Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Müllerzellen sind die wichtigsten Gliazellen der Netzhaut. Sie spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der hochmetabolisch aktiven Neuronen der Netzhaut. Unser Labor hat eine Technik entwickelt, um Müller-Zellen aus Mausaugen zu isolieren. Diese Technik wird es ermöglichen, die Rolle von Müller-Zellen bei verschiedenen Netzhauterkrankungen zu untersuchen, die Pathogenese von Krankheiten zu verstehen und auch therapeutische Ziele zu entwickeln.

[Erzähler] Euthanasieren Sie die Maus ethisch gemäß den von Ihrer Institution genehmigten Methoden. Enukleieren Sie die Augen, indem Sie eine Pinzette im 5/45-Stil auf den Orbitalbereich drücken, um eine Proptosis, gefolgt von einer Extraktion des Auges, indem Sie die Arme der Pinzette am hinteren Ende des Auges positionieren, gefolgt von einem sanften Ziehen aus dem Orbitalbereich. Legen Sie die Augen in 10 ml der Müller-Zell-Augenlösung und lassen Sie sie über Nacht oder etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur ruhen. Nach 18 Stunden dekantieren Sie die Augenlösung, indem Sie sie aus der Tube gießen, um sie zu entsorgen. Waschen Sie die Augen mit erwärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Dekantieren Sie das PBS erneut, indem Sie es aus der Tube gießen, um es zu entsorgen. Legen Sie dann die Augen in eine 100-Millimeter-Petrischale, die 10 ml der Trypsinlösung enthält. Stellen Sie das Gericht in einen Inkubator und inkubieren Sie es 1,5 bis 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation werden die Augen in eine 60-Millimeter-Petrischale gegeben, die etwa fünf ml des vollständigen primären Müller-Zellwachstumsmediums enthält. Es ist erwähnenswert, dass das Video außerhalb der Motorhaube aufgenommen wurde, um eine bessere Sichtbarkeit und eine klare Demonstration zu gewährleisten. Für tatsächliche Experimente sollten sie wie gezeigt in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Legen Sie die Augen unter ein Präpariermikroskop und beginnen Sie mit dem Präparieren. Verwenden Sie eine Pinzette im M5S-Stil und eine Vannas-Schere, um Bindegewebe, extraokulare Muskeln und den Sehnerv zu entfernen. Hier wird der Sehnerv mit einer Vannas-Schere durchtrennt. Fassen Sie das Auge mit einer Pinzette im M5S-Stil und machen Sie mit einer Vannas-Schere oder der Nadel einer Spritze einen Schnitt in den Ora-Serrata-Bereich. Fassen Sie den Schnitt mit zwei Pinzetten im M5S-Stil und beginnen Sie, die Hornhaut aus dem hinteren Teil des Auges zu ziehen oder zu reißen. Ziehen Sie in kleinen Schritten, um sicherzustellen, dass die Integrität der Netzhaut intakt bleibt. Hier ist eine Demonstration, wie man die Hornhaut aus dem hinteren Teil der Augenmuschel entfernt. Sobald die Linse und die neuronale Netzhaut freigelegt sind, entfernen Sie die pigmentierte Schicht des Auges, an der wahrscheinlich die Iris haftet. Entfernen Sie dann die neuronale Netzhaut von der Linse. Entfernen Sie jegliches pigmentierte Gewebe von der neuralen Netzhaut, um die Reinheit der Isolierung zu verbessern. Angesichts der klebrigen Natur der neuronalen Netzhaut ist es unwahrscheinlich, dass Sie das gesamte pigmentierte Gewebe entfernen. Sammle alle neuralen Netzhäute und zerreiße sie in kleinere Stücke. Die neurale Netzhaut wird in einen T25-Kolben mit vier ml vollständigem primärem Müller-Zell-Wachstumsmedium gelegt. Zum Schluss stellen Sie den Kolben in einen Inkubator und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Panel A zeigt eine gesunde Müller-Zellkultur bei Passage Null und Passage eins. Das Fehlen von Pigmenten deutet auf das Fehlen von RPE-Zellen hin, die die primäre Verunreinigung in der Isolierung darstellen. Dies wird in Panel B mit RP65, einem RP-spezifischen Marker, verstärkt.