Name: Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochenmark, Thymus und humanem Thymusgewebe. Diese optimierten Protokolle ermöglichen Single-Cell-Multiomik-Analysen für die Hämatopoiese-Forschung.

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Wir wurden von der HSCI-CRM-Einrichtung für Durchflusszytometrie am Massachusetts General Hospital und der Bauer Core Facility an der Harvard University mit fachkundiger technischer Unterstützung unterstützt. T.K und K.G wurden vom Schwedischen Forschungsrat und C.M. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir danken Sergey Isaev und I-Hsiu Lee für die Unterstützung bei der Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten.

Optimierung der Isolierung von Stromazellen aus Thymus und Knochenmark

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</ol>

D.T.S. ist Direktor und Anteilseigner von Agios Therapeutics und Editas Medicines; Gründer, Direktor, Anteilseigner und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Magenta Therapeutics und LifeVault Bio, Aktionär und Gründer von Fate Therapeutics und Garuda Therapeutics sowie Direktor, Gründer und Gesellschafter von Clear Creek Bio, Berater für FOG Pharma, Inzen Therapeutics und VCanBio sowie Empfänger von gesponserten Forschungsgeldern von Sumitomo Dianippon. D.T.S und K.G sind Erfinder von Patenten US20220143099A1.

Stromazellen in hämatopoetischen Organen sind entscheidend für die normale Blutproduktion, und hämatopoetische Stromastörungen können zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen der hämatopoetischen Aufrechterhaltung und der Reaktion auf Stress führen 9,23,24. Der Einblick in hämatopoetische Stromazellen ist essentiell für das Verständnis hämatologischer Erkrankungen 7,9,10,24 und für die Fähigkeit, Therapeutika zu ihrer Bekämpfung zu entwickeln25,26. Die reproduzierbare Trennung von hämatopoetischem Stroma und Parenchym ist jedoch eine Herausforderung, insbesondere mit dem Aufkommen der Einzelzell-Multiomik, die qualitativ hochwertige Probenvorbereitungen erfordert und gleichzeitig die Ausbeute und Vielfalt der Stromazellen maximiert. Die hier beschriebenen Protokolle wurden so optimiert, dass sie mit den meisten nachgelagerten Multiomics-Anwendungen kompatibel sind und gleichzeitig die Herausforderungen bei der Isolierung hämatopoetischer Stromazellen meistern 1,2,19.
Der erste Punkt, der bei der Isolierung von hämatopoetischen Stromazellen zu berücksichtigen ist, sind die Dissoziationsbedingungen. Eine optimale Dissoziation ist entscheidend, um Stromazellen aus dem Gewebe freizusetzen, um die volle Heterogenität des Stromakompartiments widerzuspiegeln 1,2. Die Wahl des richtigen Dissoziationsmixes hängt vom experimentellen Umfang und den nachgelagerten Protokollen ab. Wir empfehlen, Dissoziationsmischungen so frisch wie möglich zuzubereiten und bis zur Verwendung auf Eis zu legen. Einige Komponenten, wie z. B. Dispase, lassen sich schwer auflösen und benötigen möglicherweise mehr Zeit für das Mischen der Pipette. Das Vortexen wird nicht empfohlen, da dies die native Konformation der Verdauungsenzyme stören und letztendlich zu deren Inaktivierung führen kann. Wichtig ist, dass EDTA die enzymatische Aktivität hemmt und während aktiver Verdauungsschritte vermieden werden sollte, aber zur Beendigung der Reaktion eingesetzt werden kann, wenn das enzymhaltige Puffer nicht sofort entfernt werden kann. Neben der Enzymmischung selbst sind zwei Punkte entscheidend für eine effiziente Dissoziation des Gewebes: (1) gründliches Zerkleinern und Schneiden, um die Oberfläche zu vergrößern, und (2) ausreichende Inkubationszeit mit den Verdauungsenzymen. Menschliches Thymusgewebe ist zum Beispiel deutlich schwerer zu dissoziieren als murines Gewebe, und die Verdauungszeiten müssen daher länger sein. Wenn keine Anpassung für menschliches Gewebe vorgenommen wird, verringern sich die Stromaausbeute und die Zellvielfalt (Abbildung 2A). Dissoziationsenzyme benötigen eine optimale Temperatur von 37 °C, was unweigerlich die Genexpression beeinflusst27. Obwohl eine Dissoziation bei kalter oder niedrigerer Temperatur wünschenswert wäre, um Zellzustände zu erhalten, gibt es derzeit keine kommerziell erhältlichen Enzymkombinationen mit kälteaktiver Dissoziation, die für Knochen und Knochenmark geeignet sind. Bei jedem Gewebe, das verdaut werden muss, ändern sich die Heterogenität und der prozentuale Beitrag, der von verschiedenen Zelltypen erworben wird, unweigerlich mit der Verdauungszeit, der Zusammensetzung des Enzymcocktails und der Verarbeitung. Nach diesen ersten Schritten wird die Heterogenität und Repräsentation durch Filtrationsschritte wie Düsengrößen während der Sortierung und Erfassung anspruchsvoller Zelltypen (z. B. Adipozyten aus Stroma) und fluidische Kanaldurchmesser weiter eingeschränkt. Daher sollten wir beim Vergleich von Datensätzen berücksichtigen, dass sich diese Unterschiede in den Protokollen auf die Darstellung von Subpopulationen auswirken können. Daraus folgt logischerweise, dass wir bei der Messung der Auswirkungen von Störungen in stromalen Systemen darauf achten müssen, dass die Verarbeitungsschritte gleich bleiben.
Während die Kosten für die Sequenzierung gesunken sind und sinken, sind Einzelzelltechnologien oft durch die Anzahl der zu analysierenden Zellen begrenzt. Um die Kapazität jedes Reagenzienkits zu optimieren, wurde nach Möglichkeit eine hämatopoetische zellmagnetische Depletion eingesetzt. Dies ermöglicht die Vermeidung einer hohen Anzahl von Schadstoffzellen, die sowohl in den Knochenmark- als auch in den Thymusprobenfraktionen viel zahlreicher sind als das Stroma. Ist das Ausgangsmaterial jedoch begrenzt, wie im Fall von Thymusgewebe nach der Transplantation, kann der erhöhte, unspezifische Zellverlust, der bei magnetischen Depletionsstrategien immer zu Lasten kommt, dies nicht ratsam machen. Darüber hinaus entsteht bei der Vorbereitung und Verdauung des Gewebes durch das Zerkleinern, Schneiden und die enzymatische Freisetzung von extrazellulären Matrixkomponenten eine große Menge an Ablagerungen. Diese Art von Verunreinigung kann, wenn sie zur Analyse in der Probe verbleibt, Verstopfungsprobleme bei der nachgelagerten Verarbeitung verursachen, negative Vertiefungen für die Einzelzellindexsortierung verursachen und die Prozentsätze des übergeordneten Tors in der Analyse stark aufblähen. Die Calcein-Färbung wurde verwendet, um positiv für Zellen/lebende Zellen zu gaten. Calcein ist in verschiedenen Farben erhältlich, wodurch es sich sehr gut an Ihre Färbematrix anpasst. Achten Sie bei der Arbeit mit Calcein darauf, den Farbstoff nicht wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen auszusetzen (d. h. immer frisch zubereiten und nach dem Auflösen bei Raumtemperatur aufbewahren).
Die Möglichkeit, Proben auf der Grundlage von Antikörpern zu multiplexen, die mit DNA-Oligos28 barcodiert sind, ermöglicht einen erhöhten Nutzen von Einzelzellsequenzierungsreaktionen auf Plattformen wie 10x Genomics. Die Hashtagging-Antikörper, die für das Probenmultiplexing entwickelt wurden, haben unterschiedliche Ziele für Zelloberflächenmoleküle oder die Kernmembran und sind sowohl für Maus als auch für Mensch spezifisch. Während das Zell-Hashtagging-System erfolgreich für mehrere Gewebe eingesetzt wurde, können Experimente, die Verdauungsenzymmischungen mit der anschließenden Verwendung von Hashtags kombinieren, zu einer drastisch reduzierten Genesung führen. Wir haben versucht, zusätzliche Waschschritte nach der Dissoziation einzubauen und EDTA hinzuzufügen, um die Aktivität der Verdauungsenzyme zu hemmen. Selbst bei diesen Schritten ist jedoch eine geringere Hashtag-Identifizierung zu erwarten als bei hämatopoetischen Zellen. Es wurde festgestellt, dass bei enzymatischen Verdauungsprotokollen die Hashtag-Erfassungsraten zwischen 30 % und 70 % lagen. Dies geschieht trotz der Tatsache, dass derselbe Antikörperklon mit einem Fluorochrom-Konjugat >90 % der Stromazellen in derselben Population markiert ist. Jedes experimentelle Design, das die enzymatische Verdauung von Gewebe mit Hashtagging kombiniert, sollte pilotiert werden, und es sollte Vorsicht walten lassen, um eine enzymatische Hemmung zu gewährleisten.

Beim gesunden Erwachsenen findet die De-novo-Produktion von Blutzellen im Knochenmark und im Thymus statt. Stromazellen an diesen Stellen sind für die Aufrechterhaltung der Hämatopoese unerlässlich, aber das Stroma macht weniger als 1 % des Gewebes aus 1,2,3,4. Die Gewinnung reiner Hämatopoese-Isolate, die das Stroma unterstützen, stellt daher eine große Herausforderung dar, insbesondere für die Einzelzell-Multiomik, die eine zweckmäßige Verarbeitung erfordert, um Proben von hoher Qualität zu erhalten. Komponenten verschiedener Verdauungscocktails können bestimmte Schritte in der Multiomics-Analyse beeinträchtigen 5,6. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben die Isolierung einer Vielzahl von Stromazellen aus Knochenmark- und Thymusgewebe.
Störungen der stromalen Bestandteile sowohl im Knochenmark als auch im Thymus führen zu einer tiefgreifenden Störung der Entwicklung der Blutzellen und können zu Malignomen führen 7,8,9. Die Hämatopoese, die das Stroma unterstützt, wird nach zytotoxischer Konditionierung und Knochenmarktransplantation geschädigt, was zu einer verminderten Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren führt, die hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) erhalten2,10,11. Darüber hinaus wirkt sich das Altern auf Knochenmark- und Thymusstromazellen aus, die wahrscheinlich zu gealterten hämatopoetischen Phänotypen beitragen. Der Thymus ist das erste Organ, das einer großflächigen altersbedingten Involution unterzogen wird. Fett und fibrotisches Gewebe beginnen bereits zu Beginn der Pubertät mit dem Ersatz des T-Zell-unterstützenden Stromas12,13. Im Knochenmark nimmt der Adipozytengehalt mit dem Alter zu und die vaskulären und endostalen Nischen werden signifikant umgebaut 14,15,16.
Um die Untersuchung des hämatopoese-unterstützenden Stromas über mehrere Stresszustände hinweg und im Falle des Thymus sowohl des menschlichen als auch des murinen Gewebes zu ermöglichen, haben wir die zuvor veröffentlichten Verdauungsprotokolleoptimiert 1,2,8,17,18. Diese Protokolle gewährleisten eine effiziente und reproduzierbare Isolierung von Zellen und sind mit der Einzelzell-RNAssequenzierung (scRNAseq) und anderen Arten von Multiomics kompatibel.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Mäuse</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>Männchen oder Weibchen, 8-12 Wochen alter</td></tr><tr><td>Calcein&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Corning Sterile Zellsiebe, weiß, Maschenweite: 70 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&nbsp; 2500 U/mL</td></tr><tr><td>Easysep Maus Streptavidin RapidSpheres Isolationskit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>Qualifizierter One-Shot-Human-Fc-Block</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>Sigma 5401127001</td><td>Research Grade Medium</td></tr><tr><td>199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protektor RNase Inhibitor</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD11b-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD45.2-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus für Ratte CD45R/B220-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus für Ratte CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus für Ratte EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Mittel für Ratten Ter119-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Mittel für Ratten Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Mittel Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&nbsp;</td><td>Biochemisches</td><td>LS004107</td><td></td> von Worthington</tr></tbody></table>

isolierung von stromazellen aus hämatopoetischen organen

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Die Einzelzellsequenzierung hat die Kartierung heterogener Zellpopulationen im Stroma hämatopoetischer Organe ermöglicht. Diese Methoden bieten eine Linse, durch die bisher ungelöste Heterogenität im stationären Zustand sowie Veränderungen in der Zelltyprepräsentation, die durch extrinsische Belastungen oder während des Alterns induziert werden, untersucht werden können. Im Folgenden stellen wir schrittweise Protokolle für die Isolierung hochwertiger stromaler Zellpopulationen aus murinem und humanem Thymus sowie aus murinem Knochen und Knochenmark vor. Zellen, die durch diese Protokolle isoliert werden, eignen sich für die Generierung hochwertiger Einzelzell-Multiomics-Datensätze. Die Auswirkungen des Probenverdaus, der Depletion der hämatopoetischen Abstammungslinie, der FACS-Analyse/-Sortierung und wie diese Faktoren die Kompatibilität mit der Einzelzellsequenzierung beeinflussen, werden hier diskutiert. Anhand von Beispielen von FACS-Profilen, die eine erfolgreiche und ineffiziente Dissoziation und nachgeschaltete Stromazellausbeuten in der Postsequenzierungsanalyse anzeigen, werden erkennbare Hinweise für die Benutzer bereitgestellt. Die Berücksichtigung der spezifischen Anforderungen von Stromazellen ist entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, die das Wissen auf diesem Gebiet voranbringen können.

Diese Protokolle liefern reproduzierbare Stromazellsorten aus dem Thymus und dem Knochenmark, die für die durchflusszytometrische Analyse sowie für Einzelzell-Multiomics, wie z. B. die scRNA-Sequenzierung, geeignet sind. Das murine Thymusgewebe erfährt als Reaktion auf Stressfaktoren wie die zytotoxische Konditionierung, die der Knochenmarktransplantation vorausgeht, oder den natürlichen Alterungsprozess einen erheblichen Umbau. Infolgedessen ist die Thymuszellularität in beiden Fällen drastisch reduziert (Abbildung 1A). Während ein Thymus einer 8 Wochen alten Wildtyp-Maus etwa 100 Millionen Zellen enthält, kann man davon ausgehen, dass die Zellularität einer 2-jährigen Maus die Hälfte davon beträgt, und ein Thymus 4 Tage nach der Bestrahlung und Knochenmarktransplantation kann nur 5.00.000 Zellen umfassen (Abbildung 1A).
Bei der zytotoxischen Konditionierung werden hämatopoetische Zellen bevorzugt abgetragen, so dass das Stromakompartiment proportional angereichert wird (Abbildung 1B). Die insgesamt geringe Zellularität wird jedoch die Isolierung einer ausreichenden Anzahl von Thymusstromazellen erschweren. Es kann daher erforderlich sein, Tiere zu poolen, um Zellnummern zu erhalten, die mit nachgelagerten Multiomics-Anwendungen kompatibel sind, und um den Materialverlust so weit wie möglich zu minimieren. Um Multiomics an thymusischen Stromazellen durchzuführen, stellt die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von lebenden, einzelnen CD45-Ter119-Zellen (Abbildung 1C) sicher, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen unter den meisten Stressbedingungen sortiert werden kann.
Um die Heterogenität des Stromakompartiments zu erhalten, sortieren wir in der Regel nicht nach einem einzigen positiven Stromamarker, sondern schließen hämatopoetische Zellen aus. Die Einbeziehung positiver Stromazellmarker wird weiterhin für die Analyse empfohlen, um sicherzustellen, dass eine ordnungsgemäße Gewebedissoziation erreicht wurde. Die FACS-Isolierung ist jedoch nicht perfekt, und wie durch scRNAseq bestimmt, sind 30%-50% der sortierten Zellen hämatopoetischen Ursprungs (Abbildung 1D,E). Dies kann durch magnetische Depletion von CD45+-Zellen vor der FACS verbessert werden; Dies wird jedoch nicht für Bedingungen mit reduzierter Thymuszellularität empfohlen (Abbildung 1A), da der Materialverlust, der mit der zusätzlichen Verarbeitung der magnetischen Verarmung einhergeht, dazu führt, dass die Stromaausbeute für nachgelagerte Anwendungen zu niedrig ist.
Für die Isolierung des menschlichen Thymusstromas ist der enzymatische Verdau der kritischste Schritt. Wenn der Dissoziationsschritt überstürzt wird, wird die Gesamtausbeute der Stromazellen sowie die Repräsentation des Stromazell-Subtyps stark verringert (Abbildung 2A). Es wird auch empfohlen, immer die Marker des Thymusendothels und des Epithels einzubeziehen, um sicherzustellen, dass die Gewebeverdauung optimal war, da ein einfaches Gating negativ auf hämatopoetische Marker nicht ausreicht, um die tatsächliche Freisetzung von Stromazellen zu messen. Dies ist in Abbildung 2A beispielhaft dargestellt, wo der Prozentsatz der Zellen, die negativ für hämatopoetische Marker sind, in der Probe, die 30 Minuten lang verdaut wurde, höher ist als in der Probe, die 90 Minuten lang inkubiert wurde. Wie jedoch im konsekutiven Gate zu sehen ist, ist die Ausbeute an Endothel- und Epithelzellen im kürzeren Verdauungsprotokoll sehr gering (Abbildung 2A).
Für die FACS-Isolierung von humanen thymischen Stromazellen für Multiomics-Anwendungen wird zusätzlich zum panhämatopoetischen Marker CD45 und dem erythroiden Marker CD235a (Abbildung 2B) die Färbung mit einem hämatopoetischen Antikörpercocktail sowie CD4- und CD8-Antikörpern empfohlen, um die Anreicherung der Stromazellen zu verbessern. Daher sollten für die humane Multiomics-Analyse des Thymusstromas lebende, einzelne CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8-Zellen FACS-sortiert werden (Abbildung 2B). Wie bei scRNAseq von murinen Proben zu sehen ist, führt dies immer noch zu einer Kontamination von 30 % bis 50 % hämatopoetischen Zellen, aber dies führt immer noch zu einer akzeptablen Auflösung des menschlichen Thymus-Stromakompartiments (Abbildung 2C, D).
Für Knochen- und BM-Stroma wurde die gleiche Strategie wie für Thymusgewebe angewendet; Stromazellen werden durch Gating an Zellen isoliert, die negativ für hämatopoetische Marker sind, und weitere Stromazellmarker werden als Verdauungskontrollen eingeschlossen (Abbildung 3). Die Dissoziation von verkalktem Gewebe wie Knochen führt zu einer erheblichen Ansammlung von Ablagerungen. Die Zugabe von Calcein als Viabilitätsfarbstoff ermöglicht den Ausschluss des größten Teils dieser Ablagerungen, die sonst fälschlicherweise sortierte Zahlen aufblähen und die Häufigkeit der Gated-Population verringern (Abbildung 3). Dies wird in den FACS-Diagrammen veranschaulicht, in denen das Gating auf allen Zellen und nur das Gating auf Calcein+ verglichen wird (Abbildung 3). Wie bei humanen thymusförmigen Stromazellen ist der Prozentsatz der hämatopoetischen markernegativen Zellen kein zuverlässiger Messwert für die Dissoziationseffizienz von Knochen und BM-Gewebe (Abbildung 3). Während das CD45-Ter119-Gate eine große Anzahl von Zellen in einer Probe enthalten kann, bei denen der Verdauungsschritt fehlgeschlagen ist, zeigen weitere Analysen der typischen Knochen- und BM-Stromazellmarker CD31, CD140a und CD51 eindeutig eine schlechte Stromafreisetzung (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Für die FACS-Isolierung von murinen Knochen- und BM-Stromazellen wird die Verwendung der Gating-Strategie wie in Abbildung 3 empfohlen, bei der wir nur CD45-Ter119-Calcein+ sortieren, aber die Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften und die Stromazellmarkerexpression der sortierten Population überwachen, um einen optimalen Verdau zu gewährleisten (Abbildung 3A). Die Kombination aus hämatopoetischer Abstammungslinien-positiver magnetischer Zellverarmung des Knochenmarks vor der FACS und Sortierung auf den gezeigten Gates führt zu einer Einzelzellsequenzierung von Zellen, die &gt;90% Stroma sind. Ein Beispiel für einen solchen scRNA-Seq-Lauf (Abbildung 5A,B) verdeutlicht diese geringe hämatopoetische Kontamination nach transkriptombasierter Annotation der analysierten Zellen (Beispiele für hämatopoetische Markergene Abbildung 5C). Dies steht in krassem Gegensatz zu den Thymusstromapräparaten, bei denen die magnetische Zellverarmung vor dem Sortierschritt aufgrund des begrenzten Ausgangsmaterials im Thymusgewebe nach der Transplantation nicht durchgeführt wurde (Abbildung 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg"> Abbildung 1: Durchflusszytometrische und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse des murinen Thymusstromas. (A) Quantifizierung der Thymozytenzahlen bei 8 Wochen alten Mäusen (Kontrolle), 8 Wochen alten Mäusen, die 4 Tage zuvor letal bestrahlt und transplantiert wurden (Transplantation) und 2-jährigen Mäusen (gealtert). (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme, die die Anreicherung bei Stromazell-Subtypen 4 Tage nach letaler Bestrahlung und Transplantation zeigen. (C) Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Sortierung des murinen Thymusstromas für die Einzelzell-Multiomics-Analyse. (D) UMAP des murinen Thymus mit Stroma (blau) und hämatopoetischen Zellen (rot). (E) UMAPs, die murine hämatopoetische Markergene in Thymusproben zeigen. (F) Quantifizierung von murinen stromalen und hämatopoetischen Zellen in Thymus-scRNAseq-Proben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg"> Abbildung 2: Durchflusszytometrische und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse des humanen Thymusstromas. (A) FACS-Diagramme zeigen repräsentative Ergebnisse des Einflusses unterschiedlicher Verdauungszeiten auf die Freisetzung humaner Thymusstromazellpopulationen. (B) Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Sortierung des menschlichen Thymusstromas für die Einzelzell-Multiomics-Analyse. (C) UMAP des menschlichen Thymus mit Angabe von Stroma (blau) und hämatopoetischen Zellen (rot). (D) UMAPs, die humane hämatopoetische Markergene in Thymusproben zeigen. (E) Quantifizierung von menschlichen stromalen und hämatopoetischen Zellen in Thymus-scRNAseq-Proben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg"> Abbildung 3: Mausine Knochenmarkstromamarker und Calcein sind hilfreich für die Abschätzung der Dissoziationseffizienz. (A) Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von CD45-Ter119-murinen Knochenmarkstromazellen, die auf allen Zellen und Calcein+-Zellen fixiert sind. Mit anschließendem CD31-Gating zeigte sich ein höherer Anteil an CD140a+CD51+ Zellen bei der Selektion von Calcein+ Zellen. (B) Durchflusszytometrische Analyse, die repräsentativ für eine fehlgeschlagene Knochenverdauung mit fehlenden CD140a+CD51+-Zellen ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg"> Abbildung 4: Gating-Strategie für das Knochenmarkstroma. (A) Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Sortierung des murinen Knochenmarkstromas für Einzelzell-Multiomics. (B) Durchflusszytometrische Analyse, die repräsentativ für einen fehlgeschlagenen Knochenmarkverdau mit fehlenden CD140a+CD51+-Zellen ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg"> Abbildung 5: Einzelzell-RNA-Sequenzierung des Knochenmarks mit stromaler und hämatopoetischer Zellzusammensetzung. (A) UMAP von murinen Knochen und Knochenmark mit Angabe von Stromazellen (blau) und hämatopoetischen Zellen (rot). (B) Quantifizierung von stromalen und hämatopoetischen Zellen in murinen Knochen- und Knochenmarkproben. (C) UMAP von hämatopoetischen Markergenen in Knochenmarkproben von Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Die Entwicklung von hämatischen Zellen im Knochenmark und im Thymus ist in hohem Maße von Stromazellen zur Unterstützung abhängig. Störungen der Funktion der hämatopoetischen Stromazellen können zu einer ineffizienten oder sogar bösartigen Blutproduktion führen. Unser Labor konzentriert sich auf das Verständnis der Stromazellregulation der Hämatopoese und darauf, wie sie für therapeutische Zwecke manipuliert werden kann.Das Aufkommen der Einzelzellsequenzierung hat zu einer Kaskade von jüngsten Fortschritten in vielen Forschungsbereichen geführt. Dies ist auch in unserem Fachgebiet der Fall, wo die Einzelzellauflösung die Identifizierung heterogener Stromazellpopulationen in hämatopoetischen Organen ermöglicht hat, die bisher unbekannt waren. Unsere Protokolle sind darauf ausgelegt, und wir hoffen, dass sie mehr Forschung an Stromazellen ermöglichen werden, um kritische Fragen in diesem Bereich zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

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Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

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Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

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