Name: Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestimmung der Eisen-Chelatbildung neuartiger Verbindungen. Diese Technik unterstützt die Krebsforschung durch schnelles Screening potenzieller Therapeutika.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierender Assay zum Nachweis neuartiger Eisenchelatoren

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ammoniumeisen(II)-sulfat-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>auch bekannt als FAS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr>, <tr><td>Deferipron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>magnesium- und calciumfreie</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>jede optisch transparente 96-Well-Platte funktioniert</td></tr></tbody></table>

quantifizierbare und kostengünstige zellfreie fluoreszenzmethode zur bestätigung der fähigkeit neuartiger verbindungen, eisen zu chelatisieren 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Für die in Schritt 2 gezeigte Methode wurde in diesem ersten Experiment (Abbildung 1) der lineare Bereich des Mikrotiter-Fluoreszenzplatten-Readers bei der Detektion von Calcein-Fluoreszenzemissionen ermittelt. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen einen weiten linearen Bereich der Calcein-Fluoreszenz von 0-100 μM. Die ANOVA mit LSD-Post-hoc-Analyse zeigt, dass es für alle Calcein-Konzentrationen statistisch signifikante Unterschiede in der mittleren RFU im Vergleich zu einer Kontrolle von 0 μM Calcein gibt. In weiteren Experimenten wurde 1 μM Calcein verwendet (Schritte 3 und 4), da es statistisch signifikante Unterschiede zur 0 μM-Kontrolle aufweist und in den Bereich fällt, in dem es in der Durchflusszytometrie üblicherweise in Form von Calcein AM auf Zellen angewendet wird13.
Für die in Schritt 3 gezeigte Methode zeigen wir, dass die Fe2+-Ionen zu einer linearen Abnahme der Calcein-Fluoreszenz (RFU) führen, wenn Eisen in Form von Fe2+ in einem Bereich von 0-1000 μM (als FAS) zu 1 μM Calcein hinzugefügt wird. Dies ermöglicht die Beobachtung einer Fe2+-basierten Quenchung der Calcein-Fluoreszenz. Calcein als schwacher Eisenchelator bindet Eisen und dies reduziert die Fluoreszenzleistung. In Abbildung 2 zeigten Konzentrationen von 8,9 μM FAS und höher eine signifikante Abnahme der Calcein-Fluoreszenz um p&lt;0,001 im Vergleich zu 1 μM Calcein allein. Die Verwendung von 8,9 μM FAS entsprach einer 33%igen Reduktion der Calcein-Fluoreszenz (mittlere RFU). Für weitere Experimente (Schritt 4) wurde 10 μM FAS verwendet, da es im Bereich der Fluoreszenzlöschung von Calcein lag.
Für die in Schritt 4 gezeigte Methode ist in Abbildung 3 die Verdrängung von Calcein um Fe2+-Ionen durch einen Eisenchelator zu beobachten. Eisen in Form von Fe2+ verringert die Calcein-Fluoreszenz von der 1 μM-Kontrolle und der Eisenchelator Deferipron erhöht diese Fluoreszenz bis zu einem Peak, wodurch die Eisenabschreckung von Calcein freigesetzt und die Fluoreszenz (mittlere RFU) erhöht wird. Deferipron (als Beispiel verwendet) in Konzentrationen von 0,97-512 μM führte zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Fluoreszenz, wie bei der ANOVA- und LSD-Post-hoc-Analyse beobachtet wurde (p&lt;0,001). Die größte Faltungsänderung war eine 3-fache Änderung der mittleren RFU bei 62,5 μM Chelator im Vergleich zur Kontrolle von 1 μM Calcein AM und 10 μM FAS. Oberhalb von 512 μM Deferipron gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen dem Chelator und der Kontrolle von 1 μM Calcein und 10 μM FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> Abbildung 1: Bestimmung der Calceinkonzentrationen und der Fluoreszenz (RFU) mit einem fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Reader. Die Calcein-Konzentrationen von 0-100 μM bei 30 min Inkubation und Bestimmung der Fluoreszenz (RFU) sind hier dargestellt. Die Daten zeigen den Mittelwert von 8 Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein Konfidenzintervall von 95 % im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p&lt;0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Post-hoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Die mittlere Calcein-RFU jeder Konzentration wird mit der Kontrolle von PBS und 0 μM Calcein verglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> Abbildung 2: Eine Erhöhung der FAS-Konzentration führt zu einer linearen Abnahme der Calcein-Fluoreszenz. Die Konzentration von FAS wurde von 0 auf 1000 μM erhöht, was zu einer linearen Abnahme der 1 μM Calcein-Fluoreszenz nach 30-minütiger Inkubation in PBS führte. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von 5 Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein 95%-Konfidenzintervall im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p&lt;0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Post-hoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Die mittlere Calcein-RFU jeder Konzentration von FAS und 1 μM Calcein wird mit der Kontrolle von 1 μM Calcein und 0 μM FAS in PBS verglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> Abbildung 3: Steigende Konzentrationen von Deferipron. Die Konzentration von Deferipron wurde von 0-1000 μM durch Inkubation von 1 μM Calcein, 10 μM FAS in PBS erhöht. Die Fluoreszenz wurde auf einem multimodalen Mikroplatten-Reader gemessen. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von 5 Wiederholungen pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein 95%-Konfidenzintervall im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p&lt;0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Posthoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Mittlere RFU im Vergleich zu 1 μM Calcein in PBS mit 10 μM FAS und 0 μM Deferipron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Konzentration (μm)</td>
			<td>Volumen ab (1 Mio. Lagerbestand)</td>
			<td>Volumen von PBS</td>
			<td>Gesamtvolumen</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>950 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>ca. 25 μl</td>
			<td>975 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>990 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Aufbereitung von Calcein-Sekundärstoffen.

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

quantifiable-inexpensive-cell-free-fluorescent-method-to-confirm

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video beschreiben wir eine kolorimetrische Methode zur Bestimmung des Nicht-Häm-Eisengehalts in Lebergewebe von Mäusen. Als chromogenes Substrat wird Bathophenanthrolinsulfonat in Gegenwart eines Reduktionsmittels verwendet, das Eisen(III)-Eisen in chelatables Eisen umwandelt.

Kolorimetrischer Assay auf Bathophenanthrolinsulfonat-Basis: eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung von Nicht-Häm-Eisen in Lebergewebe von Mäusen

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Beurteilung der Bioverfügbarkeit von Eisen in komplexen Nahrungsquellen. Die Technik kombiniert die Simulation der menschlichen Verdauung mit der Eisenaufnahme durch differenzierte Caco-2-Zellen. Die intrazelluläre Ferritinbildung fungiert als Marker für die zelluläre Eisenaufnahme.

Caco-2 Cell Bioassay: Eine In-vitro-Methode zur Messung der Bioverfügbarkeit von Eisen in komplexen Nahrungsquellen

Ascorbat spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Hier beschreiben wir einen mittleren Durchsatz, spezifisch und kostengünstig Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung von intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Wir präsentieren Ihnen ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Messung der Eisengehalt im Pflanzengewebe mit der kolorimetrischen Preußischblau-Methode.

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

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Quantifizierung der Metallauslaugung in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie

Dieser Artikel zeigt, wie transferringebundenes nichtradioaktives Isotopeneisen für Studien zum Eisentransport in der Mausschwangerschaft vorbereitet und verabreicht wird. Der Ansatz zur Quantifizierung von isotopischem Eisen in fetoplazentaren Kompartimenten wird ebenfalls beschrieben.

Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope

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Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay

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Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren (Video) | JoVE Journal

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