Name: Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 40 s
Description: Erfahren Sie die intrafemorale Injektionstechnik für humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse. Diese Methode ermöglicht höhere Engraftment-Raten und verbessert die Analyse von Stammzellfunktionen im Kontext von Entwicklung und Alterung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Injektion von humanen HSPCs in den Femur von sublethal bestrahlten Mäusen

<ol><li>Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in man.</a> J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).</li>
<li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li>
<li>Laurenti, E., Göttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in numbers.</a> Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).</li>
<li>McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+short-term+repopulating+stem+cells+are+efficiently+detected+following+intrafemoral+transplantation+into+NOD%2FSCID+recipients+depleted+of+CD122%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells.</a> Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Belluschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelo-lymphoid+lineage+restriction+occurs+in+the+human+haematopoietic+stem+cell+compartment+before+lymphoid-primed+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors.</a> Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).</li>
<li>McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+CD4%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells+in+human+stem+cell+factor-%2C+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-%2C+and+interleukin-3-expressing+NOD-SCID+IL2R%CE%B3%28null%29+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice.</a> Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3%E2%88%92%2F%E2%88%92+KitW41%2FW41+%28NBSGW%29+Mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+is+more+efficient+in+female+NOD%2FSCID%2FIL-2Rgc-null+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients.</a> Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).</li>
<li>Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bone+marrow+HSC+transplantation+enhances+local+engraftment+at+the+expense+of+systemic+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice.</a> Sci Rep. 6, 23886(2016).</li>
<li>Mende, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+molecular+and+functional+features+of+extramedullary+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+reservoirs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans.</a> Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>Sanchez, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+xenotransplantation+model+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).</li>
<li>Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+intrafemoral+orthotopic+xenografts+of+peripheral+blood+or+bone+marrow+from+acute+myeloid+and+acute+lymphoblastic+leukemia+patients%3A+clinical+characterization%2C+methodology%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation.</a> Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).</li>
<li>Dobson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse-fated+latent+diagnosis+subclones+in+acute+B+lineage+leukemia+are+drug+tolerant+and+possess+distinct+metabolic+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs.</a> Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).</li>
<li>Marktel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrabone+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+for+adult+and+pediatric+patients+affected+by+transfusion-dependent+%C3%9F-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia.</a> Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 mL Insulinspritze mit 29 g x 12,7 mm Nadel</td><td>BD</td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Insulinspritze mit 29 g x 0,5" Nadel</td><td>BD</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tube</td><td>Fisherbrand</td><td>509-GRD-PFB</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze&nbsp;</td><td>HENKE SASS WOLF GMBH</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb 12 x 75 mm</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>FACS Röhrchen</td></tr><tr><td>5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappverschluss 12 x 75 mm</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>FACS Röhrchen</td></tr><tr><td>27 G 1/2" Nadel</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>300635</tr><tr><td>40 &micro; m Zellsieb für 50 mL Röhrchen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Rundbodenplatte&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>VITREX MEDICAL A/S</td><td></td><td></td></tr> 520213 <tr><td>BD LSR Fortessa X-20 Zellanalysator&nbsp;</td><td></td><td></td><td>BD-Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>Buphrenorphin</td><td>Animalcare</td><td>XVD190</td><td></td></tr><tr><td>CD14/PECy7 (Klon M5E2)</td><td>biolegend</td><td>301814</td><td>Wird bei 1 zu 1000</td></tr><tr><td>CD19/Alexa 700 (Klon HIB19)</td> <td>verwendet 302226 biolegend</td><td></td><td>Wird bei 1 zu 300</td></tr><tr><td>CD19/FITC (Klon HIB19)</td><td>biolegend</td><td>302206</td><td>Wird bei 1 zu 200</td></tr><tr><td>CD3/APCCy7&nbsp;( Klon HIT3a)</td><td>biolegend</td><td>300318</td><td>Verwendung bei 1 zu 100</td></tr><tr><td>CD33/APC (Klon P67.6)</td><td>BD</td><td>345800</td><td>Verwendung bei 1 zu 200</td></tr><tr><td>CD45/BV510 (Klon HI30)</td><td>biolegend</td><td>304036</td><td>Verwendung bei 1 zu 500</td></tr><tr><td>CD45/PECy5 (Klon 2D1)</td><td>biolegend</td><td>368526</td><td>Verwendung bei 1 zu 300</td></tr><tr><td>CompBeads Anti-Maus Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD</td><td></td><td></td>552843</tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Glycophorin A (GlyA)/PE (Klon GA-R2)</td><td>BD</td><td>340947</td><td>wird bei 1 von 1000</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td> <td>verwendetPAN-Biotech</td><td>P04-20250</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (IsoFlo 100% w/w Inhalationsdampf, flüssig)</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td></td></tr><tr><td>Microvette&nbsp; 300 Lithium-Heparin LH, 300 & Mikro; L</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>20.1309</td><td>Maus-Blutentnahmeröhrchen</td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse&nbsp;</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pancoll human, Dichte: 1.077 g/mL</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr></tbody></table>

intrafemorale injektion von humanen hämatopoetischen stamm- und vorläuferzellen in immungeschwächte mäuse 

Intrafemoral Injection of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells into Immunocompromised Mice

Die Transplantation der intrafemoral injizierten Zellen kann je nach Versuchsdesign jederzeit ab 24 h beurteilt werden. Zum Endzeitpunkt können IF, BM, PB und Milz erfasst werden. Diese können verarbeitet und der Grad der Transplantation mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden. Um eine humane Transplantation auch bei niedrigen Konzentrationen robust bezeichnen zu können, haben wir mit zwei unterschiedlichen Antikörpern gegen humanes CD45 gefärbt (Klon HI30 und Klon 2D1). Nur Zellen, die für beide Antikörper (CD45<s...

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Hematopoietic stem cells (HSCs) are defined by their lifelong ability to produce all blood cell types. This is operationally tested by transplanting cell ...

intrafemoral-injection-human-hematopoietic-stem-progenitor-cells-into

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS). CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSCs) werden aus menschlichen Buffy-Coat-Zellen aus Nabelschnurblut mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen isoliert. Die CD34+ HSCs werden in einem mit Zytokinen angereicherten Wachstumsmedium expandiert und kryokonserviert. Schließlich werden die aufgetauten HSCs in ein immundefizientes Mausjunges injiziert, um das HIS-Mausmodell zu etablieren.

Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur seriellen Probenahme von Femurknochenmark (BM), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht Längsschnittstudien der BM-Zusammensetzung von Mäusen im Zeitverlauf und ermöglicht den seriellen Zugang zu Zellen innerhalb des BM für ex vivo- und Transplantationsstudien.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Erfahren Sie die intrafemorale Injektionstechnik für humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse. Diese Methode ermöglicht höhere Engraftment-Raten und verbessert die Analyse von Stammzellfunktionen im Kontext von Entwicklung und Alterung.

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse

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