Name: Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Lernen Sie eine optimierte stereotaktische Injektionsmethode für die Neuroanatomie bei Mäusen. Dieses Protokoll nutzt kostengünstige Farbstoffe zur schnellen Verifizierung von Injektionsstellen und verkürzt die Validierungszeit erheblich.

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National Natural Science Foundation of China (Stipendium Nr. 82101249 an XY Sun), Postdoctoral Research Foundation of China (Stipendium Nr. 2022M722125 an XY Sun). Shanghai Sailing Program (Zuschuss Nr. 21YF1425100 an SH Chen). Sonderprojekt für klinische Forschung der städtischen Gesundheitskommission von Shanghai (Zuschuss Nr. 202340088 an J Zhou). Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Stipendium Nr. 82101262 an X Zhang, Stipendium Nr. 82101287 an SH Chen).

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche (Animal Research Reporting In Vivo Experiments, ARRIVE) und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die vorliegende Studie wurde vom Animal Care and Use Committee des Renji Hospital der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte männliche Mäuse des Typs C57BL/6J verwendet. Die Tiere wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und in Standardkäfigen untergebracht (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h Hell-/Dunkelgang, Futter und Wasser ad libitum).
1. Auswahl der Zielregionen des Gehirns
HINWEIS: Dies ist ein steriles Verfahren. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert sind. Sprühen Sie die Handschuhe vor dem Kontakt mit chirurgischen Instrumenten mit Alkohol ein. Vermeiden Sie es, die Spitze der Instrumente oder den Operationsbereich mit Handschuhen zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor Beginn des Eingriffs ausreichend betäubt ist, indem Sie auf den Verlust der Aufrichtreflexe und keine Reaktion auf die kutane Stimulation prüfen. Überwachen Sie vor dem Bohren und Injizieren genau die Atemfrequenz (60-220 Atemzüge pro Minute, durchschnittlich 100-150 Atemzüge pro Minute) und die Atemamplitude (sollte gleichmäßig und nicht zu flach oder tief sein). Signifikante Veränderungen der Atemfrequenz oder -amplitude sollten vermerkt werden.
<ol><li>Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 1,25 % Tribromethanol (250 mg/kg) mit einer 29-g-Nadel. Rasieren Sie die Haare am Schädel, sobald der Aufrichtreflex verschwunden ist. Sichern Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle), indem Sie die oberen Schneidezähne mit einer Nasenklemme fixieren und den Kopf mit zwei Ohrstangen stabilisieren.</li>
	<li>Tragen Sie eine Augensalbe auf, um Augentrockenheit zu verhindern. Desinfizieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie dreimal mit Anerdian (Desinfektionslösung; siehe Materialtabelle) abtupfen. Injizieren Sie 0,2 ml 1% Lidocain subkutan mit einer 29-g-Insulinnadel, um eine lokale Analgesie zu verabreichen.</li>
	<li>Machen Sie mit einer Augenschere einen 0,5 cm langen Schnitt, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, das in 3% H2O2 getaucht ist, um den freiliegenden Schädel zu schrubben und das Periost zu entfernen. Lassen Sie den Schädel trocknen.</li>
	<li>Befestigen Sie den Bohrer am stereotaktischen Instrument. Stellen Sie die Drehknöpfe der stereotaktischen Arme ein, um die Bohrerspitze mit Hilfe einer Lupe präzise am Bregma zu positionieren und den Wert der z-Achse über die LCD-Digitalanzeige aufzuzeichnen.<ol><li>Stellen Sie die Knöpfe ein, positionieren Sie die Bohrspitze am Lambda und notieren Sie den Wert der z-Achse. Stellen Sie die Nasenklemme und die Ohrbügel so ein, dass sich zwei Z-Werte annähern, und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,1 mm beträgt. HINWEIS: Die x-, y- und z-Achsen auf der LCD-Digitalanzeige entsprechen der mediolateralen (ML), der anteroposterioren (AP) bzw. der dorsoventralen (DV). Bregma und Lambda können als auf derselben horizontalen Ebene liegend betrachtet werden, sobald die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,1 mm beträgt.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Links-Rechts-Ebene des Gehirns gewährleistet ist. Passen Sie die am stereotaktischen Rahmen befestigten Ohrbügel mit der gleichen Skala an. Nehmen wir zum Beispiel den laterodorsalen tegmentalen Kern, ventralen Teil (LDTgV); Seine stereotaktischen Koordinaten sind -5,2 für x, +0,8 für y, -4,0 für z, laut Paxinos und Franklins Mausgehirnatlas16.<ol><li>Stellen Sie die Ohrstange so ein, dass der Bohrer auf (-5,2, +0,8) eingestellt wird, um den z-Wert in dorsal-ventraler Richtung zu messen, und bewegen Sie den Bohrer auf (-5,2, -0,8), um den z-Wert zu messen. HINWEIS: Links-Rechts wird als gleich angesehen, wenn die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,2 mm beträgt. Die Ohrbügel müssen an der richtigen Stelle eingesetzt werden, da der äußere Gehörgang symmetrisch ist. Wenn die Differenz zwischen den beiden Z-Werten mehr als 0,5 mm beträgt, kann es sein, dass die Ohrstange an der falschen Stelle eingesetzt wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Positionieren Sie den Bohrer wieder auf dem Bregma und stellen Sie drei Koordinaten auf der LCD-Digitalanzeige auf Null. Positionieren Sie den Bohrer mithilfe von Referenzkoordinaten über dem Interessenbereich. Starten Sie die Übung.<ol><li>Senken Sie den Bohrer mit dem vertikalen Arm allmählich ab, bis er in den Schädel eindringt. Entfernen Sie Schmutz und Blut mit Wattestäbchen. HINWEIS: Achten Sie darauf, das Hirngewebe nicht zu beschädigen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung der Farbstofflösung und der Mikroinjektion des Gehirns
<ol><li>25 μl SDS-PAGE-Ladepuffer mit Bromphenolblau (siehe Materialtabelle) in ein 200 μl Mikrozentrifugenröhrchen geben. 50 μl ddH2O in das Röhrchen geben, um die Farbstofflösung herzustellen.</li>
	<li>Decken Sie das Schädelfenster mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattepad ab. Stellen Sie die Durchgängigkeit der Mikrospritze sicher, indem Sie Kochsalzlösung wiederholt aspirieren und ausstoßen. Laden Sie 0,3 μl Farbstoff in die Mikrospritze. Befestigen Sie die Spritze und den motorisierten stereotaktischen Mikroinjektor am stereotaktischen Arm.</li>
	<li>Positionieren Sie die Spritzenspitze am Bregma und stellen Sie die Koordinaten auf der LCD-Digitalanzeige auf Null. Passen Sie die Nadel entsprechend den Referenzkoordinaten an den interessierenden Bereich an. Stellen Sie die Injektionsgeschwindigkeit auf 0,1 μl/min ein und starten Sie den motorisierten Mikroinjektor, der 0,3 μl blauen Farbstoff in den Zielbereich abgibt. Lassen Sie die Spritze mindestens 10 Minuten lang in Position, bevor Sie den Injektor langsam herausziehen. HINWEIS: Unterschiedliche Farbstoffe können bei denselben Mäusen verwendet werden, um nahe beieinander liegende Regionen zu unterscheiden. Testen Sie andere Farbstoffe auf geeignete Konzentrationen basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften. Es wird empfohlen, die Bromphenolblau-Formel zu verwenden und die Spritze vor und nach dem Gebrauch gründlich auszuspülen, um Verstopfungen zu vermeiden. Passen Sie das Injektionsvolumen basierend auf der Farbstoffdiffusion an.</li>
</ol>3. Entnahme von Hirngewebe und Kryosektion
<ol><li>Lassen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen los. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital-Natrium mit einer 29-g-Nadel. Befestigen Sie die Maus mit Klebeband auf einer Schaumstoffplatte.</li>
	<li>Öffnen Sie beide Seiten des Thorax, um eine schnelle Erstickung herbeizuführen. Machen Sie einen 1-2 mm Schnitt im rechten Vorhofohr. Führen Sie eine Infusionsnadel in die linke Herzkammer ein. 20 mL vorgekühlte Kochsalzlösung und 20 mL eisgekühlte 4%ige Paraformaldehyd-Lösung aufgießen.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Maus mit einer Gewebepräparierschere (nach institutionell anerkannten Protokollen). Entferne die Haut, indem du einen Schnitt entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase machst und dann den Schädel freilegst. Beseitigen Sie Muskelreste am Schädel mit einer Zange oder Schere.</li>
	<li>Positionieren Sie die Spitze einer Klinge der feinen Schere zwischen dem Foramen magnum und dem Gehirn, wobei die scharfe Kante zum Knochen zeigt, am rostralen Ende der mittleren sagittalen Naht. Fahren Sie mit dem Gleiten fort und schneiden Sie den Schädel entlang der mittleren sagittalen Naht. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel zu entfernen und das freiliegende Gehirn freizulegen. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um während der Operation keine Schäden am Gehirn zu verursachen. Bevor Sie die Knochenspäne entfernen, ziehen Sie vorsichtig alle Hirnhäute ab, die möglicherweise am Schädel haften. Diese Vorsichtsmaßnahme ist entscheidend, um ein versehentliches Schneiden des Hirngewebes während des Prozesses zu verhindern.</li>
	<li>Schalten Sie den rotierenden Mikrotom-Kryostaten ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie die Kammertemperatur auf -20 °C ein. Gießen Sie etwas OCT-Masse, um die Oberfläche der Probenscheibe gleichmäßig zu bedecken. Legen Sie es in die Kryokammer und lassen Sie das OCT erstarren.</li>
	<li>Befestigen Sie die Scheibe am Probenkopf. Bringen Sie die Klinge näher an den Block heran und schneiden Sie den OCT-Block ab, um eine flache Ebene zu erzeugen, die parallel zur Scheibe verläuft.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn in koronaler Richtung von der Injektionsstelle weg in einer Gehirnschnittform mit einer Rasierklinge. Platzieren Sie das Hirngewebe, das die Injektionsstelle enthält, mit der Schnittseite nach unten auf der flachen OCT-Ebene.<ol><li>Gießen Sie OCT auf das Gehirn und legen Sie die Scheibe in die Kryokammer, damit sich der Probenblock verfestigen kann. Gießen Sie OCT wiederholt auf das Gehirn, bis das Gehirn vollständig in OCT eingebettet ist. HINWEIS: Fügen Sie die OCT-Verbindung Schicht für Schicht hinzu. Sobald die vorherige OCT-Schicht eingefroren ist, gießen Sie die nachfolgende Schicht der OCT-Verbindung auf das Gehirn.</li>
	</ol></li>
	<li>Trimmen Sie den Probenblock, bis sich der Zielbereich nähert. Machen Sie mehrere Schnitte von der Ebene der Injektionsstelle. Sammeln Sie die koronalen Hirnschnitte mit einer kleinen Schreibbürste, die bei -20 °C aufbewahrt wird, in eine 6-Well-Platte mit raumwarmem PBS. HINWEIS: Stellen Sie die Schnittstärke auf eine größere ein, um den Block zu trimmen, und stellen Sie dann die Schnittstärke auf 40 μm ein, wenn sich die Klinge der Injektionsstelle nähert. Wenn Tracer für neuronale Schaltkreise verwendet werden, werden die Mäuse nicht sofort getötet. Legen Sie die Maus in einen sterilen, postoperativen Erholungskäfig über einer Heizdecke, um sich von der Narkose zu erholen. Setzen Sie die Mäuse wieder in den ursprünglichen Käfig oder in einen neuen Käfig zurück, sobald sie wach sind.</li>
</ol>4. Bildgebung
<ol><li>Waschen Sie das OCT mit PBS bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Pinsel, um Gehirnabschnitte aufzunehmen und auf einer Folie zu platzieren. Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.</li>
	<li>Beobachten Sie den injizierten Bereich visuell oder verwenden Sie ein Mikroskop, wenn die Zielkerne winzig klein sind. Vergleichen Sie die Position des injizierten Farbstoffs mit der entsprechenden Region im Gehirnatlas. HINWEIS: Passen Sie die Werte der x-, y- und z-Achse entsprechend der Richtung und dem Abstand der Abweichung des Anspritzpunkts an. Es kann erforderlich sein, alle Schritte in diesem Protokoll mehrmals zu wiederholen, um die Koordinaten genau zu bestimmen.</li>
</ol>

Optimierung der stereotaktischen Mikroinjektionsgenauigkeit bei Mäusen

<ol><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175(2018).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li>
<li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li>
<li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li>
<li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77(2023).</li>
<li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).</li>
<li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211(2021).</li>
<li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+2nd+ed%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed</a>. , Academic Press. (2001).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

In diesem Artikel wurde eine stabile Strategie beschrieben, um die Genauigkeit von stereotaktischen Hirninjektionen 5,6 schneller und einfacher vor der Virusverfolgung zu überprüfen, aber der unersetzliche Aspekt der Reportergenexpression in der Gehirnregion ist entscheidend für die Markierung von Hirnregionen. Der von uns verwendete blaue Farbstoff ermöglichte die unmittelbare Visualisierung der Injektionsstelle.
Mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll tragen dazu bei, die Genauigkeit der Injektionsstelle zu verbessern. Erstens, Sicherstellung der Links-Rechts-Nivellierbarkeit des Gehirns im stereotaktischen Instrument aus Schritt 1.5; Dieser Schritt erfordert, dass der Bediener mit der Anatomie des Schädels vertraut ist, um sicherzustellen, dass die Ohrbügel in der richtigen Position platziert sind. Die Skalen an den Ohrbügeln und der stereotaktische Rahmen dienen ebenfalls als Referenz. Zweitens, den genauen Nullpunkt, das Bregma, in Schritt 1.6 und Schritt 2.3 zu finden. Gelegentlich ist eine signifikante Diskrepanz in den Koordinaten der Schritte 1.6 und 2.3 auf einen erheblichen Unterschied in der Nullpunktpositionierung zurückzuführen. Dies kann dazu führen, dass die Mikroinjektornadel nicht in der Lage ist, das Schädelfenster zu durchdringen. In solchen Fällen ist es notwendig, den Nullpunkt neu zu positionieren und bei Bedarf ein neues Schädelfenster zu erstellen. Trotzdem ist es immer noch unerlässlich, den Nullpunkt wiederherzustellen und die Koordinaten in Schritt 2.3 neu zu finden; Man kann die Mikrospritze nicht direkt aus dem zuvor hergestellten Schädelfenster einführen.
Verglichen mit dem Schneiden eines nicht gefrorenen Gehirns in einer Maus-Gehirnschnittform liefert diese Strategie ein genaueres Ergebnis, da der feste Probenblock verhindert, dass die Klinge das Gehirn zusammendrückt und der Farbstoff von den Injektionspunkten verdrängt wird. Darüber hinaus sind Hirnschnitte, die mit einer Hirnschnittform geschnitten werden, relativ dicker und es ist nicht möglich, kleine Hirnkerne zu lokalisieren. Verglichen mit dem Standard-Kryosektionsverfahren für Hirngewebe 11,12,13,14,15 verkürzten wir jedoch die Verarbeitungsdauer um mindestens 72 Stunden, indem wir die Dehydratisierungsschritte übersprangen, was dazu führte, dass die Hirnschnitte zerbrechlicher und schwieriger auf einem Objektträger aufzunehmen waren, was eine große Schwäche dieses Protokolls darstellt.
Bei der Herstellung der Schädelfenster für die Farbstoffinjektion erleichtert die feste Befestigung des Zahnbohrers am stereotaktischen Arm, anstatt ihn mit der Hand zu halten, die Steuerung der Bohrtiefe mit dem Feineinstellknopf, wodurch die Möglichkeit einer Schädigung des Hirngewebes verringert wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine vielversprechende Methode zur vorläufigen Überprüfung der genauen stereotaktischen Koordinaten vor der Virusverfolgung bereitgestellt hat, wodurch der anschließende Prozess der Neuronenmarkierung und -verfolgung zuverlässiger wird.

Nahezu alle modernen Neuromodulationswerkzeuge, einschließlich der In-vivo-Kalziumaufzeichnung, optogenetischer und chemogenetischer Werkzeuge, erfordern die Verwendung stereotaktischer Koordinaten, um den interessierenden Hirnbereich zu erreichen 1,2,3, was die Grundlage der neuronalen Manipulation bildet. Stereotaktische Koordinaten für Hirnregionen von Mäusen werden in Beziehung zu Bregma und Lambda, den knöchernen Landmarken auf dem Schädel, definiert, die das sogenannte skull-derived stereotaxic coordinate system bilden. Als Nullpunkt der dreidimensionalen Koordinaten kann entweder Bregma oder Lambda dienen. Die drei Achsen sind anteroposterior (AP), mediolateral (ML) und dorsoventral (DV) und stellen die y-, x- und z-Achsen auf der digitalen Anzeige stereotaktischer Instrumente dar. Für bekannte Hirnregionen können die stereotaktischen Koordinatenparameter eines bestimmten Bereichs aus Maushirnatlanten4 (z.B. Paxinos und Franklins Mausgehirn in stereotaktischen Koordinaten) und/oder der veröffentlichten Literatur 5,6 gewonnen werden. Eine weitere Validierung ist jedoch aufgrund von Unterschieden in der stereotaktischen Ausrüstung und dem Alter/der Populationen von Mäusen, die von verschiedenen Forschern verwendet werden, erforderlich.
Struktur ist die Basis der Funktion. Neuronale Schaltkreise bilden die Grundlage für viele Gehirnfunktionen, wie z. B. kognitive Aktivitäten, Emotionen, Gedächtnis, sensorische und motorische Funktionen1. Die Markierung der Struktur und die Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise sind entscheidend für das Verständnis der Funktion eines bestimmten neuronalen Schaltkreises. In den letzten Jahrzehnten haben sich neuronale Tracer über viele Generationen hinweg entwickelt; Frühe Forschungen verwendeten Weizenkeimaggglutinin (WGA) und Phaseolus vulgaris Agglutinin (PHA) als anterograde Tracer und Fluorgold (FG), Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) und Carbocyanin als retrograde Tracer. Im Gegensatz zu viralen Tracern können diese herkömmlichen neuronalen Tracer jedoch keine exogenen Gene in den Wirt integrieren und weisen auch keine Zelltypselektivität auf. Heutzutage ist die virale Strategie zu einem wichtigen Vorschlag in der neurowissenschaftlichen Grundlagenforschung geworden. Für unterschiedliche Forschungszwecke können verschiedene virale Werkzeuge ausgewählt werden 7,8. Es gibt nicht-transsynaptische Viren, trans-multisynaptische Viren (retrograd und anterograde) und trans-monosynaptische Viren (retrograd und anterograd). Jede Kategorie enthält mehrere Typen mit entsprechenden Merkmalen.
Der Prozess der viralen Verabreichung und Expression ist sehr zeit- und ressourcenintensiv und dauert oft Wochen oder sogar länger. Unter den verschiedenen viralen Vektoren wurde das Adeno-assoziierte Virus als vielversprechendes Mittel für die Genübertragung identifiziert, das ein breites Zeitfenster von 3 bis 8 Wochen nach der Injektion für das experimentelle Verfahren bietet 7,8. Mit fortschreitender AAV kann die Analyse 2-3 Wochen nach der Verabreichung durchgeführt werden 9,10. Andere Tracer für neuronale Schaltkreise, wie z. B. das Pseudotollwutvirus (PRV) und das Tollwutvirus (RV), erfordern ebenfalls einen Rückverfolgungszeitraum von mindestens 2-7 Tagen 11,12,13,14,15. Daher ist eine vorläufige Überprüfung der Injektionsstelle vor der Beobachtung von Fluoreszenzsignalen sowohl zeit- als auch kosteneffizient.
Um eine einfache und schnelle Überprüfung von stereotaktischen Injektionen zu ermöglichen, wird in dieser Studie ein Farbstoff vor viralen Vektoren verabreicht, und die Kryosektion ermöglicht es den Forschern, die Injektionsstelle zu beobachten und innerhalb von 30 Minuten nach der Injektion zu verfolgen.

<table><tbody><tr><td>1.0 &Mikro; L, Neuros Spritze, Modell 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td><td>Hamilton</td><td>65458-01</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>Biosharp</td><td>BS-200-T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Spritze</td><td>Kindly Gruppe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3%H2O2 Lösung</td><td>Lircon Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Shengyou Biotech</td><td>20006</td><td></td></tr><tr><td>Anerdian</td><td>Likang High-Tech</td><td>31001002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rollplatte</td><td>Leica</td><td>14047742497</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin Spritze</td><td>Becton,Dickinson and Company</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Bend gezahnte Präparierzange</td><td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Cellsens Dimension Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-Fluoromount-G</td><td>Southernbiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Longxiang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Bürsten</td><td>HWAHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermikrotom</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Hämostatische Pinzette gerade mit Zahn</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Infusionsnadel 0,7 mm</td><td>Freundliche Gruppe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocainhydrochlorid-Injektion</td><td>Harvest Pharmaceutical Company</td><td>71230803</td><td></td></tr><tr><td>Lupe</td><td>M& G Chenguang Stationery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Männliche C57/BL Mäuse</td><td>Das Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&ndash; BK Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mäuse koronale Hirnschnittform</td><td>RWD Life Science</td><td>68713</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Biosharp</td><td>BS-02-P</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomklingen</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmische Salbe</td><td>Cisen Pharmaceutical Company</td><td>G23HDM9M4S5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Piette 2-200 &mu; L</td><td>Thermofisher</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Probenbeladung mit Bromphenolblau</td><td>Beyotime</td><td>P0015A</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>BFYING</td><td>91560618</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Gerät</td><td>RWD Life Science</td><td>68807</td><td></td></tr><tr><td>Geradzahnige Präparierzange</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenhalter</td><td>RWD Life Science</td><td>68206</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschere</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Verbindung</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tribromethanol</td><td>Aibei Biotechnologie</td><td>M2910</td><td></td></tr></tbody></table>

vorläufige validierung von stereotaktischen injektionskoordinaten mittels kryosektion

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Die stereotaktische Injektion einer bestimmten Hirnregion stellt eine grundlegende experimentelle Technik in den Neurowissenschaften dar. Forscher stützen sich bei der Wahl der stereotaktischen Injektionsparameter häufig auf Hirnatlanten von Mäusen oder veröffentlichten Materialien, die verschiedene Populationen/Altersgruppen von Mäusen und unterschiedliche stereotaktische Geräte verwendeten, was eine weitere Validierung der stereotaktischen Koordinatenparameter erforderlich machte. Die Wirksamkeit von Calcium-Bildgebung, chemogenetischen und optogenetischen Manipulationen beruht auf der präzisen Expression von Reportergenen innerhalb der interessierenden Region, die oft mehrere Wochen Aufwand erfordert. Daher ist es eine zeitaufwändige Aufgabe, wenn die Koordinaten der Zielhirnregion nicht im Voraus verifiziert werden. Mit einem geeigneten Farbstoff anstelle eines Virus und der Durchführung von Kryosektionen können die Forscher die Injektionsstelle unmittelbar nach der Farbstoffverabreichung beobachten. Dies ermöglicht eine rechtzeitige Anpassung der Koordinationsparameter in Fällen, in denen Diskrepanzen zwischen der tatsächlichen Injektionsstelle und der theoretischen Position bestehen. Solche Anpassungen verbessern die Genauigkeit der viralen Expression innerhalb der Zielregion in nachfolgenden Experimenten erheblich.

In dieser Studie wurde die Injektionsstelle innerhalb von 30 Minuten mit der demonstrierten Methode erfolgreich identifiziert. Zunächst wurde eine SDS-PAGE-Probenladelösung, die Bromphenolblau enthielt, in das LDTgV in den C57/BL-Mäusen injiziert. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Injektion der Farbstofflösung. Die Verteilung des blauen Farbstoffs im LDTgV ist in Abbildung 1B dargestellt.
Bromphenolblau wurde auch in den prälimbischen Kortex des mPFC, den infralimbischen Kortex des mPFC und die basomediale Amygdala (BMA) injiziert, um die Universalität dieses Protokolls zu bewerten. Wie in Abbildung 1C-E und Abbildung 2A gezeigt, war der blaue Farbstoff im prälimbischen mPFC-Kortex, im infralimbischen mPFC-Kortex und im BMA verteilt.
Darüber hinaus wurde ein Adeno-assoziiertes Virus, das ein fluoreszierendes mCherry-Protein trägt, in das LDTgV injiziert (die Koordinaten wurden mit der Farbstofflösung verifiziert). Die Ausprägung des Virus dauerte vier Wochen. Die Verteilung der mCherry+-Neuronen im LDTgV ist in Abbildung 2B dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig01.jpg"> Abbildung 1: Injektion der Farbstofflösung. (A) Schematische Darstellung der Injektion der Farbstofflösung. (B) Verteilung des blauen Farbstoffs im LDTgV. (C) Verteilung des blauen Farbstoffs im prälimbischen Kortex des mPFC. (D) Verteilung des blauen Farbstoffs im infralimbischen Kortex von mPFC. (E) Verteilung des blauen Farbstoffs in BMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig02.jpg"> Abbildung 2: Verteilung des blauen Farbstoffs und der mCherry-Verteilung unter dem Mikroskop. (A) Verteilung des blauen Farbstoffs im prälimbischen Kortex des mPFC (10-fache Vergrößerung, Maßstabsbalken = 500 μm). (B) Repräsentatives Bild der mCherry-Verteilung im LDTgV-Bereich, aufgenommen durch Fluoreszenzmikroskopie (10-fache Vergrößerung, Maßstabsbalken = 500 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.

Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Unsere Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die Untersuchung des Mechanismus neuronaler Schaltkreise, der kognitiven Beeinträchtigungen bei Mäusen zugrunde liegt. Und wir verwenden in diesen Studien häufig stereotaktische Techniken des Gehirns. Unser Ziel ist es, den Verifizierungsprozess für stereotaktische Injektionsstellen mit Farbstoffen zu optimieren und zu beschleunigen, um sicherzustellen, dass er zu einem einfachen und schnellen Verfahren wird.In der neurowissenschaftlichen Forschung sind verschiedene Strategien durch stereotaktische Injektion von Viren entscheidend geworden. Es folgt die Beobachtung von fluoreszierenden Markern in Gewebeschnitten, um die Injektionsstellen zu bestätigen, ein Prozess, der mehrere Wochen in Anspruch nimmt. Unser Protokoll bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, indem es mindestens drei Tage Dehydratisierungszeit einspart und einen kostengünstigen Farbstoff zur schnelleren Identifizierung von Injektionsstellen verwendet.Es kann Wochen sparen, verglichen mit keiner vorherigen Überprüfung.

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