Ein Workflow zur quantitativen Bewertung der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa

[Moderator] Ein Workflow zur quantitativen Bewertung der endophytischen und epithetischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa. Hier haben wir einen detaillierten Workflow entwickelt und getestet, um das Mikrobiom zu untersuchen, das das innere Gewebe oder die Oberflächen der Rinde von Populus trichocarpa besiedelt. Dieser Workflow beschreibt detailliert die Probenahme der endophytischen und epithetischen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa, die Verarbeitung des gesammelten Materials, die Extraktion genomischer DNA, die PCR-Amplifikation von Zielregionen, die Vorbereitung von DNA-Bibliotheken und die Sequenzierung der endophytischen und epithetischen bakteriellen Mikrobiome mittels Next Generation Sequencing-Technologie. Wir bieten auch ein kurzes analytisches Verfahren für die erhaltenen Sequenzierungsdaten an. Dieser bewährte Arbeitsablauf wird einen effektiven Ansatz für die empirische Untersuchung der endophytischen und epithetischen Mikrobiomgemeinschaften der Rinde von Populus trichocarpa und anderen forstwirtschaftlichen Arten bieten. Züchten Sie drei Monate alte Populus tricocarpa-Setzlinge in einer Wachstumskammer, schneiden Sie die 10 Zentimeter langen Stängelsegmente von Populus trichocarpa mit einer sterilisierten Gartenschere von zwei bis 12 Zentimetern über der sterilisierten Bodenoberfläche ab. Legen Sie die Stängelsegmente in eine sterilisierte quadratische Petrischale. Wischen Sie die Epidermis des Stängels wiederholt auf der sterilisierten quadratischen Petrischalen mit steriler Watte mit 0,1% ab. Tween 20. Lagern Sie jedes Stück Baumwolle, das Mikroorganismen und Epithetikproben enthält, in einem sterilen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Stängeloberfläche abgewischt haben, schneiden Sie die Rinde mit einem sterilen Skalpell auf, schälen Sie die Rinde ab und legen Sie sie in eine quadratische Petrischale. Schneiden Sie die vom Stiel abgestreifte Rinde mit einem sterilen Skalpell in etwa einen Zentimeter große Segmente. Sterilisieren Sie die Segmentoberflächen, indem Sie sie zwei Minuten lang in 70%igem Alkohol einweichen, und weichen Sie die Segmente dann fünf Minuten lang in Natriumhypochlorit mit 0,1 %, Tween 80, ein. Zum Schluss die Segmente 30 Sekunden lang in 70%igem Alkohol sterilisieren. Waschen Sie dann alle Proben dreimal mit sterilem destilliertem Wasser und legen Sie sie zur Lufttrocknung auf eine saubere Bank. Lagern Sie jede sterilisierte endophytische Probe der Stammrinde in einem sterilen Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Legen Sie die Stängelrindenabschnitte in sterile Fünf-Milliliter-Hartröhrchen und geben Sie drei sterilisierte Stahlperlen in jedes Röhrchen. Frieren Sie die harten Röhrchen mit den Proben 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein. Zerkleinern Sie die Rindenproben fünf Minuten lang mit einem Schläger. Frieren Sie dann das harte Rohr erneut eine Minute lang in flüssigem Stickstoff ein und wiederholen Sie den Schritt des Perlenschlagens fünf Minuten lang. Geben Sie die zerkleinerte Stängelrinde von Populus trichocarpa und die an der Baumwolle haftenden epithetischen Bakteriengemeinschaften, jeweils 0,25 Gramm, zu jedem der Perlenröhrchen und fügen Sie dann 60 Mikroliter Lösung C1 hinzu, die von einem kommerziellen Kit geliefert und vorsichtig durch Inversion gemischt wird. Homogenisieren Sie anschließend die endophytischen und epithetischen Proben mit einem Bead Beater in vier einminütigen Durchläufen. Legen Sie die Proben nach jedem Lauf 30 Sekunden lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei der 10.000-fachen Schwerkraft, extrahieren Sie die endophytischen und epithetischen Proben mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers, geben Sie 30 Mikroliter Lösung C6 in die Mitte der weißen Filtermembran und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Eine Minute lang bei 10.000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zentrifugieren. Messen Sie die Konzentrationen der genomischen DNA, die aus epithetischen und endophytischen Proben extrahiert wurde, mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Verdünnen Sie jede DNA-Probe mit sterilem ddH2O auf zwei Nanogramm pro Mikroliter, um das DNA-Template für die PCR-Amplifikation zu erhalten. Amplifizieren Sie die V5- bis V7-Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens unter Verwendung des Forward-Primers 799F und des Reverse-Primers 1193R. In der Zwischenzeit amplifizieren Sie die V4-Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens mit dem Forward-Primer 5115F und dem Reverse-Primer 806R. Mischen Sie jede Probe gründlich und zentrifugieren Sie, um Blasen zu entfernen. Führen Sie eine Amplifikation der V5- bis V7- oder V4-Region der bakteriellen 16S rRNA-Gene auf einem Thermocycler durch. Laden Sie fünf Mikroliter jeder Probe Amplicon auf ein 1%iges Agarose-Gel und führen Sie eine Elektrophorese bei 120 Volt für 30 Minuten durch. Betrachten Sie das Gel unter UV-Licht, um eine erfolgreiche PCR-Amplifikation zu validieren. Mischen Sie für jede Probe drei Replikate der PCR-Amplifikationsprodukte in einem PCR-Röhrchen. Bestimmen Sie die Konzentration der amplifizierten Produkte mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader. Erstellen Sie eine Standard-DNA-Kurve und verwenden Sie sie, um die DNA-Konzentrationen der amplifizierten Produkte zu berechnen. Entsprechend ihrer gemessenen Konzentration werden die erhaltenen PCR-Produkte der endophytischen oder epiphytischen Proben aus der Rinde von Populus trichocarpa in gleicher Konzentration gemischt, um die Amplikon-Bibliothek aufzubauen. Führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese mit einem Elektrophoresegerät durch. Bereiten Sie kurz ein 1,3%iges Agarose-Gel, 1,3 Gramm Agarosepulver in 100 Millilitern einmaligem TAE-Puffer vor. Entfernen Sie die Waben nach der Gelverfestigung und geben Sie das Gel in einen Elektrophoresetank mit einmaligem TAE-Puffer. Fügen Sie als Nächstes eine Volumeneinheit von sechsmal orangefarbenem Ladepuffer zu fünf Volumeneinheiten jedes PCR-Produkts hinzu, wobei 100 Mikroliter der Leiter in jede Vertiefung geladen werden. Geben Sie 30 Mikroliter der DNA-Leiter in eine Vertiefung. Führen Sie nach dem Anschließen des Plus- und Minusdrahtes eine Elektrophorese von 80 Volt für 50 Minuten durch. Entfernen Sie DNA-Fragmente aus dem Agarose-Gel mit einem sauberen, scharfen Skalpell. Wiegen Sie die Gelscheibe und geben Sie sie in eine farblose Tube. Fügen Sie Puffer hinzu, um die Gelscheibe einzutauchen. Führen Sie die Gelextraktion mit dem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Bestimmen Sie die Konzentration der gereinigten Amplikon-Bibliothek auf einem Fluorimeter mit einem handelsüblichen Kit gemäß dem Herstellerprotokoll für die Sequenzierungsprofilerstellung. Lesen Sie Standard- und Probenröhrchen mit einem Fluorimeter ab und bestätigen Sie die Qualität der Bibliothek durch Visualisierung einer einzelnen Bande. Analysieren und annotieren Sie die 16S rRNA-Gensequenzen mit dem CHAM II. Erstellen Sie taxonomische Annotationen mit der Silver Database nach Referenzsequenzen. Visualisieren Sie diese Ergebnisse mit dem ggplot2-Paket in R. Es wurde hochwertige genomische DNA der endophytischen und epithetischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa erhalten. Die PCR-Amplifikation aller 12 Proben ergab einzelne starke Banden mit der richtigen Größe. Die Amplicon-Bibliothek wurde außerdem mit einem einzigen Peak aufgebaut, der die Anforderungen an die Vorsequenzierung erfüllte. Für die endophytischen Mikrobiome wurden qualitativ hochwertige Reads mit den Primerpaaren 799F/1193R bzw. 515F/806R erhalten. Das Primerpaar 799F/1193R lieferte signifikant weniger amplifizierte Pflanzen-Reads. Die Anzahl der ASVs aus dem epithetischen Mikrobiom der Rinde von Populus trichocarpa war bei Verwendung des 799F/1193R im Vergleich zu 515F/806R Primern signifikant höher. Es wurde geschätzt, dass der Shannon-Index in der epiphytischen Bakteriengemeinschaft der Rinde niedriger ist als in der endophytischen Bakteriengemeinschaft unter Verwendung des Primerpaares 799F/1193R. Die taxonomischen Eigenschaften der Bakteriengemeinschaften in den endophytischen und epiphytischen Rindenanteilen von Populus trichocarpa wurden mit dem Primerpaar 799F/1193R weiter untersucht. Es wurde ein zuverlässiger und effizienter Workflow von der Probenentnahme bis zur Datenanalyse entwickelt, um die Zusammensetzung und Diversität der endophytischen und epithetischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa zu quantifizieren. Unser Protokoll kann als Weg zur Untersuchung des Rindenmikrobioms von Gehölzarten dienen und ein besseres Verständnis der Eigenschaften von Bakteriengemeinschaften ermöglichen, die andere Gehölze bewohnen.