Name: Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Lernen Sie die biolumineszenzbasierte Überwachung zirkadianer Rhythmen in humanen intestinalen Organoiden. Diese Methode zeigt robuste Oszillationen bei differenzierten Zellen und gestörte Rhythmen im Stammzellzustand.

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Die humanen Darmenteroide wurden aus dem Labor von Dr. Michael Helmrath am Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) gewonnen. Diese Arbeit wurde von R01 DK11005 (CIH) und der Pilotfinanzierung des University of Cincinnati Cancer Center unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung durch die Bildgebung durch das Live Microscopy Core der University of Cincinnati (NIH S10OD030402).

Alle Experimente mit humanem Gewebe zur Erzeugung von HIEs wurden von einem IRB am CCHMC genehmigt (IRB#2014-0427). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
HINWEIS: Um das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zu veranschaulichen, haben wir Bmal1-luc humane Darmenteroide (HIEs) verwendet. Diese Enteroide durchliefen eine stabile lentivirale Transduktion22 mit dem pABpuro-BluF-Reporterplasmid, das den mit Luciferase fusionierten Bmal1-Promotor enthält, was die Aktivität des Bmal1-Promotors 21 zeigt.
1. Lentivirale Transduktion
<ol><li>Die lentivirale Transduktion22 wird unter stammzellangereicherten Bedingungen für HIEs durchgeführt. Stellen Sie insbesondere sicher, dass sich in HIEs innerhalb von 3-4 Tagen nach der Passage in das Darmwachstumsmedium Sphäroide bilden, wodurch stammzellangereicherte Bedingungen geschaffen werden.</li>
	<li>Nach der lentiviralen Transduktion22 führt man eine Antibiotikaauswahl mit 2 μg/ml Puromycin durch, gewinnt die Puromycin-resistenten HIEs zurück und passaget sie mit relativ hoher Dichte (d. h. 1 Vertiefung in 2 Vertiefungen) für 2-3x. Wenn die Wachstumsrate der HIEs langsam ist, fügen Sie dem Darmorganoid-Wachstumsmedium 10 μM ROCK-Inhibitoren (Y-27632) und 10 μM GSK-3-Inhibitoren (CHIR-99021) hinzu.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Organoiden für den Biolumineszenz-Assay
<ol><li>Tag 1: Passage HIEs zu 35 mm runden Schalen.<ol><li>Kurz gesagt, zur Erweiterung der HIEs mischen Sie die HIEs mit einer wachstumsfaktorreduzierten (GFR) 3D-Kulturmatrix und säen Sie sie auf 24-Well-Platten mit drei Tröpfchen à 10 μl 3D-Kulturmatrix pro Well. Fügen Sie 350 μl des HIE-Wachstumsmediums hinzu und wechseln Sie es jeden zweiten Tag. HINWEIS: Die Dichte von HIE in der 3D-Kulturmatrix ist entscheidend für das Wachstum von Enteroiden. Ungefähr sollte die Anzahl der Sphäroide in jedem Tröpfchen mehr als 50 überschreiten. Ist die Zahl niedrig, wird die Wachstumsrate des HIE negativ beeinflusst.</li>
		<li>Wenn die HIEs ausreichend wachsen (ca. 7 Tage nach der Nachpassage), sammeln Sie HIEs aus vier Vertiefungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Waschen Sie die HIEs mit dem kalten PBS mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.000 × g) für 40 s schnelles Schleudern, um Schmutz und überschüssige 3D-Kulturmatrix per Pipette zu entfernen.</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml des kalten PBS in das Pellet und wenden Sie physikalische Turbulenzen an, indem Sie bis zu 10x mit einer 1-ml-Insulinspritze spritzen, um die HIEs zu dissoziieren.</li>
		<li>Schleudern Sie die dissoziierten HIEs mit einer Tisch-Minizentrifuge wie in Schritt 2.1.3 herunter und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem HIE-Pellet auf Eis, um es ca. 3 Minuten lang abzukühlen.</li>
		<li>Geben Sie die GFR 3D-Kulturmatrix in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie sie mit dem HIE-Pellet. HINWEIS: Berechnen Sie die Menge der 3D-Kulturmatrix basierend auf der Anzahl der runden 35-mm-Schalen, die für das Experiment verwendet werden. In der Regel säen wir 30 μl 3D-Kulturmatrixtröpfchen pro runder Schale.</li>
		<li>Die Mischung aus HIEs und der 3D-Kulturmatrix in der Mitte der runden 35-mm-Schale aussäen und die Schale 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die 3D-Kulturmatrix zu verfestigen. HINWEIS: Die Dichte der Aussaat-HIEs sollte experimentell bestimmt werden. Anhand der Intensität der Biolumineszenz kann man die Anzahl der HIEs während dieses Prozesses bestimmen.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml vorgewärmtes Darmorganoid-Wachstumsmedium in jede Schale und inkubieren Sie die Schalen in einem CO2 -Inkubator bis zum nächsten Schritt.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3: Initiierung der Differenzierung<ol><li>Um die Differenzierung der HIEs einzuleiten, entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium hinzu. HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Rezepturen des HIE-Differenzierungsmediums23.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 4: Es ist kein zusätzlicher Prozess erforderlich.</li>
	<li>Tag 5: Ersetzen Sie das Medium der Enteroide durch 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium.</li>
	<li>Tag 6: Uhrensynchronisation und Aufzeichnung der Biolumineszenz<ol><li>Um die molekulare Uhr der Enteroide zu synchronisieren, fügen Sie 2 μl 100 μM Dexamethason (Dex) hinzu, um die Endkonzentration in jeder Schale auf 100 nM zu erhöhen, und inkubieren Sie die Schalen dann in einem CO2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2) für 1 h24.</li>
		<li>Bereiten Sie während des Dex-Zurücksetzens das Inkubationsluminometer vor. Überprüfen Sie den CO2 - Gehalt und die Temperatur des Inkubationsluminometers und stellen Sie es auf 5 % bzw. 37 °C ein. HINWEIS: Es wird empfohlen, das Innere des Inkubationsluminometers vor und nach jedem Gebrauch der Maschine mit 70% Alkohol abzuwischen, um es steril zu halten.</li>
		<li>Nach der Taktsynchronisation füllen Sie die Enteroide mit 3 mL vorgewärmtem Differenzierungsmedium auf, das 200 μM D-Luciferin enthält. HINWEIS: Da Luciferin lichtempfindlich ist, sollte das luciferinhaltige Medium mit Folie umwickelt und in einem 37 °C heißen Bad vorgewärmt werden, bevor es auf das Gericht aufgetragen wird.</li>
		<li>Stellen Sie die Schalen in einen 8-Well-Schalentisch des Inkubationsluminometers und decken Sie den Probenschalentisch mit seinem Deckel ab. Stellen Sie zwei Befeuchterkammern mit einem feuchten Tuch oder Schwamm auf die Oberseite des Probentisches. Dies ist ein einmaliger Vorgang. HINWEIS: Nach dem Start des Experiments sollte der Deckel des Inkubationsluminometers geschlossen bleiben, bis das Experiment beendet ist. Achten Sie darauf, die Taschentücher/Schwämme ausreichend zu befeuchten.</li>
		<li>Schließen Sie den Deckel des Geräts und starten Sie das Programm zur Messung der Biolumineszenz für die gewünschte Anzahl von Tagen und die gewünschte Auflösung.<ol><li>Wählen Sie in der Software die Bedingungseinstellungen aus, indem Sie auf die Registerkarte Bedingung klicken, und passen Sie die Einstellungen in diesem Bereich an: Anzahl der Gerichte, Messzeit, Hintergrundverarbeitung und Filtertyp. HINWEIS: Für diese Demonstration haben wir alle Gerichte von A bis H ausgewählt; Standardmesszeit, die von der Software auf der Grundlage der Anzahl der Gerichte bestimmt wird; Wartezeit für die Hintergrundverarbeitung und Filtertyp F0. Da es drei Filteroptionen gibt, können drei Leuchtfarben gleichzeitig gemessen werden.</li>
			<li>Nachdem Sie alle geeigneten Einstellungen basierend auf dem Experiment eingegeben haben, speichern Sie die Einstellungen mit OK.</li>
			<li>Um mit dem Ausführen des Experiments zu beginnen, klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen | Start-Schaltfläche (grünes Dreieckssymbol). Beobachten Sie die Daten als roh, rauschgefiltert oder trendbereinigt, indem Sie während des Ausführens von Experimenten oben auf dem Bildschirm der Software eine entsprechende Auswahl treffen. Klicken Sie auf die Registerkarten Raw, Rauschgefiltert oder Trendbereinigt , um die ausgewählten Daten zu beobachten.</li>
			<li>Beobachten Sie Signale bis zu 5 Tage lang. HINWEIS: Nach 5-tägiger Überwachung in einem inkubierenden Luminometer können die Enteroide aufgrund von Medienerschöpfung abzusterben beginnen. Um eine mögliche zirkadiane Störung während des Experiments zu vermeiden, führen wir für die Dauer des Experiments keinen Medienwechsel durch.</li>
			<li>Beenden Sie am Ende des Experiments die Ausführung, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp (blaues quadratisches Symbol) klicken, zur Registerkarte Datei wechseln und dann auf Speichern unter klicken. Speichern Sie die Daten im Kronos-Format. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle im Abschnitt Datei, indem Sie auf die Option Datei klicken und dann unter Datei zur weiteren Analyse die Option Als Excel-Format exportieren auswählen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Optimierung der menschlichen Darmenteroide für Studien zum zirkadianen Rhythmus

<ol><li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li>
<li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%3A+Influence+on+physiology%2C+pharmacology%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacokinet+Pharmacodyn%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li>
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<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li>
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<li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Der Biolumineszenz-Assay bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus, was eine Datenerhebung aus Langzeit-Zeitverlaufsexperimenten erfordert. Erstens ermöglicht es Forschern, die Genexpression oder das Protein von Interesse zu überwachen, während sich Zellen bewegen und vermehren. Ohne unnötige Anpassungen vorzunehmen oder die Zellfunktionen zu stören, können interessierte zelluläre Ereignisse oder die Genexpression mithilfe der Biolumineszenzauslesung aufgezeichnet werden, die zuverlässige Echtzeitdaten liefert. Wichtig ist, dass der Biolumineszenz-Assay im Vergleich zu Fluoreszenz-Assays nur minimales Hintergrundrauschen erzeugt, da er bei konstanter Dunkelheit durchgeführt wird25. Darüber hinaus ist der Biolumineszenz-Assay für die Langzeitüberwachung vorzuziehen, da die kontinuierliche Anregung für den Fluoreszenz-Assay über mehrere Tage eine hohe Phototoxizität und Photobleichung verursachen kann. Da es jedoch keine Lichtanregung gibt, liefert der Biolumineszenz-Assay ein schwächeres Signal als Fluoreszenzproteine26. Die kurze Halbwertszeit der Luciferase macht sie für zirkadiane Studien vorzuziehen und kann durch Hinzufügen zusätzlicher destabilisierender Sequenzen weiter verkürzt werden12.
Obwohl Biolumineszenz-Assays mehrere Vorteile für die Überwachung lebender Zellen bieten, haben sie einige Einschränkungen. Obwohl der Biolumineszenz-Assay eine robuste Auslesung für die zeitliche Genexpression oder Proteinüberwachung aus einer Zellpopulation bietet, ist seine räumliche Auflösung begrenzt, was ihn für Experimente, bei denen Proteinlokalisierungsdaten von einzelnen Zellen gesammelt werden, weniger praktikabel macht. In Anbetracht seiner Vor- und Nachteile ist der Biolumineszenz-Assay anderen Methoden, insbesondere für zirkadiane Studien, überlegen; Es bietet eine geringere Toxizität und eine hohe Empfindlichkeit, was es ideal für die Langzeitüberwachung macht.
In der Phase der experimentellen Vorbereitung müssen mehrere kritische Faktoren berücksichtigt werden. In erster Linie ist die Implementierung einer geeigneten Selektionsstrategie für die lentivirale Transduktion von entscheidender Bedeutung; In unserem Fall führten wir 2 Wochen lang eine Puromycin-Selektion von 2 μg/ml durch. Eine unzureichende Durchführung der Selektion kann zu einer unzureichenden Anzahl von Enteroiden führen, die das Reporterplasmid beherbergen, was zu inkonsistenten Luciferase-Expressionsniveaus führt. Eine optimale Aussaatdichte ist ebenso wichtig; Eine zu hohe Dichte kann während des Versuchs zu einer vorzeitigen Nährstofferschöpfung führen, da nach Beginn der Biolumineszenzaufzeichnung kein Ersatz des Mediums erfolgt. Umgekehrt kann eine geringe Dichte von HIEs zu einer verringerten Biolumineszenzleistung führen, wodurch die Robustheit der Auslesung beeinflusst wird. Die Gewährleistung einer geeigneten Umgebung für Enteroide während der Überwachung ist von grundlegender Bedeutung für die Zuverlässigkeit der experimentellen Ergebnisse. Die Aufrechterhaltung optimaler Bedingungen, einschließlich CO2, Temperatur und Luftfeuchtigkeit, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung von HIEs und fördert die Robustheit der zellulären Prozesse in den Darmoiden. Abweichungen von der optimalen Temperatur und dem CO2 - Spiegel können den Zellstoffwechsel und die Signalwege beeinflussen und möglicherweise den zirkadianen Rhythmus beeinflussen. Eine angemessene Luftfeuchtigkeit ist ebenso wichtig, um Austrocknung zu verhindern und die strukturelle Integrität der Enteroide zu erhalten. Daher ist die sorgfältige Berücksichtigung der Umweltbedingungen entscheidend für die Genauigkeit des experimentellen Modells und der zirkadianen Studien mit Enteroiden.
Die Uhrensynchronisation ist für zirkadiane Studien unerlässlich, da sie die innere zirkadiane Uhr der einzelnen Zellen ausrichtet und sicherstellt, dass sie sich in einem einheitlichen und koordinierten Zustand befinden. Diese Synchronisation ist notwendig für die genaue Beobachtung und Analyse der zirkadianen Rhythmizität auf der Ebene einer gesamten Kultur. In diesem Protokoll haben wir eine Taktsynchronisation mit 100 nM Dexamethason (Dex) durchgeführt. Es könnte einige Bedenken hinsichtlich der Wirkung von Dex auf die Zellstruktur oder -funktion geben. Frühere Forschungen deuten darauf hin, dass Kortikosteroide die epitheliale Barrierefunktion in Enteroiden verbessern27. Es ist jedoch wichtig hervorzuheben, dass dieser Phänotyp nach der Behandlung von Enteroiden mit 10 μM Prednisolon für 12 Stunden beobachtet wird. Wir gehen davon aus, dass eine kurze 1-stündige Behandlung mit Dexamethason keine signifikanten Veränderungen in Bezug auf die Struktur und Funktion der Zellen in den Enteroiden hervorruft.
Die Überwachung der Biolumineszenzaktivität der Organoidkultur anstelle der homologen Einzelzellkultur besitzt einzigartige Stärken. Zunächst interagieren mehrere Zelltypen in einer Organoidkultur wie in vivo-Gewebe miteinander, während eine typische 2D-Zellkultur die interessierte Genexpression in einer Art isolierter Umgebung überwacht, die aus einem einzigen Zelltyp besteht. Die Organoidkultur liefert realistischere Ergebnisse mit multizellulären Wechselwirkungen und Signalwegen. Die Zell-zu-Zell-Interaktion ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere für die Studien zur Differenzierung und zum interzellulären Signalweg, die eine heterogene Zellkultivierung erfordern28. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass HIEs in der differenzierten Bedingung robuste zirkadiane Oszillationen, aber gestörte zirkadiane Rhythmen in der stammzellangereicherten Bedingung zeigen. Diese Daten deuten auf einen möglichen Umbau der zirkadianen Uhrmaschinerie von adulten Stammzellen zu differenzierten Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Organoide mit einem zirkadianen biolumineszenten Reporter die Untersuchung der zirkadianen Rhythmen in einem multizellulären in vitro System ermöglichen und die Funktionen der zirkadianen Rhythmen auf physiologisch relevantere Weise aufdecken.

Zirkadiane Uhr Alle Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren, haben eine komplexe und dynamische Beziehung zu ihrer Umwelt. Innerhalb dieser Beziehung ist die Anpassung an Umweltveränderungen entscheidend für das Überleben von Organismen. Die meisten Organismen verfügen über zirkadiane Rhythmen, die es ihnen ermöglichen, sich an Tageszyklen von etwa 24 Stunden anzupassen und ihre Funktionen zu optimieren. Die zirkadiane Uhr ist ein hierarchisches Netzwerk aus zentralen und peripheren Uhren, die zusammenarbeiten, um die physiologische Homöostase aufrechtzuerhalten und den Organismus mit den täglichen Veränderungen synchron zu halten 1,2. Bei Säugetieren empfängt die Zentral- oder Hauptuhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) externe Signale wie Licht und leitet die Informationen über ein fortschrittliches Zusammenspiel von neuronalen und humoralen Signalwegen an die peripheren Uhrenweiter 3. Zusätzlich zur zentralen Uhr verfügen periphere Gewebe über einen eigenen zellautonomen zirkadianen Uhrmechanismus, der durch eine transkriptionell-translationale negative Rückkopplungsschleife (TTFL) aufrechterhalten wird, die gewebespezifische uhrgesteuerte Gene (CCGs) reguliert4,5. Diese molekulare Maschinerie erzeugt eine Rhythmizität von etwa 24 Stunden bei zellulären und physiologischen Ereignissen, wie z. B. Genexpressionen, Signalwegen, Immunantworten und Verdauung. Die zirkadiane Uhr ist in fast allen Säugetierzellen vorhanden, und es wurde gezeigt, dass bis zu 50 % der Expressionsmuster der Gene eine zirkadiane Rhythmizität aufweisen6. In Anbetracht der Fülle an CCGs kann eine Störung dieses Uhrwerks zu kritischen physiologischen Problemen führen. Daher sind Untersuchungen des zirkadianen Rhythmus notwendig, um wesentliche biologische Mechanismen aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.
Luziferase-Reportersystem In zirkadianen Studien ist die Echtzeitüberwachung entscheidend für ein besseres Verständnis zellulärer Verhaltensweisen und Reaktionen, da sie die Verfolgung zeitlicher Veränderungen der Genexpression und/oder des Proteinspiegels ermöglicht und Einblicke in die molekularen Mechanismen liefert, die von der zirkadianen Uhr reguliert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Echtzeitüberwachung den Forschern, die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf molekulare Mechanismen zu untersuchen 7,8. Es gibt zahlreiche Techniken für Echtzeit-Überwachungsstudien, einschließlich des Biolumineszenz-Assays, der häufig zur Verfolgung der Genexpression oder des Proteinspiegels im Laufe der Zeit verwendet wird. Der Biolumineszenz-Assay ist eine Methode zum Nachweis biologischer Prozesse unter Verwendung der Lichterzeugung als Auslese. In diesem Assay wird ein oxidatives Enzym, das Biolumineszenz erzeugt (z. B. Luciferase), entweder vorübergehend oder stabil in die interessierenden Zellen transfiziert, und die Biolumineszenzauslesung wird in Gegenwart eines Substrats (z. B. Luciferin) über die Zeit gemessen. Zum Beispiel erzeugt das Luciferase-Enzym Biolumineszenz, indem es das Substrat Luciferin in Gegenwart von ATP9 oxidiert. Aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit von 3-4 h10 ist die Glühwürmchen-Luziferase ein leistungsstarkes Werkzeug für zirkadiane Studien, da sie eine dynamische Echtzeitüberwachung mit minimalem Hintergrundrauschen ermöglicht 11,12,13. Für die Insertion von DNA mit einem Luciferase-markierten Promotor oder Open Reading Frame (ORF) ist das lentivirale Gen-Delivery-System eine zuverlässige Methode, die eine hohe Transduktionswirksamkeit, eine stabile Integration und eine geringe Immunogenität bietet. Die stabile Transduktion eines biolumineszenten Reporters sorgt für eine robuste Expression in sich teilenden und nicht teilenden Zellen und liefert konsistente Daten für zirkadiane Studien14.
Organoid als Modell Traditionelle immortalisierte zweidimensionale Zelllinien waren maßgeblich an biologischen Studien beteiligt, die von der Aufdeckung grundlegender molekularer Mechanismen des zirkadianen Rhythmus bis hin zum Wirkstoffscreening reichen. Trotz der Bequemlichkeit, homogenisierte Zelllinien zu verwenden, fehlen ihnen multizelluläre Strukturen und interzelluläre Interaktionen. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei Organoiden um multizelluläre "organähnliche" In-vitro-3D-Strukturen, die die Organstruktur in einer Schale nachahmen, indem sie Ähnlichkeit mit der in vivo-Gewebearchitektur und Vielzelligkeit aufweisen, einschließlich Stamm-, Vorläufer- und differenzierten Zelltypen15,16. Der Besitz von Selbstorganisation, Vielzelligkeit und Funktionalität macht Organoide zu einem bemerkenswerten In-vitro-Modell, das die zellulären und physiologischen Prozesse darstellt, die in realen Geweben ablaufen17. Verschiedene Arten von Organoiden können aus pluripotenten Stammzellen durch gerichtete Differenzierung oder adulten Stammzellen gewonnen werden, die aus verschiedenen Organen, einschließlich Dünndarm, Gehirn, Leber, Lunge und Niere entnommen werden,18,19. Da organoide Strukturen eine echte gewebeähnliche Architektur besitzen und mit Vielzelligkeit und dynamischer Zell-zu-Zell-Interaktion funktionieren, sind sie homogenisierten Zelllinien überlegen, um die zellulären Ereignisse in in vivo-Geweben zu verstehen. Organoide sind außerdem leicht zu manipulieren und können unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden, was sie für zirkadiane Studien nützlich macht20.
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Einführung einer Echtzeit-Überwachungsmethode unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, der speziell auf die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus in multizellulären 3D-Organoiden zugeschnitten ist. Die Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse mit einer Biolumineszenz-Assay-Technik wurde häufig für Zellkulturen durchgeführt, denen die multizelluläre Komplexität und interzelluläre Kommunikation fehlt, die in echtem Gewebe vorhanden sind. 3D-Organoide bieten einzigartige Möglichkeiten, die Funktionen des zirkadianen Rhythmus in multizellulären Systemen in vitro zu untersuchen. Man könnte zum Beispiel zirkadiane Rhythmen in den Organoiden mit veränderten Zellzusammensetzungen oder Organoiden untersuchen, die aus erkranktem Gewebe von Patienten stammen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, um verschiedene Aspekte des zirkadianen Rhythmus in einem physiologisch relevanteren In-vitro-Modell , Organoiden, zu untersuchen, was uns helfen wird, die Rolle des zirkadianen Rhythmus in peripheren Organen besser zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>35 x 10 Falcon Gewebekulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine IV Insulinspritzen Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-829-1Bb</td><td>Hersteller: BD 329424</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>GSK-3 Inhibitor</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin (Kaliumsalz)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I Human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9020</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>06010</td><td>bestehen aus IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL und Organoid Supplement, 50 mL. Mischen Sie beides im Verhältnis 1:1, um es als Darmorganoid-Wachstumsmedium zu verwenden</td></tr><tr><td>Kronos Dio Luminometer Machine</td><td>ATTO Corporation</td><td>AB-2550</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>pABpuro-BluF Reporterplasmid</td><td>Addgene</td><td>46824</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Calcium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254/10</td><td>ROCK-Inhibitor</td></tr></tbody></table>

Überwachung zirkadianer oszillationen mit einem biolumineszenz-reporter in organoiden

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Die meisten lebenden Organismen besitzen zirkadiane Rhythmen, d. h. biologische Prozesse, die innerhalb eines Zeitraums von etwa 24 Stunden ablaufen und ein vielfältiges Repertoire an zellulären und physiologischen Prozessen regulieren, die vom Schlaf-Wach-Rhythmus bis zum Stoffwechsel reichen. Dieser Uhrmechanismus zieht den Organismus auf der Grundlage von Umweltveränderungen mit und koordiniert die zeitliche Regulation molekularer und physiologischer Ereignisse. Zuvor wurde gezeigt, dass autonome zirkadiane Rhythmen auch auf Einzelzellebene aufrechterhalten werden, indem Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten verwendet werden, die maßgeblich an der Aufdeckung der Mechanismen des zirkadianen Rhythmus beteiligt waren. Bei diesen Zelllinien handelt es sich jedoch um homogene Kulturen, denen es an Vielzelligkeit und robuster interzellulärer Kommunikation mangelt. In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von 3D-Organoiden durchgeführt, bei denen es sich um in vitro multizelluläre Systeme handelt, die in vivo morphologischen Strukturen und Funktionen ähneln. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion zirkadianer Rhythmen mit Hilfe eines biolumineszierenden Reporters in humanen intestinalen Enteroiden beschrieben, das die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in multizellulären Systemen in vitro ermöglicht.

Es wurde eine Biolumineszenzaufzeichnung durchgeführt, um die zirkadiane Rhythmizität von humanen Darmenteroiden (HIEs) unter zwei unterschiedlichen Bedingungen zu beurteilen: stammzellangereicherte Bedingungen unter Verwendung von Darmorganoid-Wachstumsmedium (Abbildung 3) im Vergleich zu differenzierungsinduzierenden Bedingungen, die durch den Ersatz des Darmorganoid-Wachstumsmediums durch ein Differenzierungsmedium erreicht wurden. Am Tag des Experiments synchronisierten wir die zirkadianen Uhren, indem wir eine 1-stündige Behandlung mit 100 nM Dexamethason durchführten. Anschließend ersetzten wir das Medium entweder durch 3 mL Darmorganoid-Wachstumsmedium oder Differenzierungsmedium, das mit 200 μM D-Luciferin ergänzt wurde, und begannen mit der Überwachung der Biolumineszenzaktivität. Nach einem Aufzeichnungszeitraum von 4-5 Tagen führten wir eine Fast-Fourier-Transformation (FFT)-Analyse durch, um den Zeitraum der beobachteten zirkadianen Rhythmen zu bestimmen. Abbildung 3 zeigt die zeitliche Dynamik der Bmal1-Promotoraktivität unter den oben genannten Bedingungen. Unter differenzierenden Bedingungen zeigte die Bmal1-luc-Biolumineszenz robuste zirkadiane Oszillationen mit einer mittleren Periodizität von 22,92 h. Im Gegensatz dazu zeigten HIEs gestörte zirkadiane Rhythmen unter stammzellangereicherten Bedingungen (Abbildung 3). Diese Daten zeigen, dass HIEs unter stammzellangereicherten Bedingungen keine robusten zirkadianen Oszillationen aufweisen. Mit anderen Worten, man müsste den Einfluss der Wachstumsbedingungen in Bezug auf den zirkadianen Rhythmus bewerten, bevor man die von der zirkadianen Uhr abhängigen Funktionen in Organoiden untersucht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. HIEs werden an Tag 1 in 35-mm-Schalen gegeben und bis Tag 3 mit 2 mL Wachstumsmedium kultiviert. Am dritten Tag nach der Passage wird das Medium durch 2 ml vorgewärmtes Differenzierungsmedium ersetzt, um die Differenzierung der Enteroide zu initiieren. Der Mediumwechsel wird an Tag 5 mit 2 ml vorgewärmtem Medium wiederholt, um einen Nährstoffmangel zu verhindern. An Tag 6 werden die Enteroide 1 h lang mit 100 nM Dexamethason zur Synchronisation der zirkadianen Uhr behandelt. Nach einer Stunde wird das Medium durch 3 mL 200 μM D-Luciferin-haltiges Medium ersetzt, und die Schalen werden in das Inkubationsluminometer eingebaut. Nachdem die Biolumineszenz-Expression 4-5 Tage lang aufgezeichnet wurde, wird das Experiment beendet und die generierten Daten werden zur weiteren Analyse als Tabellenkalkulationen exportiert. Abkürzung: HIE = human intestinal enteroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig02.jpg"> Abbildung 2: Ein repräsentatives Bild für HIEs unter Wachstumsmedium. Das Bild wurde mit einem Weitfeldmikroskop mit einem 25-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsleiste = 1 mm. Abkürzung: HIE = human intestinal enteroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig03.jpg"> Abbildung 3: Biolumineszenz-Aufzeichnungen von HIEs unter stammzellangereicherten und Differenzierungsbedingungen. (A) Rohe und (B) trendbereinigte Biolumineszenz-Aufzeichnungsdaten von Bmal1-luc HIEs unter stammzellangereicherten (rot) und Differenzierungsbedingungen (schwarz). (C) Periode von Bmal1-luc-Oszillationen in HIEs unter Differenzierungsbedingungen. Die Periode wird mit der FFT-Analyse berechnet; n = 3 für Bmal1-luc HIEs unter stammzellangereicherten Bedingungen und n = 4 für Bmal1-luc HIEs unter Differenzierungsbedingungen. Fehlerbalken zeigen SD an. Abkürzungen: HIE = human intestinal enteroid; FFT = Schnelle Fourier-Transformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Rezepte für Differenzierungsmedien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Name des Reagenzes</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>Kommentare</td>
		</tr><tr><td>Erweitertes DMEM/F12</td>
			<td>Lebenstechnologien</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
			<td>Fügen Sie als letzte Komponente hinzu. Wenn Sie 50-ml-Medien vorbereiten, füllen Sie nach dem Hinzufügen aller anderen Komponenten den Rest bis zu 50 mL mit Advanced DMEM/F12 am Ende.</td>
		</tr><tr><td>A 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>B-27 Zuschlag (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gastrin I Mensch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Nr. G9020</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>ca. 10 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-2 Zuschlag (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Nr. A9165</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>NOGGIN Konditioniertes Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
			<td>Hergestellt im Labor</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Rekombinanter muriner EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>50 ng/ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>R-SPONDIN Konditioniertes Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10%</td>
			<td>Hergestellt im Labor</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der HIE-Differenzierungsmedien23.

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Unser derzeitiger Forschungsschwerpunkt besteht darin, die Rolle des zirkadianen Rhythmus bei der Proliferation und Differenzierung von Darmepithelzellen zu untersuchen. Wir versuchen herauszufinden, ob die zirkadiane Uhr die Zellproliferation und die Differenzierung von Darmstammzellen reguliert. Dieses Protokoll stellt eine Echtzeit-Überwachungsmethode für zirkadiane Studien an dreidimensionalen Organoiden unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays dar.Im Gegensatz zur Durchführung von Biolumineszenz-Assays in einer herkömmlichen zweidimensionalen Zellkultur ermöglicht uns dieser Ansatz, zirkadiane Rhythmen und ihre Funktionen in einem physiologisch relevanteren Organoid-Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen gestörte zirkadiane Rhythmen in stammzellangereicherten Zuständen und zeigen gleichzeitig robuste zirkadiane Oszillationen in differenzierten menschlichen Darmorganoiden, was auf eine Umgestaltung der zirkadianen Uhrmaschinerie von Stammzellen zu differenzierten Zellen hindeutet. Die Verwendung von patienteneigenen Organoiden mit zirkadianen biolumineszenten Reportern wird uns helfen, unser Verständnis der zirkadianen Rhythmen in peripheren Organen und verschiedenen Krankheitszuständen zu verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-GloTM Luciferase Assay System von Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Diese Präsentation zeigt die Verwendung von fMRT neuronale Schaltkreise, dass der Entscheidungsprozess zugrunde liegen, zu studieren. Einfache Wahrnehmungs-Aufgaben sind mit appetitive und aversive Verstärkungen kombiniert werden, um zu untersuchen, wie die Ergebnisse Entscheidungsprozesse beeinflussen.

Funktionelle Bildgebung mit Verstärkung, Eyetracking und Physiologische Überwachung

Lernen Sie die biolumineszenzbasierte Überwachung zirkadianer Rhythmen in humanen intestinalen Organoiden. Diese Methode zeigt robuste Oszillationen bei differenzierten Zellen und gestörte Rhythmen im Stammzellzustand.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

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