Name: Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie glykosomale pH-Dynamiken in lebenden Trypanosoma brucei mit einem pH-Biosensor und Durchflusszytometrie messen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung parasitärer Stoffwechselantworten.

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pHluorin2-PTS1 wurde von Twist Bioscience, die das Konstrukt in einem High-Copy-Klonierungsvektor zur Verfügung stellten, in pLEW100v5 kloniert; pLEW100v5 war ein Geschenk von Dr. George Cross. Antiserum gegen T. brucei Aldolase ist auf Anfrage bei Dr. Meredith T. Morris, Clemson University, erhältlich. Die Arbeit der JCM- und KAC-Laboratorien wurde teilweise durch eine Auszeichnung der National Institutes of Health (R01AI156382) unterstützt. SSP wurde von NIH 3R01AI156382 unterstützt.

Entwicklung eines pHluorin2-basierten Sensors für den glykosomalen pH-Wert bei Trypanosoma brucei

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<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
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<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
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<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
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<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Umweltwahrnehmung und die Reaktionsmechanismen im afrikanischen Trypanosom sind kaum verstanden. Es ist bekannt, dass Veränderungen der Nährstoffverfügbarkeit verschiedene Reaktionen im Parasiten auslösen, einschließlich der Ansäuerung von Glykosomen. Hier haben wir eine Methode zur Untersuchung der glykosomalen pH-Reaktion auf Umweltstörungen in lebenden Zellen unter Verwendung eines vererbbaren Proteinsensors, pHluorin2, und Durchflusszytometrie beschrieben.
Bei der Verwendung des Sensor...

Parasitäre Kinetoplastiden sind wie die meisten lebenden Organismen auf Glukose als grundlegenden Bestandteil des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels angewiesen. Zu dieser Gruppe gehören medizinisch wichtige Organismen wie das afrikanische Trypanosom Trypanosoma brucei; das amerikanische Trypanosom, T. cruzi; und Parasiten der Gattung Leishmania. Der Glukosestoffwechsel ist entscheidend für das Wachstum von Parasiten in den pathogenen Lebenszyklusstadien. Wenn beispielsweise Glukose entzogen wird, stirbt die Blutbahnform (BSF) des afrikanischen Trypanosoms schnell ab. Insbesondere dient die Glykolyse als einzige ATP-Quelle in diesem Stadium der Infektion1. Leishmanienparasiten sind ebenfalls von Glukose im menschlichen Wirt abhängig, wobei das Amastigoten-Lebenszyklusstadium, das sich in Wirtsmakrophagen befindet, für das Wachstum auf diese Kohlenstoffquelle angewiesenist 2.
Während diese Parasiten unterschiedliche Lebensstile mit unterschiedlichen Insektenvektoren haben, haben sie viele Gemeinsamkeiten in der Art und Weise, wie sie auf Glukose reagieren und diese konsumieren. Zum Beispiel lokalisieren diese Parasiten die meisten glykolytischen Enzyme in modifizierten Peroxisomen, die Glykosomen genannt werden. Diese Kinetoplastid-spezifische Organelle ist mit Säugetier-Peroxisomen verwandt, basierend auf konservierten Biosynthesemechanismen und Morphologie 3,4,5,6.
Die Kompartimentierung der meisten Enzyme des glykolytischen Signalwegs in das Glykosom bietet parasitenspezifische Mittel zur Regulierung des Signalwegs. Mit Hilfe einer chemischen pH-Sonde konnten wir feststellen, dass Nährstoffentzug eine schnelle Ansäuerung von Parasitenglykosomen in prozyklischer Form (PF) auslöst, die zu einer veränderten glykolytischen Enzymaktivität führt, indem eine allosterische Regulatorbindungsstelle auf dem glykolytischen Schlüsselenzym Hexokinaseexponiert wird 7,8. In unseren früheren Arbeiten musste die chemische Sonde für den Einsatz ständig abgegeben werden, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte. Darüber hinaus schränkten Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Sondenverteilung im Glykosom im BSF den Nutzen des Ansatzes zur Untersuchung des glykosomalen pH-Werts in diesem Lebensstadium ein.
In dieser Studie haben wir den fluoreszierenden Protein-Biosensor pHluorin2 verwendet, um die glykosomale pH-Änderung in BSF T. brucei als Reaktion auf Umweltreize wie Glukosemangelzu überwachen 9 (Abbildung 1). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass BSF T. brucei Glykosomen als Reaktion auf Hunger schnell reversibel ansäuert, ähnlich wie wir es bei PF-Parasiten beobachtet haben. Wir erwarten, dass dieser Biosensor unser Verständnis der glykolytischen Regulation in T. brucei und verwandten Parasiten verbessern wird.

<table><tbody><tr><td>50 mL Gewebekulturflaschen (unbehandelt, steril)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche (unbehandelt, steril)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 & micro; L 384-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>MarkeTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Humaner T-Zell-Nukleofektor&nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Durchflusszytometer</td><td>invitrogen von Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>FlowJo Software</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, flache Bodenplatte</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 Plugin von ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>invitrogen von Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Durchflusszytometer</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie Sciences 16% Paraformaldehyd wässrige Lösung, EM-Qualität, 10 mL Ampulle</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>statistische Software</td></tr><tr><td>Nigericin (Natriumsalz)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nukleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>Abgekündigtes Produkt</td><td></td></tr><tr><td>OP2 Liquid Handler</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin, 0,1% (w/v) in H2</td><td>O Sigma Life Science</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>Pipettierroboter für HTS-Assay</td></tr><tr><td>Thiazole Red (TO-PRO-3)</td><td>biotium</td><td>#40087</td><td>Wir haben einen kundenspezifischen Acrylplattenständer entwickelt, damit diese Plattenmarke erkannt und auf unserem CytKick Max Auto verwendet werden kann Probenehmer</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Cayman Chemical 10009152</td><td></td><td>Pipettierroboter für HTS-Assay</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Für die pH-Kalibrierung</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Für die pH-Kalibrierung</td></tr></tbody></table>

messung dynamischer glykosomaler ph-Änderungen bei lebenden trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Der Glukosestoffwechsel ist für das afrikanische Trypanosom, Trypanosoma brucei, als essentieller Stoffwechselprozess und Regulator der Parasitenentwicklung von entscheidender Bedeutung. Über die zellulären Reaktionen, die entstehen, wenn sich der Glukosespiegel in der Umwelt ändert, ist wenig bekannt. Sowohl in Parasiten im Blutkreislauf als auch in prozyklischer Form (Insektenstadium) beherbergen Glykosomen den größten Teil der Glykolyse. Diese Organellen werden als Reaktion auf Glukoseentzug schnell angesäuert, was wahrscheinlich zu einer allosterischen Regulation von glykolytischen Enzymen wie Hexokinase führt. In früheren Arbeiten war die Lokalisierung der chemischen Sonde, die zur Durchführung von pH-Messungen verwendet wird, eine Herausforderung, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte.
Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Verwendung von Parasiten, die glykosomal lokalisiertes pHluorin2, einen vererbbaren Protein-pH-Biosensor, exprimieren. pHluorin2 ist eine ratiometrische pHluorin-Variante, die eine pH-abhängige (säureabhängige) Abnahme der Anregung bei 395 nm zeigt, während sie gleichzeitig eine Zunahme der Anregung bei 475 nm ergibt. Transgene Parasiten wurden durch Klonierung des offenen pHluorin2-Leserahmens in den Trypanosomen-Expressionsvektor pLEW100v5 erzeugt, was eine induzierbare Proteinexpression in beiden Lebenszyklusstadien ermöglicht. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die glykosomale Lokalisation des pHluorin2-Biosensors zu bestätigen, indem die Lokalisation des Biosensors mit der glykosomalen residenten Proteinaldolase verglichen wurde. Die Reaktionsfähigkeit des Sensors wurde bei unterschiedlichen pH-Werten kalibriert, indem Zellen in einer Reihe von Puffern mit einem pH-Wert von 4 bis 8 inkubiert wurden, ein Ansatz, den wir zuvor zur Kalibrierung eines pH-Sensors auf Fluoresceinbasis verwendet haben. Anschließend maßen wir die pHluorin2-Fluoreszenz bei 405 nm und 488 nm mittels Durchflusszytometrie zur Bestimmung des glykosomalen pH-Werts. Wir validierten die Leistung der lebenden transgenen pHluorin2-exprimierenden Parasiten und überwachten den pH-Wert im Laufe der Zeit als Reaktion auf Glukoseentzug, einen bekannten Auslöser der glykosomalen Ansäuerung bei PF-Parasiten. Dieses Tool hat eine Reihe potenzieller Anwendungen, einschließlich des potenziellen Einsatzes im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. Über den glykosomalen pH-Wert hinaus könnte der Sensor an andere Organellen angepasst oder in anderen Trypanosomatiden verwendet werden, um die pH-Dynamik in der lebenden Zellumgebung zu verstehen.

pHLuorin2-PTS1-Lokalisierung an Glykosomen in BSF T. brucei Um die subzelluläre Lokalisation des pHluorin2-PTS1 zu beurteilen, wurden die Parasiten Immunfluoreszenz-Assays unterzogen. Signal vom Transgen, das mit Antiseren kolokalisiert ist, die gegen ein Glykosomen-residentes Protein, Aldolase (TbAldolase), erhoben werden (Abbildung 2A). Der durchschnittliche Pearson-Korrelationskoeffizient der Kolokalisation zwischen Anti-TbAldolase und pHluorin2-PTS1 betrug 0,...

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Der Glukosestoffwechsel ist für Trypanosoma brucei von entscheidender Bedeutung, aber es ist wenig darüber bekannt, wie die Zellen den sich ändernden Glukosespiegel in der Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren. Wir haben Parasiten entwickelt, die einen pH-Biosensor exprimieren, der es uns ermöglicht, den glykosomalen pH-Wert in lebenden Parasiten zu überwachen, was zum Verständnis der dynamischen Reaktionen von Parasiten auf Nährstoffschwankungen beitragen wird. Eine Herausforderung für dieses Experiment wäre die Verfügbarkeit eines Durchflusszytometers, das mit einem Mikrotiterplattenleser ausgestattet ist, sowie die entsprechenden Filtersets zur Messung der Biosensorfluoreszenz.Darüber hinaus ist T. brucei ein Organismus der Risikogruppe zwei, daher muss das Zytometer in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe zwei untergebracht werden. Es wurde entdeckt, dass der pH-Wert von Glykosomen die Glykolyse beeinflussen kann, da Hexokinase und Phosphofructokinase pH-empfindlich sind. Die zuvor verwendeten pH-Sonden zielten jedoch nicht genau auf das Glykosom in der Blutbahnform ab.Es wurde ein besseres Werkzeug benötigt, um die Beziehung zwischen glykosomalem pH-Wert und Glykolyse

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Glykosomendynamik in afrikanischen Trypanosomen ist mit traditionellen zellbiologischen Techniken wie Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie schwer zu untersuchen.  Um das Verhalten dynamischer Organellen zu beobachten, wurde ein Fluoreszenz-Organellen-Reportersystem in Verbindung mit der Durchflusszytometrie verwendet, um die Echtzeit-Glykosomendynamik in lebenden Parasiten zu überwachen.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Das Hinzufügen eines Tags zu einem Protein ist eine mächtige Möglichkeit, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Hunderte von Trypanosoma brucei-Proteinen parallel endogen zu markieren, so dass eine Markierung im Genommaßstab möglich ist.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Afrikanische Trypanosomen, die in vitro gezüchtet werden, durchlaufen eine geringe antigene Variation, so dass die Populationen aus Parasiten bestehen, die eine dominante Variante des Oberflächenglykoproteins (VSG)-Typs exprimieren, und einer kleinen Population von "geschalteten" Varianten.  Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Populationen.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

Wir beschreiben einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der β-Galactosidase-Aktivität in drei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit. Dieser Assay kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

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Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

Erfahren Sie, wie Sie glykosomale pH-Dynamiken in lebenden Trypanosoma brucei mit einem pH-Biosensor und Durchflusszytometrie messen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung parasitärer Stoffwechselantworten.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

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