Name: Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Acanthamoeba-Motilität mittels Mikroskopie und Hochdurchsatz-Bildanalyse. Diese Methode liefert wertvolle Erkenntnisse zur Verhütung von Acanthamoeba-Keratitis.

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<meta charset="utf8"></head><body>Langzeitverfolgung und Quantifizierung der Motilität von Akanthamöbenarten

<ol><li>Randag, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rising+incidence+of+Acanthamoeba+keratitis%3A+A+7-year+nationwide+survey+and+clinical+assessment+of+risk+factors+and+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes.</a> PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).</li>
<li>Szentmary, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis+-+Clinical+signs%2C+differential+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment.</a> J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).</li>
<li>Carnt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis%3A+confirmation+of+the+UK+outbreak+and+a+prospective+case-control+study+identifying+contributing+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors.</a> Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).</li>
<li>Verani, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+outbreak+of+Acanthamoeba+keratitis+associated+with+use+of+a+contact+lens+solution%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States.</a> Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).</li>
<li>Tu, E. Y., Joslin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+outbreaks+of+atypical+contact+lens-related+keratitis%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608 (2010).</li>
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<li>ASC Z80, Parent Committee Meeting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf">https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rayamajhee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba%2C+an+environmental+phagocyte+enhancing+survival+and+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens.</a> Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).</li>
<li>Reverey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superdiffusion+dominates+intracellular+particle+motion+in+the+supercrowded+cytoplasm+of+pathogenic+Acanthamoeba+castellanii%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii.</a> Sci Rep. 5, 11690(2015).</li>
<li>Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+superdiffusion+of+polydisperse+vacuoles+in+highly+motile+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells.</a> J Chem Phys. 150 (14), 144901(2019).</li>
<li>Rudell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba migration in an electric field.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).</li>
<li>Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+the+motility+of+giant+virus-infected+amoebae+using+phase-contrast+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images.</a> Front Microbiol. 10, 3014(2019).</li>
<li>Fukaya, S., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+Acanthamoeba+castellanii+infected+with+giant+viruses+quantitatively+revealed+process+of+morphological+and+behavioral+changes+in+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells.</a> Microbiol Spectr. 9 (1), 0036821(2021).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+for+cell+and+particle+tracking+on+microscopy+images+using+algorithms+and+deep+learning+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+J%22%5BJournal%5D)">A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies.</a> Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
<li>Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+cell+tracks%3A+Quantifying+cell+migration+by+time+lapse+image+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis.</a> Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).</li>
<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+time-lapse+imaging+and+single-cell+tracking+of+in+vitro+cultured+neural+stem+cells+-+Tools+for+analyzing+dynamics+of+cell+cycle%2C+migration%2C+and+lineage+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection.</a> Methods. 133, 81-90 (2018).</li>
<li>Campolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+real-time+motility+analysis+of+Acanthamoeba+reveals+sustained+movement+in+absence+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients.</a> Pathogens. 10 (8), 995(2021).</li>
<li>Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+recovery+of+Acanthamoeba+motility+among+surviving+organisms+after+contact+lens+care+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection.</a> Microorganisms. 11 (2), 299(2023).</li>
<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&frac14; Klingelton" s Lösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers Lösung Tabletten. Befolgen Sie die Anweisungen, um Ringer mit einer Viertelstärke anstelle von Ringern mit voller Stärke herzustellen.</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Pipette</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 &micro; L-20 & Mikro; L Einkanal</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Neptune Scientific, San Diego, CA, USA</td><td>BT10.N</td><td>10 &micro; L Universal Barrier Tip</td></tr><tr><td>48-Well-Platte</td><td>Millipore Sigma,&nbsp;</td><td>CLS3548</td><td>Corning Costar TC-behandelte Mehrfach-Well-Platte: Polystyrolplatte, Vertiefungen mit flachem Boden, steril, mit Deckel</td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen (1 für jede Probe, 1 für jeden Durchgang 2 Proben)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen mit hoher Klarheit,</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td> aus Polypropylen <td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>CLS3596</td><td>Corning Costar TC-behandelte Multi-Well-Platte: Polystyrolplatte, Vertiefungen mit flachem Boden, steril, mit Deckel</td></tr><tr><td>Acanthamoeba&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC 30461</td><td>Dieses Protokoll wurde für ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 und PRA-411</td></tr><tr><td>Axenische Nährmedien (AC6) verifiziert.</td><td></td><td></td><td> g Vitamin B12 und 1 Glas5 mg&nbsp; L-Methionin pro Liter destilliertem deionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 6,6-6,95 ein und autoklavieren Sie bei 121 & Grad; C für 20 min, bei Raumtemperatur bis zu 3 Monate lagern.</td></tr><tr><td>Zentrifuge und geeigneter Rotor</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>Jede gleichwertige Zentrifuge und jeder gleichwertige Rotor sind akzeptabel, solange sie konische 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min drehen können</td></tr><tr><td>Chemotaxis und Migration Tool</td><td></td><td></td><td>Kostenlose Software auf Basis von ImageJ, verfügbar bei https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</td></tr><tr><td>Einweg-Hämozytometer</td><td>Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer Verbessertes 2-Chip-Einweg-Hämozytometer, einzeln verpackte, pyrogene</td></tr><tr><td>ImageJ-Software mit Trackmate-Plugin (dieses Protokoll wurde mit Trackmate Version 6.0.2 geschrieben.)</td><td></td><td></td><td>Freie Software, die von den National Institutes of Health entwickelt wurde und unter imagej.net verfügbar ist. Trackmate-Plugin verfügbar bei https://imagej.net/plugins/trackmate/</td></tr> <tr><td>Mikroskop, vorzugsweise mit automatisiertem beweglichem Tisch</td><td>Nikon, Tokio, Japan</td><td></td><td>In dieser Studie wurde ein Nikon Eclipse Ti-U-Mikroskop verwendet, und der automatisierte bewegliche Tisch wurde verwendet, um Bilder in mehreren Vertiefungen gleichzeitig aufnehmen zu können.</td></tr><tr><td>NIS-Elements Software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro Pipettensteuerung</td></tr><tr><td>Serologische Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088</td><td>VWR Serologische Pipette, pyrogenfrei</td></tr><tr><td>Sterile Aluminium-Transmissions-Durchflusszelle</td><td>Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA</td><td>FC 81-AL</td><td>Einkanal-Transmissions-Durchflusszelle aus eloxiertem Aluminium mit 96-Well-Plattenfläche für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop</td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2316</td><td>VWR Gewebekulturflasche, 182,5 cm, oberflächenbehandelt, Steckerdichtung, steril</td></tr></tbody></table>

quantifizierung von acanthamoeba spp. motilität

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Um mit dieser Methode erfolgreich zu sein, gibt es mehrere entscheidende Gesamtaspekte zu berücksichtigen. Die erste ist die physische Einrichtung der Amöbe und des Mikroskops, die zweite ist die ordnungsgemäße Nutzung der Bildgebungssoftware und die dritte ist das Exportieren und Analysieren der Bildgebungsdaten auf sinnvolle Weise.
Bevor mit der mikroskopischen Aufnahme begonnen wird, muss unbedingt sichergestellt werden, dass die Amöbe auf dem Mikroskoptisch richtig fokussiert ist (Abbildung 1). Anstatt sich auf die Amöbe in der optimalen Z-Ebene für einzelne Details zu konzentrieren, ist es hier ideal, sie ganz leicht unscharf zu betrachten, so dass sie zu soliden schwarzen Punkten werden, im Gegensatz zu ihrem durchscheinenden Zustand, wenn sie im Detail betrachtet werden. Auf diese Weise können die Bildgebungssoftware und die Tracking-Software jede einzelne Amöbe viel leichter finden, wenn die Datei in eine Binärdatei konvertiert wird (Abbildung 2). Zu wissen, was das Ziel in der Bildgebungssoftware ist - das heißt, dass jede Amöbe als klar definierter weißer Kreis erscheint, kann dem Leser helfen, den richtigen Fokus zu finden, wenn er die Originalbilder im Hellfeld aufnimmt. Wenn dann jeder Kreis klar definiert ist, kann die Tracking-Software die Beweglichkeit jeder Amöbe richtig verfolgen und die individuellen Motilitätsmetriken für sie sammeln.
Nachdem Sie die Schritt-für-Schritt-Anweisungen im oben aufgeführten Protokoll für die Bildgebungssoftware und die Tracking-Software befolgt und sich auf das zugehörige Video bezogen haben, um die entscheidenden ersten Schritte der Nutzung der Bildgebungssoftware zu unterstützen, ist es an der Zeit, die Daten der Bildgebungssoftware zur Quantifizierung und Datenanalyse zu exportieren. Die Rohausgabe der Tracking-Software ähnelt der in Abbildung 3 gezeigten. Hier ist es wichtig zu überprüfen, ob die Anzahl der Spots in den exportierten Spuren den Erwartungen entspricht (z. B. wenn 93 % der Frames in jeder Spur vorhanden sein sollen und das Video insgesamt 100 Frames enthält, sollte jede exportierte Spur mindestens 93 Spots haben). Wenn die Spots nicht den Anforderungen entsprechen, muss man möglicherweise die Schritte der Tracking-Software erneut durchlaufen, um sicherzustellen, dass die erforderlichen Parameter korrekt eingestellt wurden.
Beginnen Sie beim Rohexport mit der Erstellung des Datenanalyseblatts (Abbildung 4). Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Spur eine singuläre Amöbe innerhalb eines singulären Replikats darstellt. Daher müssen, wie in Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 zu sehen ist, alle Spuren für ein Frameset oder einen Zeitpunkt gemittelt werden (Abbildung 4), und dieser Vorgang muss für jedes Frameset oder jeden Zeitpunkt in einer gesamten Serie durchgeführt werden (d. h. wenn insgesamt 3 Stunden Video aufgenommen werden und die Datenpunkte durch die Stunde geteilt werden, dann gibt es drei Framesätze/Stunden, die pro Replikat analysiert werden müssen ( Abbildung 5). Schließlich müssen aus dieser Kombination von Durchschnittswerten in jedem Framesatz in jedem Replikat die gemittelten Daten aus jedem Replikat in einem Raum kombiniert werden, damit die Daten über mehrere Replikate hinweg analysiert werden können, um den wahren Durchschnitt und die Standardabweichung pro Zeitpunkt zu bestimmen (Abbildung 6).
Die Durchschnittswerte aus jedem Replikat werden für die Datenanalyse verwendet, und der kombinierte Durchschnitt und die Standardabweichung oder der Standardfehler aus allen Replikaten werden für die grafische Darstellung verwendet (wie in einem Beispiel in Abbildung 7 zu sehen). Wenn Sie Daten analysieren, wie wir es hier getan haben, d. h. mehrere Stichproben, die über mehrere Zeitpunkte verfolgt werden, ist es am besten, sie mit einer 2-Wege-ANOVA mit Wiederholungsmessung und einem Post-hoc-Tukey-Test zu analysieren. Dies ermöglicht es uns, die Unterschiede zwischen den Proben zu jedem Zeitpunkt und auch die Unterschiede innerhalb jeder Probe im Laufe der Zeit zu bestimmen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> Abbildung 1: Amöben erscheinen in der Hellfeldmikroskopie als undurchsichtige dunkle Formen. Vergrößertes repräsentatives Bild der Amöbe mit 4-facher Vergrößerung, leicht unscharf, um als durchgehende dunkle Ringe zu erscheinen. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> Abbildung 2: Amöben, die in der Hellfeldmikroskopie abgebildet wurde, in ein Doppelsystem umgewandelt und verfolgt wurde. Die Amöbe mit 4-facher Vergrößerung im Hellfeld (links) wurde in binär umgewandelt, wobei Artefakte entfernt wurden (Mitte) und nach der Verfolgung ausgewählte Spuren angezeigt wurden (rechts). Obere Reihe: ein ganzes Bild, das durch Zusammenfügen von 4 Bildern aufgenommen wurde, Maßstabsleiste = 1000 μm. Untere Reihe: die Größe eines einzelnen Bildes vor dem Zusammenfügen, Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> Abbildung 3: Die unmittelbare Datenanalyseausgabe der Bildgebungs- und Tracking-Software enthält eine Vielzahl von Datentypen. Die repräsentative Ausgabe der Nachverfolgung ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der es sich um ein einzelnes Video handelt. Notieren Sie sich die Spurnummern (roter Pfeil) und die Skip-Nummern, die darauf hinweisen, dass die Tracking-Software Spuren, die nicht mit den Parametern übereinstimmten, korrekt entfernt hat. In diesem Beispiel wurden nur 71 von 5385 identifizierten Spuren mit den Parametern ausgerichtet. Dieses Verhältnis ist bei solch strengen Richtlinien normal. Diese Anzahl von Spuren stimmt auch mit der Anzahl der Amöben überein, die in diesem Protokoll verwendet werden (wenn z. B. eine 96-Well-Platte mit 200 μL von 7,5 x 103 KBE/ml pro Vertiefung besiedelt wird, dann sollte man mit etwa 1.500 Amöben in der Vertiefung rechnen und ungefähr so viele, die in einem 4-Stich-Sichtfeld sichtbar sind. Es wird wahrscheinlich viel mehr Spuren geben, als es Amöben gibt, da Amöben auf und aus dem Sichtfeld wandern und neue Spuren erzeugen). Diese Spurnummer ist auch in Abbildung 2 zu sehen, wo im Vergleich zu einer großen Anzahl von Punkten nur wenige Spuren sichtbar sind. Überprüfen Sie immer die Anzahl der Plätze in der Spur (rotes Kästchen), um sicherzustellen, dass nur die richtigen Spurlängen enthalten sind. Zum Beispiel beziehen wir hier mehr als 93 % der Frames ein, und es gab 127 Frames in diesem Abschnitt, sodass alle Spots über 118 liegen sollten. Gelb hervorgehoben sind die Messungen, die im Protokoll erwähnt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> Abbildung 4: Die Daten wurden nach der ersten Datenausgabe nach Bedarf neu organisiert. Organisation der gewünschten Daten nach dem Export. (A) Die zur Quantifizierung ausgewählten relevanten Messungen wurden aus dem Export der Tracking-Software kopiert (Abbildung 3) und in eine neue Tabelle eingefügt. (B) Nachdem die gewünschten Messungen in der neuen Tabelle organisiert wurden, sollte der Durchschnitt jeder Spur berechnet werden. In diesem repräsentativen Beispiel wurden also die Gesamtdistanz, die maximale Entfernung, der Einschluss, die mittlere Geschwindigkeit und die Verschiebung jeder nutzbaren Spur in diesem einzelnen Video für jede Messung auf eine singuläre Zahl gemittelt. Beachten Sie auch hier, dass insgesamt 71 Spuren die Parameter für die Frames 1-127 erfüllten. Es wird wahrscheinlich eine unterschiedliche Anzahl geeigneter Spuren für jedes analysierte Video- oder Frameset geben, wie in Abbildung 5 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> Abbildung 5: Sequenzielle Frames, die für die Analyse einer ganzen Bildserie oder eines Videos festgelegt sind. Dies ist ein repräsentatives Bild für die Hinzufügung von sequenziellen Videos zur Datenanalyse. Unter der Annahme, dass die Bilder 1-127 Stunde 1 des Videos darstellen (hier besteht 1 Stunde aus der Aufnahme eines Bildes alle 28 s). Die Frames 128 bis 254 sind die Stunde 2 des Videos und die Frames 255 bis 381 die Stunde 3 des Videos. Kombinieren Sie die exportierten Daten (wie in Abbildung 3 exportiert) aus allen Stunden in einem Blatt, um mit allen gleichzeitig zu arbeiten. Wie in Abbildung 4 dargestellt, werden die Daten aller verwendbaren Spuren für jedes Frameset/h gemittelt. Alles in Abbildung 5 sind die Daten aus einem Replikat oder einer Stichprobe. Wenn 3 Replikate vorhanden sind, gibt es 3 identisch angeordnete separate Tabellenkalkulationsregisterkarten, und die Daten aus diesen werden in eine neue Registerkarte eingespeist, wie in Abbildung 6 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> Abbildung 6: Zusammengesetzte Daten aller Amöben in jedem Frameset, die zur Darstellung eines einzelnen Replikats verwendet werden. (A) Alle Durchschnittswerte aus jedem in Abbildung 5 dargestellten Frame müssen an einem zentralen Ort erfasst werden, damit die abschließende Datenanalyse abgeschlossen werden kann. In diesem repräsentativen Bild werden die Durchschnittswerte der Gesamtentfernung aus den ersten drei Frame-Sets (oder Stunden) angezeigt. Dies muss für jedes ausgeführte Beispiel/jede Bedingung/jedes Replikat wiederholt werden. Anschließend müssen die Durchschnittswerte aus jedem Sample aus jedem Frame-Set gemittelt werden (gelbes Feld). Dies ist der letzte Datenpunkt, von dem aus die Standardabweichung und der Standardfehler berechnet werden können. Die einzelnen Durchschnittswerte aus jeder Stichprobe (hier die Zahlen in B3, B4 und B5 für die Gesamtdistanz Stichprobe 1; C3, C4 und C5 für Total Distance Sample 2 usw.) wird verwendet, um die statistische Analyse durchzuführen. Dieser Vorgang wird für alle erforderlichen Messungen (Maximale Entfernung, Einschluss, mittlere Geschwindigkeit, Verschiebung usw.) wiederholt. (B) Um eine grafische Darstellung der Quantifizierung zu erstellen, verwenden Sie die Zahlen im gelben Feld als Datenpunkte, die für das endgültige Diagramm verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> Abbildung 7: Rohe Motilitätsdaten für ATCC 30461 und ATCC 50370. Rohdaten (hier dargestellt als Mittelwert ± SE pro Stunde) wurden zuvor für frühere Studien erhoben und nicht veröffentlicht18,19. Diese Motilitätsquantifizierung zeigt, dass diese beiden Amöben in ihren ersten 6 Stunden Motilität (gemessen an der Gesamtstrecke in Mikrometern, die in dieser Stunde zurückgelegt wurde) in 1/4 Ringer's Lösung auf einer Glasoberfläche ähnlich sind. Jeder Zeitpunkt repräsentiert drei separate Replikate, die jeweils aus 20-200 Amöbenspuren bestehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

quantification-of-acanthamoeba-spp-motility

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Die Schwarmmotilität wird durch physikalische und Umweltfaktoren beeinflusst. Wir beschreiben ein zweistufiges Protokoll und Richtlinien, um die Herausforderungen zu umgehen, die üblicherweise mit der Vorbereitung und Datenerfassung von Schwarmassays verbunden sind. Ein makroskopisches bildgebendes Verfahren wird eingesetzt, um detaillierte Informationen über das Schwarmverhalten zu erhalten, die von den derzeitigen Analysetechniken nicht bereitgestellt werden.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Dieses Protokoll beschreibt zwei empfindliche Assays zur Unterscheidung zwischen leichter, mittelschwerer und schwerer motorischer Beeinträchtigung in C. elegans-Modellen der amyotrophen Lateralsklerose, mit allgemeinem Nutzen für C. elegans-Stämme mit veränderter Motilität.

Evaluation der motorischen Beeinträchtigung bei C. elegans Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aktinkometen auf den Oberflächen von Perlen mit kommerziell erhältlichen Proteinbestandteilen hergestellt werden können. Solche Systeme ahmen die hervorstehenden Strukturen in Zellen nach und können verwendet werden, um physiologische Mechanismen der Kraftproduktion auf vereinfachte Weise zu untersuchen.

Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.

Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

Erfahren Sie die Quantifizierung von Acanthamoeba-Motilität mittels Mikroskopie und Hochdurchsatz-Bildanalyse. Diese Methode liefert wertvolle Erkenntnisse zur Verhütung von Acanthamoeba-Keratitis.

Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität

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