Name: RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Lernen Sie die RNA-Interferenz-Methode für Genregulationsstudien bei Trichogramma dendrolimi kennen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen in kleinen parasitoiden Wespen.

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Diese Forschung wurde von den Projekten der National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), dem Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) und Central Funds Guiding the Local Science and Technology Development (XZ202301YD0042C) finanziert.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten, Software und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Sammlung und Pflege von Insektenkulturen
<ol><li>Kleben Sie eine Gruppe von ~5.000 Eiern Corcyra cephalonica (Stainton) auf eine 9 cm x 16 cm große Karte mit einer 1:5 (v/v) Lösung aus Gummi arabicum-Pulver und Wasser25,26. HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Wirtseier an der Karte anzubringen, da die Überfüllung sie für nachfolgende Transfer- und Seziervorgänge unpraktisch macht.</li>
	<li>Um das Schlüpfen von Wirtseiern zu verhindern, setzen Sie die Wirtseikarten 30 Minuten ultravioletter (UV) Bestrahlung aus (Abbildung 1-i). Schneiden Sie anschließend das Papier mit inaktivierten Eiern in Eierkarten mit einer Dicke von 1 cm und einem Durchmesser von 8 cm, die jeweils etwa 300-500 Eier enthalten (Abbildung 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Führen Sie eine Kohorte von 80-120 T. denrolimi-Wespen in ein Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Länge von 8 cm ein. Verschließen Sie den Schlauch mit Baumwolle. HINWEIS: Halten Sie die Wespen bei einer Temperatur von 25 ± 1 °C, mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit und halten Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von ca. 75 % aufrecht.</li>
	<li>Legen Sie den Wespen eine Wirtsei-Karte zur Parasitierung vor (Abbildung 1-ii). Lassen Sie die Wespen ihre Eier 6 Stunden lang in die Wirtseier legen, danach entfernen Sie die Wespen sofort. HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Verlängerung der Parasitierungsperiode, da dies zu einer Überfüllung der Nachkommen von T. denrolimi in einem Wirtsei führen kann, was zu einer erhöhten Wespensterblichkeit der Nachkommen führenkann 28,29.</li>
</ol>2. Synthese von dsRNA
<ol><li>Design-Primer-Sets mit einem T7-Promotor für die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Wählen Sie ein 300-400 bp-Segment aus dem Zielgen (Ferhch) für die dsRNA-Synthese.</li>
	<li>Beschaffung kommerziell synthetisierter Primer-Sets für die Herstellung von dsRNA für das Zielgen undds-GFP zur Verwendung als Negativkontrolle.</li>
	<li>Extrahieren Sie den RNA-Gehalt von 100 T. denrolimi-Wespen mit dem referenzierten Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers9. Überprüfen Sie die Qualität des RNA-Gehalts; Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,09 liegt.</li>
	<li>Reinigen Sie den RNA-Gehalt mit 2 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl DNAse (1 U/50 μl) und 6,5 μl RNA (~100 ng/μl), 0,5 μl H2O bei 42 °C für 2 min.</li>
	<li>Führen Sie eine Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durch, um ein cDNA-Template mit 10 μl gereinigter RNA (~100 ng/μl), 4 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl Enzymmix I (1 U/50 μl) und 4 μl H2O zu erzeugen. Führen Sie die RT-PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 37 °C für 15 min, 85 °C für 5 s. Lagern Sie das cDNA-Produkt bis zur Verwendung bei -4 °C.</li>
	<li>Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die dsRNA-Sequenzen gemäß dem referenzierten Mastermix zu amplifizieren (10 μl Taq II [1 U/50 μl], 0,8 μl Vorwärtsprimer [0,4 μM], 0,8 μl Reverse-Primer [0,4 μM], 0,8 μl DNA-Template [40 ng/μl] und 7,6 μl H2O). Führen Sie die PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 94 °C für 2 Minuten; 35 Zyklen mit 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 30 s; 72 °C für 2 Min.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Qualität von PCR-Produkten durch Elektrophorese auf einem 2,0%igen Agarosegel 5,9 und bestätigen Sie die Zielsequenz durch Sanger-Sequenzierung.</li>
	<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem Gel-Extraktionskit gemäß den Richtlinien des Herstellers 9,23.</li>
	<li>Verwenden Sie ein RNAi-System zur Synthese von dsRNA für das Zielgen mit 10 μl 2x-Puffer (0,02 U/μl), 8 μl DNA-Template (75 ng/μl) und 2 μl Enzymmischung (1 U/50 μl) mit den folgenden Einstellungen: 37 °C für 30 min, 70 °C für 10 min und 25 °C für 20 min. Eluieren Sie die synthetisierte dsRNA mit 30 μl nukleasefreiem Wasser.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts, indem Sie es auf einem 1,0%igen Agarosegelvisualisieren 5,9. Verdünnen Sie die dsRNA auf 7.000 ng/μl. Überprüfen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts. Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,09 liegt. Lagern Sie das dsRNA-Produkt bis zur Verwendung bei -20 °C.</li>
</ol>3. Transplantation von T. denrolimi-Puppen 
<ol><li>Kultivieren Sie die parasitierten Wirtseier etwa 8 Tage lang bei 25 ± 1 °C und halten Sie dabei einen 16-stündigen Licht-/8-Stunden-Dunkelzyklus und eine relative Luftfeuchtigkeit von ~75 % ein. Die parasitierten Wirtseier werden nach 5 Tagen schwarz30 (Abbildung 1-iv,v).</li>
	<li>Übertragen Sie die Wirtseikarte in ein Seziermikroskop. Verwenden Sie ein Paar Wolframnadeln (Abbildung 1-vi), um das Chorion sorgfältig aus den Wirtseiern zu entfernen (Abbildung 1-vii) und die Puppe von innen zu entnehmen (Abbildung 1-viii)5,17,18. HINWEIS: Die Spitze der Präpariernadel sollte weniger als 0,05 mm betragen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine saubere Platte für den Untergrund vor. Gießen Sie 10-15 ml einer 15 g/l Agarlösung aus und lassen Sie sie auf natürliche Weise abkühlen (Abbildung 2-i). HINWEIS: Mischen Sie die Agarlösung mit 0,5 g Streptomycin, um das Wachstum von Verunreinigungen in vitro zu hemmen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen desinfizierten Stichel, um mehrere Rillen mit einer Tiefe von 0,2 bis 0,3 mm und einer Breite von 0,4 bis 0,8 mm zu ätzen (Abbildung 2-ii).</li>
	<li>Verwenden Sie eine kleine Bürste (Abbildung 2-iii), um eine Puppe aus dem sezierten Wirtseier in eine der Rillen auf dem Agarsubstrat zu transplantieren (Abbildung 2-iv).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 und verpflanzen Sie nacheinander 100-300 Puppen einzeln in die Rillen (Abbildung 2-v).</li>
</ol>4. Mikroinjektion von dsRNA in T. denrolimi-Puppe
<ol><li>Verwenden Sie einen Glasnadelzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen (Abbildung 3-i, ii). Stellen Sie die Hitze auf 280, die Geschwindigkeit auf 170, die Verzögerung auf 250 und den Zug auf 30 an einem Nadelabzieher ein (Abbildung 3-iii). Bereiten Sie mehrere Kapillarglasnadeln für die Mikroinjektion vor (Abbildung 3-iv,v).</li>
	<li>Schrägen Sie die Spitze der Glasnadel mit einer Schleifplatte ab (Abbildung 3-vi). Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Injektionsnadel scharf bleibt; Andernfalls kann es zur Puppensterblichkeit führen oder den Reagenzfluss durch die Nadel behindern (Abbildung 3-vii).</li>
	<li>Laden Sie etwa 2 μl der dsRNA-Injektionslösung mit 7.000 ng/μl mit einer Mikroinjektionspumpe in die vorbereitete Injektionsnadel (Abbildung 3-vii).</li>
	<li>Übertragen Sie das Agarsubstrat mit Hunderten von Puppen auf die Plattform eines Verbundmikroskops (Abbildung 3-viii).</li>
	<li>Führen Sie die Injektionsnadel vorsichtig in einem Winkel von ~30° zum Bauch unter der Linse in den Bauch einer T. denrolimi-Puppe ein (Abbildung 3-ix).</li>
	<li>Nach und nach ~5 nL der Injektionslösung (Schritt 4.3) so sanft wie möglich in die T. denrolimi-Puppe injizieren. HINWEIS: Die T. denrolimi-Puppe kann leicht anschwellen, wenn die dsRNA-Lösung injiziert wird. Das Injizieren einer übermäßigen Menge Lösung in die Puppe oder die Verwendung von Nadeln mit zu großen Öffnungen kann zum vorzeitigen Tod der Puppe führen. Wechseln Sie die Nadeln, wenn sie nach der Injektion mehrerer bis zehn Puppen verstopft sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 und injizieren Sie dsRNA nacheinander in 600 Puppen. HINWEIS: Für eine zuverlässige RT-qPCR-Analyse sollte der RNA-Gehalt aus mindestens 100 Puppen isoliert werden. Injizieren Sie mindestens 600 Puppen für drei Replikate in der dsRNA-Behandlung und drei Replikate in der dsGFP-Negativkontrolle 9.</li>
</ol>5. Inkubation von T. denrolimi-Puppen 
<ol><li>Das Substrat mit den injizierten Puppen wird bei 25 ± 1 °C mit einem Hell-/Dunkelzyklus von 16 h/8 h und ~75 % relativer Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator überführt.</li>
	<li>Inkubieren Sie etwa 700 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung für entweder 24 Stunden oder 48 Stunden. Extrahieren Sie den RNA-Gehalt aus einer Gruppe von 100 Puppen pro Replikat9. HINWEIS: Entfernen Sie die geschrumpften Puppen (tote Puppen) aus den Proben; Andernfalls kann es zu Fehlern beim Nachweis der Genexpression kommen.</li>
	<li>Inkubieren Sie ~50 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung, bis die Wespen schlüpfen (Abbildung 3-x). Notieren Sie die Emergenzrate und die Deformitätsrate.</li>
</ol>6. Nachweis der gezielten Genexpression
<ol><li>Entwerfen Sie das Primer-Set für das Zielgen und die Referenzgene für die RT-qPCR mit einem Design-Tool. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Sequenzen der RT-qPCR-Primer nicht mit der Zielregion der dsRNA überlappen.</li>
	<li>Verwenden Sie das Gen Forkhead Box O (FoxO) als Referenzgen in der RT-qPCR-Analyse. über die Primer von FoxO wurde bereits berichtet9.</li>
	<li>Besorgen Sie sich kommerziell synthetisierte Primer-Sets. Durchführung der RT-qPCR mit 10 μl Taq II (1 U/50 μl), 0,8 μl Vorwärtsprimer (0,4 μM), 0,8 μl Reverse-Primer (0,4 μM), 0,8 μl Template (10 ng/μl) und 7,6 μl H2O. Durchführung der RT-qPCR mit den folgenden Einstellungen: 95 °C für 30 s; 35 Zyklen mit 95 °C für 5 s, 57 °C für 30 s, 72 °C für 30; 95 °C für 10 s; 60 °C für 5 s und 95 °C für 5 s.</li>
	<li>Berechnen Sie den Expressionswert des Zielgens mit der 2-ΔΔCt-Methode 9,25.</li>
	<li>Verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test, um die Expression des Zielgens unter dem Einfluss verschiedener Behandlungen (dsFerhch, dsGFP, Nicht-Injektion) zu analysieren. HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung parametrischer Tests (z. B. t-Test) für Post-hoc-Vergleiche, da die Heteroskedastizität und Nicht-Normalität der Daten zu falschen Schlussfolgerungen führen können25.</li>
</ol>

Weiterentwicklung von RNAi-Techniken in Trichogramma dendrolimi für die Genfunktionsanalyse

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<li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual%2C+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567(2019).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parasitism%3A+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).</li>
<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Trichogramma-Wespen sind als wirksame biologische Bekämpfungsmittel anerkannt, die speziell auf eine Reihe von Lepidoptera-Schädlingen in der Land- und Forstwirtschaft abzielen1. Diese winzigen Wespen durchlaufen ihre unreifen Stadien im Wirtsei, eine Eigenschaft, die bei der Durchführung von RNAi-Experimenten eine Herausforderung darstellt 5,18. Diese Studie bietet einen umfassenden visuellen Leitfaden für die Durchführung von RN...

Trichogramma spp. sind eine Gruppe von Eiparasitoiden, die als hocheffiziente biologische Bekämpfungsmittel gegen ein breites Spektrum von Lepidoptera-Schädlingen in land- und forstwirtschaftlichen Ökosystemen weltweit eingesetzt wurden 1,2,3,4. Die Anwendung von Trichogramma aus Massenzucht bietet einen umweltfreundlichen Ansatz für die nachhaltige Bekämpfung von Schädlingen 5,6,7. Das Verständnis der Molekularbiologie von Trichogramma-Wespen liefert wertvolle Einblicke in die Verbesserung der Massenaufzuchteffizienz und der Feldleistung dieser biologischen Bekämpfungsmittel 8,9 durch die Untersuchung der Methodik der Genregulation und Genom-Editierung10.
Seit der Entdeckung der doppelsträngigen RNA (dsRNA)-vermittelten spezifischen genetischen Interferenz in Caenorhabditis elegans im Jahr 1998 hat sich die RNA-Interferenzmethode (RNAi) zu einem wichtigen genetischen Instrumentarium zur Erforschung der Regulationsmechanismen von Organismen entwickelt, indem sie die Expression von Zielgenen unterdrückt11. RNAi-Experimente sind zu einer Standardmethode geworden, die häufig zur Untersuchung der Genfunktion bei zahlreichen Insektenarten eingesetzt wird12,13. Nichtsdestotrotz stellt die Manipulation von RNAi bei vielen parasitoiden Arten eine gewaltige Herausforderung dar, insbesondere bei denen, die zur Familie der endoparasitären Chalkidoiden gehören 14,15,16. Die RNAi-Methode wurde bei mindestens 13 parasitoiden Spezies dokumentiert: 14,15,16,17,18,19. Unter diesen wurde der RNAi-Ansatz umfassend bei Nasonia-Wespen durchgeführt und ist in allen Entwicklungsstadien anwendbar, einschließlich Embryonen, Larven, Puppen und Erwachsenen 14,15,16. Es ist bemerkenswert, dass Nasonia-Wespen Ektoparasitoide sind, deren Nachkommen sich im Zwischenraum zwischen der Wirtspupa und dem Puparium entwickeln, was ihre Kultivierung in vitro ermöglicht und sie bestimmte Behandlungen wie Mikroinjektionen tolerieren lässt. Im Gegensatz zu Nasonia-Wespen durchlaufen Trichogramma-Individuen ihre gesamte Embryonal-, Larven- und Puppenentwicklung innerhalb des Wirteies. Die Schicht im Embryo- und Larvenstadium (die die dsRNA-Permeabilität beeinträchtigen kann), die Anfälligkeit für Schäden und die Schwierigkeit, in vitro zu überleben, stellen gewaltige Hindernisse dar 20,21,22. Darüber hinaus macht die geringe Größe von Trichogramma-Individuen, etwa ~0,5 mm in der Erwachsenen- oder Puppenlänge, sie äußerst kompliziert, um sie zu manipulieren 20,21,22.
In der vorliegenden Studie skizzieren wir ein umfassendes Verfahren zur Durchführung von RNA-Interferenz-Experimenten (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Verfahren: (1) das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), (2) die Mikroinjektion von T. denrolimi-Puppen, (3) die Transplantation und Inkubation dieser Puppen und (4) den Nachweis des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Das für das RNAi-Experiment ausgewählte Zielgen ist die Ferritin-Schwerketten-Homologie (Ferhch). FerHCH, ein eisenbindendes Protein, enthält ein Ferroxidase-Zentrum, das mit antioxidativen Fähigkeiten ausgestattet ist und die Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ erleichtert. Es spielt eine unverzichtbare Rolle beim Wachstum und der Entwicklung verschiedener Organismen, indem es das Redoxgleichgewicht und die Eisenhomöostase aufrechterhält. Die Erschöpfung von FerHCH kann zu einer Überakkumulation von Eisen führen, was zu irreversiblen Gewebeschäden führt und oft zu signifikanten phänotypischen Veränderungen führt, einschließlich Wachstumsdefekten, Deformitäten und Mortalität23,24. Diese Studie bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von RNAi in T. denrolimi, die für die Untersuchung der Genfunktionen im breiteren Kontext von Trichogramma-Wespen von unschätzbarem Wert sein wird.

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (Farbstoff)</td><td>Cowin Biotech, China</td><td>CW0690H</td><td>Zur Amplifikation der dsRNA-Sequenzen</td></tr><tr><td>20x PBS Puffer, DEPC-behandelt (7.2-7.6)</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>B540627-0500</td><td>Zur Verdünnung von dsRNA-Agarstreifen</td></tr><tr><td></td><td>Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China</td><td>n/a</td><td>Zur Herstellung</td></tr><tr><td>von Kulturmedium Ampicillin-Natrium</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A610028</td><td>Herstellung Nährmedium</td></tr><tr><td>Bioer Metallbad mit konstanter Temperatur </td><td>BIOER, China</td><td>MB-102</td><td>Zur Synthese von dsRNA</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas </td><td>WPI, USA</td><td>1B100-4</td><td>Zum Ziehen einer Kapillarglasnadel</td></tr><tr><td>Reinigungsbank </td><td>Airtech, China</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>Zur Extraktion</td></tr><tr><td>von doppelt destilliertem RNA-Wasser</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A500197-0500</td><td>Zur Verdünnung der cDNA-Umweltprüfkammer</td></tr><tr><td> </td><td>Panasonic, Japan</td><td>MLR-352H-PC</td><td>Zur Kultur T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge </td><td>Eppendrof, Deutschland</td><td>5418R</td><td>Zur Speicherung des RNA-Gehalts</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendrof, Deutschland</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Zur Injektion von T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Kühlzentrifuge </td><td>Eppendrof, Deutschland</td><td>5810R</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Ethanollösung (75%, RNase-frei)</td><td>Aladdin, China</td><td>M052131-500ml</td><td>Zur Extraktion</td></tr><tr><td>von RNA Gel Extraktionskit</td><td>Omega, USA</td><td>D25000-02</td><td>Zur Extraktion von cDNA</td></tr><tr><td>GUM Arabicum Solarbio</td><td>, China</td><td>CG5991-500g</td><td>Zur Herstellung von</td></tr><tr><td>Eikarte Isopropyl Alkohol</td><td>Aladdin, China</td><td>80109218</td><td>Zur Extraktion von RNA</td></tr><tr><td>Laserbasierter Mikropipettenabzieher </td><td>SUTTER, USA</td><td>P-2000</td><td>Zum Ziehen von Kapillarglasnadeln</td></tr><tr><td>Microloader </td><td>Eppendrof, Deutschland</td><td>20 &amp; Mikro; L</td><td>Zum Laden von dsRNA</td></tr><tr><td>Mehrproben-Gewebeschleifer </td><td>LICHEN, China</td><td>LC-TG-24</td><td>Zum Schleifen von T. denrolimi</td></tr><tr><td>Nadelschleifer </td><td>SUTTER, USA</td><td>BV-10-E</td><td>Zum Schleifen von Kapillarglasnadeln</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Sangon Biotech, China</td><td></td><td>Zum Verdünnen von RNA</td></tr><tr><td>OLYMPUS Mikroskop</td><td>OLYMPUS, Japan</td><td>XZX16</td><td>Zum Beobachten von T. denrolimi</td></tr><tr><td>PCR-Gerät </td><td>Bio-rad, USA</td><td>S-1000</td><td>Für die DNA-Amplifikation</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, USA</td><td>PowerPacTM Basic</td><td>Zum Nachweis der Qualität von dsRNA </td></tr><tr><td>Primer von dsGFP (Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>Primer von dsGFP (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>Primer von Ferhch für qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGGTTCTGCT</td></tr><tr><td>Primer von Ferhch für qPCR ( Reverse)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>Primer von Ferhch for RNAi (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC</td></tr><tr><td>Primer von Ferhch for RNAi(Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG</td></tr><tr><td>Primer von FoxO for qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>Primer of FoxO für qPCR (Reverse)</td><td></td><td></td><td>TGCTGTCGCCTTGTCCT</td></tr><tr><td>PrimeScript RT Reagenzkit mit gDNA Eraser (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa, Japan</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Quantitative Real-time PCR </td><td>Bio-rad, USA</td><td>CFX 96 Touch</td><td>Zur Durchführung einer reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)</td></tr><tr><td>Real-time PCR (TaqMan) Primer und Sonden Design Tool</td><td></td><td></td><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td></tr> <tr><td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, USA</td><td>P1700</td><td>Zur Synthese von dsRNA   in vitro  </td></tr><tr><td>TB Grün Premix Ex TaqTM <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto; "> (bis RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, Japan</td><td>RR820A</td><td>Zur Durchführung von RT-qPCR</td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>KESHI, China</td><td>GB/T682-2002</td><td>Zur Extraktion</td></tr><tr><td>von RNA TRIzol Reagenz</td><td>Ambion, USA</td><td>15596018</td><td>Zur Extraktion des Gesamt-RNA-Gehalts aus Proben</td></tr><tr><td>Ultra-Tiefkühlschrank </td><td>Thermo, USA</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-interferenz im ei-parasitoiden, trichogramma dendrolimi matsumura

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Die Eiparasitoide, Trichogramma spp., sind als wirksame biologische Schädlingsbekämpfungsmittel gegen verschiedene Schmetterlingsschädlinge in Land- und Forstwirtschaft anerkannt. Die unreifen Stadien der Trichogramma-Nachkommen entwickeln sich innerhalb des Wirteis und weisen eine bemerkenswerte Winzigkeit auf (ca. 0,5 mm in der adulten Länge). Die RNA-Interferenz-Methode (RNAi) hat sich als entscheidendes Werkzeug zur Aufklärung von Genfunktionen in zahlreichen Organismen herausgestellt. Die Manipulation von RNAi in bestimmten kleinen parasitoiden Arten wie Trichogramma hat jedoch im Allgemeinen erhebliche Herausforderungen mit sich gebracht. In dieser Studie stellen wir eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi vor. Das skizzierte Verfahren umfasst die Gewinnung und Isolierung einzelner T. dendrolimi-Proben aus Wirtseiern, das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die In-vitro-Transplantation und Kultivierung von T. dendrolimi-Puppen , die Mikroinjektion von dsRNA und die anschließende Beurteilung des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Diese Studie liefert ein umfassendes, visuell detailliertes Verfahren zur Durchführung von RNAi-Experimenten in T. dendrolimi und ermöglicht es den Forschern, die Genregulation in dieser Art zu untersuchen. Darüber hinaus ist diese Methodik mit geringfügigen Anpassungen für RNAi-Studien oder Mikroinjektionen in anderen Trichogramma-Arten anpassbar, was sie zu einer wertvollen Referenz für die Durchführung von RNAi-Experimenten an anderen endoparasitären Arten macht.

Die Emergenzrate von T. denrolimi-Puppen , denen dsFerhch injiziert wurde, war signifikant niedriger als die von denjenigen, denen dsGFP injiziert wurde, oder derjenigen, denen dsGFP injiziert wurde (Tabelle 1). Unter den geschlüpften Wespen entwickelten 51,85 % der T. denrolimi-Wespen , die dsFerhch ausgesetzt waren, deformierte kleine Flügel. Die deformierten Wespen wurden bei den Wespen, denends GFP injiziert wurde, oder ohne Injektion nicht beobac...

Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .

RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Trichogramma-Wespen sind eine Gruppe von Eiparasitoiden, die zur Bekämpfung von Lepidoptera-Schädlingen in der Landwirtschaft eingesetzt werden. Das intrazelluläre Bakterium Wolbachia induziert bei einigen Trichogramma-Wespen die lytokoöse Parthenogenese. Wir versuchen, den Mechanismus von Wolbachia und Geschlechtsbestimmungssystemen bei Trichogramma-Wespen zu beantworten.Wir haben die RNA-Interferenzmethode bei Trichogramma-Wespen entwickelt. Diese Methode ist ein wichtiges genetisches Instrumentarium zur Untersuchung der Genfunktionen von Trichogramma. Die unreifen Stadien der Trichogramma-Nachkommen entwickeln sich im Wirtsei.Die Körpergröße von Trichogramma ist extrem klein und beträgt etwa 0,5 Millimeter in der Erwachsenenlänge. Die Manipulation genetischer Werkzeuge wie RNA-Interferenz und Genom-Editierung stellt eine gewaltige Herausforderung für diese winzigen parasitoiden Wespen dar. Jahrzehntelang wurden die Genfunktionen innerhalb der gesamten Gattung Trichogramma nur selten erforscht.Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell zur Untersuchung der Genregulation während der Entwicklung und physiologischer Aktivitäten bei Trichogramma-Wespen.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-Interferenz (RNAi) basierten Gen-Knockdown-Techniken sind der Kern der Tribolium Forschung. Hier geben wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in Tribolium castaneum. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die den schnellen Zugriff auf Verlust-Funktion Phänotypen bietet, so dass die Forscher Gen-Funktionen in verschiedenen Kontexten zu studieren.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum

Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Ausführung von Ei Ablehnung Experimente: Gliedern Techniken für die experimentelle Malerei Ei Modelle, die Farben der natürlichen Vogeleier, Durchführung von Feldarbeit und Analyse der gesammelten Daten zu emulieren. Dieses Protokoll bietet eine einheitliche Methode für die Durchführung von vergleichbaren Ei Ablehnung Experimente.

Die Grenzen der Ei-Anerkennung mit Ei Ablehnung Experimente entlang phänotypischen Verläufen sondieren

In diesem Protokoll werden Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und zur Beurteilung des Erfolgs eines dieser Kreuze, die Ameise Vollenhovia Emeryibeschrieben. Diese Protokolle sind wichtig für Experimente zur Verständnis der genetischen Grundlagen von Geschlecht Bestimmung Systeme in Hymenoptera.

Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

Wir präsentieren eine einfache zytogenetische Technik mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu bestimmen, die Befruchtungsrate und primäre Geschlechtverhältnis der diploide invasive Schädling Tabak Tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Wir liefern ein detailliertes Protokoll für elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzen bei Insekten der Ordnung Odonata (Libellen und Damselflies) mit dem Blauschwanz-Dammselbst (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) und der pied Skimmer Libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

Dieses Protokoll beschreibt einen RNA-Interferenz- und ChIP-Assay zur Untersuchung der epigenetischen Vererbung von RNAi-induziertem Silencing und damit verbundenen Chromatinmodifikationen in C. elegans.

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von Gift aus Trichogramma dendrolimi unter Verwendung eines künstlichen Wirts vor, der mit Polyethylenfilm und Aminosäurelösung hergestellt wurde.

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.

Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

Lernen Sie die RNA-Interferenz-Methode für Genregulationsstudien bei Trichogramma dendrolimi kennen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen in kleinen parasitoiden Wespen.

RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

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