumskegel in der Regel ein oder zwei Tage nach dem Ausplattieren ab. Für die Live-Bildgebung der Dynamik neuronaler Wachstumskegel stellen wir eine kleine Bildgebungskammer aus zwei Deckgläsern her, die durch Kunststoffabstandshalter getrennt sind. An dem unteren Deckglas haften die Neuronen.

Die obere Deckglasplatte wird mit einem Diamantschreiber kürzer geschnitten, um einen einfachen Mediumaustausch zu ermöglichen. Auf dem Mikroskoptisch wird das Deckglas-Sandwich anschließend in eine speziell angefertigte Halterung zur Montage am Mikroskop eingelegt. Vakuumfett für Objektträger wird verwendet, um die Kammerbauteile zusammenzuhalten, ohne dass Medium austritt. Mit einer kleinen Spritze wird Vakuumfett auf das obere Deckglas aufgetragen, dann positionieren wir mit einer Pinzette die Abstandshalter und tragen anschließend etwas Vakuumfett darüber auf.

Dann heben wir die gesamte Anordnung auf, drehen sie um und drücken sie vorsichtig auf die Deckglasunterlage mit den Zellen, die sich noch in der Schale befinden. Benutzen Sie Wattestäbchen, um die Deckgläser auszurichten, und drücken Sie das obere Deckglas vorsichtig nieder, ohne es zu zerbrechen. Danach entfernen wir das Sandwich vorsichtig aus der Schale, wischen überschüssiges Medium ab und legen es auf den Boden des Halterungsgeräts.

Platzieren Sie das Präparat in der Halterung, ohne das Deckglas durch Druck zu beschädigen. Reinigen Sie beide Deckgläser mit Glasreiniger auf einem Wattestäbchen, und wir bevorzugen Glasreiniger, da er weniger Streifen auf dem Glas hinterlässt. Reinigen Sie das bedeckte Glas mit kreisförmigen Bewegungen von der Mitte ausgehend und folgen Sie unmittelbar mit einem trockenen Wattestäbchen, um Streifen zu vermeiden.

Reines, abgedecktes Glas ist sehr wichtig für hochwertige Aufnahmen, insbesondere bei Verwendung von DIC-Optiken. Plegia-Rückenzell-Neuronenkulturen sind Kulturen mit geringer Dichte, weshalb es sehr hilfreich ist, wenn Ihr Mikroskop über eine Probentisch-Positionierungsfunktion verfügt, um leicht zwischen verschiedenen Zellen wechseln zu können. Nun sind wir bereit, die Morphologie und Beweglichkeit des Wachstumskerns zu beobachten.

Wir visualisieren das Wachstum hinsichtlich Morphologie und Beweglichkeit mittels hochauflösender differentieller Interferenzkontrast-Durchlichtmikroskopie (DIC) in Zeitrafferaufnahmen. Die DIC-Bildgebung eignet sich gut für diese Anwendung, da sie eine Oberflächenansicht des Wachstumskegels zeigt, wie in diesem 60-fach vergrößerten DIC-Zeitrafferfilm ersichtlich. Man kann deutlich die drei Bereiche eines typischen Wachstumskegels erkennen.

Die periphere Domäne, die aus Affect enrich la mela podia und op podia besteht. Die Übergangszone, die durch Ruffle-Aktivität gekennzeichnet ist, und die zentrale Domäne, die hauptsächlich Mikrotubuli und Organellen enthält. Um die Mechanismen der Wachstumskontrolle zu untersuchen, haben wir den restrained bead interaction (RBI)-Assay entwickelt, in diesem Assay.

Mikroperlen, beschichtet mit artesischen Proteinen, werden verwendet, um zelluläre Zielsubstrate nachzuahmen. Die Perle wird mit einer Mikronadel in der DIC-Zeitraffer-Aufnahme auf die periphere Domäne des Wachstumskegels platziert. Man kann den retrograden Effekt und Fluss anhand sich rückwärts bewegender Wellen in der zentralen Domäne erkennen.

Organellen bewegen sich entlang von Mikrotubuli. Nach einer anfänglichen Phase, in der keine nennenswerten Veränderungen auftreten, kann man eine plötzliche Vorwärtsbewegung der zentralen Domänengrenze in Richtung der fixierten Perle beobachten. Eine begleitende Vorwärtswanderung durch Wachstum der führenden Kante und Zunahme der Spannung führt zusätzlich zu einer Dämpfung des Flusses und einer Verlängerung der Mikrotubuli, die insbesondere entlang der Achse der Wechselwirkung mit der Perle sichtbar ist.

Um die Dynamik des Cytoskeletts in Wachstumskonen zu analysieren, verwenden wir die fluoreszierende Fleckenmikroskopie. Wir injizieren fluoreszenzmarkierte Tubulin- und Aktin-Proben in den neuronalen Zellkörper und erstellen Zeitrafferaufnahmen. Von den dynamischen Bewegungen des Cytoskeletts wird das in Rot dargestellte Material entlang der vorderen Kante aufgebaut, durch retrograden Fluss nach hinten verlagert und in der Übergangszone wiederverwertet.

Dynamische Mikrotubuli, dargestellt in Grün, erforschen die Wachstumsperipherie durch eine Kombination aus Assemblierung und Translokationsverhalten. Die geringe Menge an Markierung führt zu einem punktförmigen Muster, das es uns ermöglicht, quantitativ verschiedene Parameter der Zytoskelettdynamik zu analysieren. Wir haben Ihnen gezeigt, wie man primäre Neuronen isoliert, kultiviert und bildlich darstellt, falls Sie hochauflösende Aufnahmen von neuronalen Wachstumskonen anfertigen möchten.

Dies ist tatsächlich das System der Wahl aufgrund der großen Größe der Wachstumskegel, der klar definierten zytoplasmatischen Regionen und des gut beschriebenen Cytoskeletts. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.