Messung des assoziativen Lernens in der Chemotaxis des Fadenwurms Caenorhabditis elegans

Eine der faszinierendsten Fragen in der Neurowissenschaft ist, wie das Lerngedächtnis aus der Plastizität von Neuronen entsteht. Sowohl Plastizität als auch Lernen nehmen mit dem Alter ab. Aber es ist weitgehend unklar, warum wir die Mechanismen untersuchen, die für diesen Rückgang verantwortlich sind.

Verwendung der Nematodenmodellorganismen in Neuritis elegans. Es ist klar geworden, dass nahezu jedes Verhalten von C. elegans von Kontext und Erfahrung abhängt und dass sie Mechanismen des assoziativen und nicht-assoziativen Lernens mit anderen Organismen teilen. Bemerkenswerterweise sind wichtige Faktoren für das Lernen von C. elegans, wie neuronale Aktivität und Insulinsignalübertragung, ebenfalls an der Regulierung der Juckreizprozesse im Gehirn und sogar des gesamten Organismus beteiligt.

Die grundlegende Technologie wird verwendet, um Chemotaxis geteilte Petrischalen mittels Mikroskopen zu untersuchen. Wir verwenden außerdem Kameras mit Tracking-Software und eigens gebaute Verhaltenskammern für Trajektorienverfolgung und Kalziumbildgebung mit Mikrofluidik, um die physiologischen Mechanismen hinter den Verhaltensweisen auf der Petrischale zu visualisieren. Derzeit wurden C.elegans-Sort-Chemotaczien-Assays entweder auf Gradientplatten oder Quadrantenplatten durchgeführt.

Gradientenplatten können anspruchsvoll sein, da sich der Gradient im Laufe der Zeit ändert, und bei Quadrantenplatten wurden sie nur verwendet, um zwei verschiedene Salzkonzentrationen zu vergleichen. Deshalb haben wir für diesen Assay die Verwendung von weißen Platten eingeführt. Wir wollen verstehen, warum die Lernfähigkeit, die von neuronaler Plastizität abhängt, mit dem Alter abnimmt.

Wir wollen den Chemotaxis-Test nutzen, um zu testen, ob bestimmte Signalwege für diesen Rückgang verantwortlich sind. Auf dieser Grundlage wollen wir Behandlungen entwickeln, die auf diesen altersbedingten kognitiven Abbau abzielen. Um mit dem Wachstum der Nematoden zu beginnen, werden mittelgroße Schneckenplatten mit lebender Escherichia coli OP 50 gefüttert.

Fügen Sie Caenorhabditis elegans N zwei auf den Teller und lassen Sie sie über Nacht bei 20 Grad Celsius verkehrt herum aufbewahren, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Am nächsten Tag werden 30 junge erwachsene Caenorhabditis elegans auf die Wachstumsplatte der Nematoden übertragen. Lassen Sie Tiere etwa acht Stunden lang Eier bei 20 Grad Celsius legen.

Nach der zeitlich begrenzten Eiablage nehmen Sie alle erwachsenen Würmer vom Teller. Den Teller drei Tage lang kopfüber bei 20 Grad Celsius kultivieren. Für den Test wird die Hälfte der Charge der gewünschten Gruppen von Konditionierungsplatten mit 200 Mikrolitern OP 50 pro Platte ausgesät.

Lassen Sie die ausgesäten Platten über Nacht bei 20 Grad Celsius in einem Brutkasten neben den unbesäten Platten trocknen. Bereiten Sie die gewünschte Konzentration einer Liter Natriumchloridlösung in einer Glasflasche vor. Lassen Sie die Flaschen 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren.

Dann lassen Sie die Flaschen 30 Minuten bei 55 Grad Celsius in einem Wasserbad abkühlen. Beschrifte währenddessen den unteren Teil des YP-Baum-Trichterabschnitts mit der entsprechenden Natriumchloridkonzentration und zeichne einen Kreis mit einem Radius von fünf Millimetern um die Plattenmitte, wo die Wände aufeinandertreffen. Stellen Sie jede Flasche einzeln auf einen beheizten magnetischen Rührer.

Geben Sie 25 Milliliter einer molaren Kaliumphosphatlösung mit pH sechs zu jeder Flasche. Zwei Minuten lang gründlich verrühren. Dann gibt man beim Rühren nacheinander Calciumchlorid, Cholesterin und Magnesiumsulfat hinzu.

Als Nächstes wird das Null-Millimolar-Medium in ein Fach einer Y-Petrischale eingelagert, bis es die Oberseite der Innenwand erreicht. Und lass das Medium etwa fünf Minuten lang fest werden. Bringen Sie das 100-millimolare Medium in das zweite Kompartiment der Y-Petri-Schale ein, bis es den erstarrten Null-Millimolar-Abschnitt berührt, der daneben liegt.

Dann benutze eine sterile 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Oberflächenspannung entlang der y-Wand zu durchbrechen und sie mit dem Null-Millimolar-Natriumchlorid-Abschnitt zu verbinden. Lass das Medium fünf Minuten lang fest werden. Bringen Sie das 50-millimolare Medium in das verbleibende Kompartiment der Y-Petri-Schale ein, bis es die erstarrten null-millimolaren und 100-millimolaren Abschnitte berührt.

Dann verwenden Sie eine sterile 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Oberflächenspannung entlang der Y-Wand zu durchbrechen und den 50-millimolaren Natriumchloridabschnitt mit den anderen beiden Abschnitten zu verbinden. Nachdem das Medium fünf Minuten lang fest geworden ist, lagern Sie die Teller über Nacht bei 20 Grad Celsius. Um zu beginnen, pipettiere einen Milliliter sterilen M neun auf eine Wachstumsplatte mit Caenorhabditis elegans.

Drehen Sie die Platte vorsichtig, um die Würmer aus dem OP 50 Bakterienrasen und der Schnecke zu lösen, sodass eine Suspension entsteht. Kippen Sie die Platte, um die Schneckenfederung in M neun Puffer mit einer Ein-Milliliter-Kunststoffpipettenspitze aufzufangen, deren oberer Teil abgeschnitten ist. Übertragen Sie die Federung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Lassen Sie die Würmer etwa 60 Sekunden am Boden der Mikrozentrifugenröhren absinken und bilden Sie so ein Pellet. Dann entfernen Sie das Überlagermittel mit einer Ein-Milliliter-Pipette, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie das Pellet zweimal mit einem Milliliter steriler M-Neun-Puffer.

Um den Rest OP 50 zu entfernen. Reese schwebt die Kugel in 300 Mikrolitern M neun Puffer. Nach der letzten Wäsche.

Drehen Sie die Suspension für eine gleichmäßige Verteilung der Würmer und übertragen Sie langsam 50 Mikroliter Schneckensuspension mit etwa 200 bis 300 Würmern auf jede Konditionierungsplatte. Bei Tellern, die mit OP 50 besaat sind, legen Sie den Wurmtropfen außerhalb des bakteriellen Futterplatzes ab und lassen Sie ihn in die Schnecke aufnehmen. Lassen Sie die Platten vier Stunden lang kopfüber in einem Inkubator bei 20 Grad Celsius aufbewahren.

Nach der Konditionierung pipettieren Sie einen Milliliter sterilen M-neun-Puffer auf eine Konditionierungsplatte und wirbeln sie sanft, um die Würmer zu lösen, die eine Suspension bilden. Dann kippe die Platte, um die Schneckenfederung mit einer Ein-Milliliter-Kunststoffpipettenspitze aufzufangen, und übertrage sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. In 60 Sekunden beruhigen sich die Würmer und bilden eine Kugel.

Nach dem Entfernen des Supernatants werden die Würmer zweimal mit einem Milliliter sterilem M-9-Puffer gewaschen. Dann füllen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit M-Neun-Puffer bis zur Ein-Milliliter-Marke. Sobald sich das Wurmpellet gebildet hat, entfernen Sie 960 Mikroliter des Supernatantens, ohne das Pellet zu stören.

Jetzt wirbeln oder schütteln Sie das Rohr sanft, um die Würmer wieder zu suspendieren. Übertragen Sie 20 Mikroliter dieser Suspension mit etwa 100 bis 150 Würmern in die Mitte einer Prüfplatte, wo die Y-Wand-Segmente aufeinandertreffen. Lass die Würmer 30 Minuten bei 20 Grad Celsius umherstreifen.

Dann zählen Sie die Anzahl der Würmer in jedem Abschnitt der Prüfplatte und zählen Sie sie nach 30 Minuten erneut. Berechnen Sie den Chemotaxis-Index pro Platte und Zeitpunkt mit der angegebenen Formel. Das Verhalten des Wildtyps Caenorhabditis elegans wurde durch vierstündige Konditionierung auf Platten mit unterschiedlichen Natriumchloridwerten mit oder ohne Nahrung signifikant beeinflusst.

Nach 30 Minuten auf der Prüfplatte zeigten Würmer, die mit hohen Natriumchloridkonzentrationen und Nahrung konditioniert wurden, sowie solche, die ohne Natriumchlorid und ohne Nahrung konditioniert waren, einen positiven Chemotaxisindex, was auf eine Präferenz für höhere Natriumchloridkonzentrationen hinweist. Umgekehrt zeigten Würmer, die mit hohen Natriumchloridkonzentrationen und ohne Lebensmittel, mittlere Natriumchloridkonzentrationen, ohne Lebensmittel und ohne Natriumchlorid mit Lebensmitteln konditioniert wurden, einen negativen Chemotaxisindex, was auf eine Präferenz für niedrigere Natriumchloridkonzentrationen hinweist. Die Natriumchlorid-Lebensmittelassoziation blieb nach 60 Minuten mit dem Chemotaczien-Index bestehen und veränderte sich oft bei Würmern, die mit Futter konditioniert sind, was auf dynamisches assoziatives Lernen hinweist, da Tiere diese Assoziation beim Herumstreifen und Nahrungssuchen aktualisieren.