Name: Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Lernen Sie die Echtzeit-Erfassung von cAMP-Dynamiken in lebenden Zellen mit einem spezifischen Fluoreszenz-Biosensor. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Messungen in HEK-293- und HASM-Zellen für die Signaltransduktionsforschung.

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Diese Studie wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522) unterstützt.

Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und Geräten, die für die Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Plattenablesungs-Spektralphotometer, Hochdurchsatz-Assay
<ol><li>Aussaat von HEK-293-Zellen mit dem cADDis-BacMam-Vektor in einer 96-Well-Platte (Tag 1)<ol><li>Zellen in einer Virushaube spalten und infizieren.<ol><li>Erwärmen Sie HEK-Medien (Tabelle 1) und 0,25 % Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.</li>
			<li>Desinfizieren Sie die Haube und die Materialien, indem Sie sie mit EtOH-getränkten Tüchern abwischen.</li>
			<li>Das HEK-Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entnehmen und entsorgen.</li>
			<li>Geben Sie 5 ml Mg2+ und Ca2+ freies DPBS (37 °C) mit einer serologischen Pipette hinzu. Kippen Sie den Kolben hin und her, um den Boden mit DPBS zu waschen. Entfernen und verwerfen Sie DPBS mit einer serologischen Pipette.</li>
			<li>Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 3 ml erwärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette hinzufügen. Kippen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass das Reagenz den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Setzen Sie den Deckel auf den Kolben und lassen Sie das Reagenz 3-5 Minuten einwirken, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können. HINWEIS: Dieses Experiment ist für einen 75 cm2-Kolben optimiert; Volumenanpassungen für Reagenzien müssen möglicherweise vorgenommen werden, wenn ein Kulturgerät anderer Größe verwendet wird.</li>
			<li>Ziehen Sie 5 ml frisches Medium mit Antibiotika. Das Volumen des Kolbens wird ausgestoßen und gezogen, um die Wände des Kolbens zu waschen und die Zellen physisch zu lösen.</li>
			<li>Das Gesamtvolumen des Kolbens (8 mL) und die Zentrifuge (25 °C) in einem 15-ml-Röhrchen bei 200 x g für 5 min auffangen.</li>
			<li>Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand mit einer serologischen Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.</li>
			<li>Um die Zellen zu waschen, ohne das Pellet zu stören, geben Sie 500 μl DPBS ohne Mg2+ und Ca2+ DPBS an die Seite des 15-ml-Röhrchens. Entfernen und entsorgen Sie nach vorsichtiger Zugabe des DPBS so viel Puffer wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen Sie dies noch einmal.</li>
			<li>Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Zelldichte von 250.000 Zellen/ml-Zellen ein.</li>
			<li>Erstellen Sie einen Mastermix, der darauf basiert, welche Reagenzvolumina pro Vertiefung einer schwarzen, transparenten 96-Well-Platte mit Bodenfläche benötigt werden. Dies wird als "Gewebeplatte" bezeichnet. Siehe Bände unten: HINWEIS: Beispiel für 1 Vertiefung (Gesamtvolumen 200 μl): 40 μl des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen/ml), 2 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM; Endkonzentration 1 μM), 158 μl von 250.000 Zellen/ml Zelldichte. Beispiel für 10 Wells (Gesamtvolumen 2 mL): 400 μL des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen /ml), 20 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM), 1.580 μL Medium mit 250.000 Zellen/ml Zelldichte.</li>
			<li>Fügen Sie 200 μl Mastermix pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Inkubator, bevor Sie sie auf dem Plattenablesungs-Spektrophotometer laufen lassen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Läuft auf einem Tellerlesegerät<ol><li>Entfernen Sie auf einer Tischplatte vorsichtig alle Medien in jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch 180 μl DPBS mit Mg2+ und Ca2+ bei 37 °C.</li>
		<li>Untersuchen Sie Zellen mit einem Mikroskop, um die Zellgesundheit zu bestätigen.</li>
		<li>Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min-1 h.</li>
		<li>Bereiten Sie die Arzneimittel während der Inkubation für die Ablesung bei einer Verdünnung von 1:10 (auch 10-fach genannt) für die gewünschte Enddosis vor. Bereiten Sie also 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol vor.</li>
		<li>Geben Sie 60 μl jedes Arzneimittels säulenförmig auf eine durchsichtige 96-Well-Platte (als "Wirkstoffplatte" bezeichnet). HINWEIS: Bei richtiger Wirkstoffverdünnung und zur Optimierung der Ablesung werden die Arzneimittel auf eine durchsichtige 96-Well-Platte gegeben, die als "Wirkstoffplatte" bezeichnet wird, um zum Zeitpunkt der Ablesung mit einer 96-Multi-Pipettore auf die "Gewebeplatte" übertragen zu werden, so dass das Arzneimittel gleichzeitig in alle Vertiefungen gegeben und vom Fluoreszenzspektrophotometer schnell abgelesen werden kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichtung des Fluoreszenzplatten-Readers<ol><li>Passen Sie die Einstellungen des Fluoreszenzplatten-Readers an.<ol><li>Lesemodus: Fluoreszenz. Lesetyp: kinetisch. Messwerte Wellenlängen: 494 nm und 522 nm.</li>
			<li>Lesezeit: Geben Sie 3 Minuten für den Fluoreszenz-Ausgangswert und 7 Minuten für die Zugabe nach dem Medikament ein. "Intervall" wird als 00:00:30 für 30 s zwischen den einzelnen Lesevorgängen eingegeben. HINWEIS: Die Lesezeit kann je nach benötigter Zeit optimiert und erhöht werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Datenerfassung<ol><li>Nehmen Sie die Taschentuchplatte aus dem Inkubator, entfernen Sie die Aluminiumfolie und den Plattendeckel und legen Sie die Taschentuchplatte in den Plattenleser. Schließen Sie die Lesekassette, damit die Gewebeplatte ruhen und sich an die Temperatur des Lesegeräts (37 °C) anpassen kann.</li>
		<li>Legen Sie die durchsichtige 96-Well-Platte (Wirkstoffplatte) mit den Wirkstoffverdünnungen unter die 96-Multi-Pipette und üben Sie, 20 μl aus den Wells zu entnehmen. Stellen Sie sicher, dass ein gleichmäßiges Volumen des Medikaments in die Pipettenspitzen gezogen wird.</li>
		<li>Initiieren Sie einen "Baseline"-Messlauf. HINWEIS: 40 RFU oder höher gelten als brauchbare Daten. Wenn die Daten unter diesem Wert liegen, sollte der Test gestoppt und verworfen werden.</li>
		<li>Die Gewebeplatte wird am Ende des Baseline-Laufs aus dem Lesegerät ausgeworfen. Geben Sie schnell und vorsichtig 20 μl von der durchsichtigen Wirkstoffplatte in die schwarze Gewebeplatte. Beginnen Sie dann schnell mit dem "Behandlungslauf". Die Gewebeplatte sollte nach der Zugabe von Arzneimitteln nicht länger als 30 s aus dem Lesegerät entfernt sein. HINWEIS: Wenn das Medikament zu schnell hinzugefügt wird, lösen sich die Zellen von der Gewebeplatte, wodurch ein unbrauchbares Experiment entsteht. Zusätzlich werden die Zellen mit einem lichtempfindlichen, grün fluoreszierenden Protein infiziert; Daher ist es unerlässlich, die Medikamente schnell und unverzüglich hinzuzufügen und mit dem zweiten Test zu beginnen, um zu vermeiden, dass der frühe Teil der Reaktion übersehen wird.</li>
		<li>Sobald die zweite Messung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Gewebeplatte aus dem Lesegerät ausgeworfen wird und die Datenerfassung abgeschlossen ist. HINWEIS: Bevor Sie die Gewebeplatte entsorgen, sollten Sie überprüfen, ob die Zellen noch an der Platte befestigt sind. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sich die Zellen lösen, sind die Ergebnisse ungültig und sollten verworfen werden. Das Experiment muss wiederholt werden.</li>
		<li>Exportieren Sie die resultierenden Daten als Excel-Datei.</li>
		<li>Öffnen Sie die exportierten lesbaren Excel-Daten aus dem Plattenleser, kopieren Sie die relevanten Informationen und fügen Sie sie in die Excel-Konvertierungsvorlage ein. Die Daten werden vom eingerichteten Plattenleser in eine einzelne Vertiefung umgewandelt, wobei die Spaltenanzeigen rechts von den kopierten Daten angezeigt werden. HINWEIS: Fluoreszenzsäulen für eine Vertiefung über die Zeit werden unter RFUs (mit dem Titel Spaltentransformation) und als Dezimaländerung relativ zum RFU-Messwert beim ersten Messwert (t0 mit dem Titel Delta F) aufgeführt. In der Excel-Vorlage wird die Delta-F-Tabelle auf den letzten Ausgangswert vor der Zugabe des Arzneimittels festgelegt. Dies ist der 6. Datenerfassungspunkt.</li>
		<li>Kopieren Sie nach der Datentransformation die Daten von Delta F und fügen Sie sie in die Datenanalysesoftware als Zerfall oder relativer Zerfall in der Fluoreszenz über die Zeit ein.</li>
		<li>Ändern Sie den X-Titel in "Zeit(en)" und den Y-Titel in "ΔF/F0" für relative Dezimalwerte.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Einzelzell-Assay mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop
<ol><li>Aussaat (HASM) von Zellen mit dem cADDis BacMam-Vektor in einer 35-mm-Schale (Tag 1)<ol><li>Zellen in einer Virushaube spalten und infizieren.<ol><li>Warmes HASM-Medium (Tabelle 1), 0,25 % Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.</li>
			<li>Desinfizieren Sie die Haube und die Materialien und wischen Sie die Haube mit EtOH-getränkten Tüchern ab.</li>
			<li>HASM-Medien mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entnehmen und entsorgen.</li>
			<li>5 ml Mg2+ und Ca2+ freies DPBS (37 °C) mit einer neuen serologischen Pipette zugeben und den Kolben kippen, um den Boden mit dem DPBS zu waschen.</li>
			<li>Trypsinisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml erwärmtem 0,25%igem Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette. Kippen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass das Reagenz den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Lassen Sie das Reagenz 3-5 Minuten einwirken, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können.</li>
			<li>Es werden 5 ml frisches Medium mit Antibiotika entnommen und die Pipette ausgestoßen, um die Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen.</li>
			<li>Das Gesamtvolumen der Zentrifuge des Kolbens (8 mL) in einem Zentrifugenröhrchen bei 200 x g für 5 min auffangen.</li>
			<li>Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand mit einer serologischen Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.</li>
			<li>Ohne das Pellet zu stören, geben Sie 500 μl DPBS ohne Mg2+ und Ca2+ DPBS an die Seite des Zentrifugenröhrchens. Entfernen und entsorgen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. HINWEIS: Dieses Experiment ist für einen 75 cm2-Kolben optimiert; Volumenanpassungen für Reagenzien müssen möglicherweise vorgenommen werden, wenn ein Kulturgerät anderer Größe verwendet wird.</li>
			<li>Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Zelldichte von 40.000 Zellen/ml ein.</li>
			<li>Erstellen Sie einen Mastermix basierend auf dem Reagenzvolumen, das pro Vertiefung einer 35-mm-Schale benötigt wird. Siehe Bände unten: HINWEIS: Beispiel für 1 Vertiefung (Gesamtvolumen 500 μL): 20 μl des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen /ml), 5 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM, Endkonzentration 1 μM), 500 μl von 40.000 Zellen/ml Zelldichte. Beispiel für 4 Wells (Gesamtvolumen 2 mL): 80 μL des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand an viralen Genen /mL), 20 μL Trichostatin A (Bestand von 100 μM, Endkonzentration 1 μM), 2000 μL Medium 40.000 Zellen/ml Zelldichte.</li>
			<li>Fügen Sie 500 μl Mastermix pro Vertiefung hinzu. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor das Experiment fortgesetzt wird. HINWEIS: Die Handynummer kann je nach Zelllinie variieren. Um überlappende Zellen für die Analyse zu vermeiden, verwenden Sie niedrige Zellenzahlen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung pharmakologischer Wirkstoffe (Tag 2)<ol><li>Entfernen Sie vorsichtig das Medium in jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 450 μl DPBS mit Mg2+ und Ca2+ bei 37 °C.</li>
		<li>Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und inkubieren Sie die 35 mm Scheibe bei 37 °C für 30 min-1 h.</li>
		<li>Untersuchen Sie Zellen mit einem Mikroskop, um die Zellgesundheit zu bestätigen.</li>
		<li>Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Arzneimittel für das Ablesen von 1 log-Einheit über der gewünschten Endkonzentration (10-fach höher) vor. Bereiten Sie also 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol vor.</li>
		<li>Bereiten Sie das Arzneimittel für logarithmische Dosiertiter bei 10 mM vor und verwenden Sie serielle Verdünnungen, um 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol zu erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenerfassung HINWEIS: Die folgenden Einstellungen gelten für ein inverses Fluoreszenzmikroskop. Die Software, die jedem Mikroskop beiliegt, kann unterschiedlich sein. Die allgemeinen Einstellungen, die im aktuellen Protokoll verwendet werden, werden hier beschrieben.<ol><li>Schalten Sie die zentrale Nabe und dann das inverse Fluoreszenzmikroskop ein.</li>
		<li>Öffnen Sie die Software, die für die Aufnahme verwendet werden soll, und wählen Sie die Option für die Zeitrafferaufnahme .</li>
		<li>Platzieren Sie einen 35-mm-Probenhalter in der Schüssel.</li>
		<li>Stellen Sie das Objektiv auf x20 ein.</li>
		<li>Verwenden Sie den Autofokus und erhalten Sie ein möglichst klares Bild. Wenn es schwierig ist, einzelne Zellen zu finden, beginnen Sie mit einem 4x-Ziel und gehen Sie dann zu 20x über. Fokussieren Sie die Probe manuell, wenn das Mikroskop nicht über eine Autofokusfunktion verfügt. HINWEIS: Die Vergrößerung von 40x kann verwendet werden, wenn signifikantere zellmorphologische Details benötigt werden.</li>
		<li>Passen Sie die folgenden Einstellungen an, um eine optimale Datenerfassung zu erzielen: Automatische Helligkeit (Belichtung), Anregungswellenlänge, Schwarzabgleich (zur Reduzierung von Hintergrundrauschen), Autofokus.</li>
		<li>Nachdem Sie einen Sichtbereich mit mehreren zytoplasmatischen fluoreszierenden Zellen gefunden haben, erfassen Sie die Daten alle 30 s 20 Minuten lang mit Zeitrafferaufnahme.</li>
		<li>Klicken Sie auf Go , um mit dem Lesen zu beginnen.</li>
		<li>Laufen Sie 3 Minuten lang, um die Baseline zu sammeln. Sobald die 3-minütige Erfassung erfolgt ist, geben Sie vorsichtig 50 μl des Arzneimittels in die entsprechende Vertiefung. Wenn die Arzneimittel hinzugefügt werden, beträgt die Endkonzentration auf der Schale 10 μM Forskolin und 10 nM Isoproterenol. HINWEIS: Das Medikament muss vorsichtig hinzugefügt werden; Berühren Sie die Platte nicht mit der Pipettenspitze, da dies das Sichtfeld verschieben und die Probe nicht analysiert werden kann.</li>
		<li>Lassen Sie das Experiment weitere 17 Minuten lang laufen, wobei die Daten alle 30 s erfasst werden.</li>
		<li>Stellen Sie nach Abschluss des Tests sicher, dass die Daten für die Analyse bereit sind. HINWEIS: Obwohl das derzeitige Protokoll keine Kontrolle für die Fokusdrift enthält, könnte es von Vorteil sein, eine solche in das Experiment einzubeziehen. Zum Beispiel kann die Verwendung von Kernfarbstoffen bei der Bewältigung der Fokusdrift während der Mikroskopanalyse helfen, insbesondere bei der Aufnahme von Bildern lebender Zellen über einen längeren Zeitraum. cADDis-Biosensoren sind in der Regel weit in der Zelle verteilt, was eine breite Fokusebene zur effektivsten Erfassung macht und die Notwendigkeit einer Kontrolle der Fokusdrift reduziert9.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der Daten HINWEIS: Die Software, die mit jedem Mikroskop geliefert wird, kann unterschiedlich sein, daher werden hier die allgemeinen Einstellungen beschrieben, die zur Analyse der aufgenommenen Bilder verwendet werden sollten.<ol><li>Öffnen Sie die Bilddateien, die während des Experiments erfasst wurden.</li>
		<li>Verwenden Sie das Polygon- oder Kreiswerkzeug, um den Interessenbereich jeder Zelle auszuwählen, um die Analyse durchzuführen. Die Analyse sollte die Helligkeit jeder Zelle zu jedem Zeitpunkt angeben. HINWEIS: Es empfiehlt sich, einzelne Zellen auszuwählen und keine Zellen, die die Wand der Schale oder andere Zellen berühren. Dies gewährleistet die bestmögliche Datenerfassung. Wählen Sie innerhalb jeder Bedingung mindestens 5 Zellen für die Analyse aus, und wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal.</li>
		<li>Öffnen Sie nach der Analyse der Daten die Daten in einer Excel-Tabelle und berechnen Sie die durchschnittliche Helligkeit für jeden Zustand auf jedem Foto, beginnend mit dem Bild, kurz bevor Sie die pharmakologischen Wirkstoffe oder das Vehikel hinzufügen. In diesem Beispiel bei der 3-Minuten-Marke oder dem 6. Foto, das mit dem Mikroskop aufgenommen wurde, da jedes Bild alle 30 s aufgenommen wird.</li>
		<li>Berechnen Sie ΔF/F0 für jeden Mittelwert in jeder Bedingung.</li>
		<li>Laden Sie es in eine statistische Analysesoftware und zeichnen Sie ΔF/F0 gegen die Zeit in s. HINWEIS: Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte der Protokolle.</li>
	</ol></li>
</ol>

cAMP-Analyse mit cADDis: Einzelzell- bis Hochdurchsatz-Screening

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<li>Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+methods+for+detection+and+measurement+of+cyclic+amp+and+adenylyl+cyclase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity.</a> Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).</li>
<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+in+the+development+and+implementation+of+fret-based+sensors+of+intracellular+signals%3A+A+biological+perspective+of+the+history+of+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret.</a> Cell Signal. 75, 109769(2020).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+limitations+of+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming limitations of fret measurements.</a> Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPS+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Eine genaue und empfindliche Messung von cAMP ist entscheidend für das Verständnis seiner Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen und für die Untersuchung der Aktivität von cAMP-abhängigen Signalwegen. Es gibt mehrere Methoden, die häufig zur Messung des cAMP-Spiegels verwendet werden, darunter ELISA, Radioimmunoassay, FRET-Biosensoren und der GloSensor cAMP-Assay 14,15,16,17,18. Jeder cAMP-Assay hat Stärken und Schwächen. Das Protokoll ermöglicht die Echtzeit-Detektion und -Überwachung von Minuten bis Stunden sowie die Messung der cAMP-Dynamik in lebenden Zellen, ohne dass Phosphodiesterase-Hemmer einbezogen werden müssen. Dieser letzte Punkt ist entscheidend für Forscher, die daran interessiert sind, die Rolle von Phosphodiesterase-Isoformen bei der Regulierung des cAMP-Signalwegs zu untersuchen19. Der Biosensor ist im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle) in mehreren Versionen: ein grüner Fluorophor, der die Fluoreszenz bei cAMP-Bindung verringert, ein roter Fluorophor, der bei cAMP-Bindung eine erhöhte Fluoreszenz aufweist, und ein grüner Fluorophor, der bei cAMP-Bindung eine erhöhte Fluoreszenz aufweist. Die nach unten gerichtete Version des Biosensors ist am nützlichsten, da der wichtigste limitierende Faktor das Expressionsniveau des Biosensors ist, und diese Version zeigt die maximale Fluoreszenz zu Studienbeginn vor Beginn eines Experiments an, wodurch die Notwendigkeit verringert wird, die Biosensorexpression durch Hinzufügen eines maximalen cAMP-Stimulus zu bewerten. Der Biosensor ist auch in Versionen erhältlich, die auf Membranmikrodomänen, primäre Zilien oder den Zellkern ausgerichtet sind. Diese verschiedenen Versionen ermöglichen die gleichzeitige Messung von cAMP in zytosolischen und Membran-/Zilienkompartimenten innerhalb derselben Zelle. Diese neuartigen Werkzeuge sind einzigartig gut in der Visualisierung und Quantifizierung der cAMP-Dynamik über verschiedene zelluläre Komponenten hinweg, ein sich schnell entwickelndes und wichtiges Forschungsgebiet20.
Die Biosensoren bieten eine einfache Methode zur effektiven Überwachung der cAMP-Dynamik in Echtzeit, die es Forschern ermöglicht, schnelle Änderungen der cAMP-Spiegel mit außergewöhnlicher zeitlicher Auflösung zu beobachten. Eine der Hauptstärken des Biosensors liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, die es ermöglicht, sowohl subtile als auch signifikante Schwankungen der cAMP-Konzentrationen zu erkennen8. Ein Beispiel dafür in den cAMP-Oszillationen wird bei niedrigen Isoproterenol-Stimulus in HEK-293-Zellen ohne Phosphodiesterase-Inhibitor beobachtet (Abbildung 2B). Dieses oszillatorische Verhalten ist nicht verstanden und scheint nur für diese Zellen zu gelten, aber die Empfindlichkeit und die schnelle Kinetik des Biosensors ermöglichen ihre Erkennung. Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Biosensor leicht gesättigt werden kann, so dass dieser Biosensor bei der Quantifizierung der Unterschiede zwischen mittleren und großen cAMP-Signalen begrenzt sein kann. Dieses limitierende Merkmal ist besonders relevant bei der Verwendung von Phosphodiesterase-Hemmern, die einen globalen Anstieg der cAMP-Spiegel verursachen, wenn auch ein Rezeptorreiz vorhanden ist. Während wir die Infektion mit HASM in dieser Studie vorstellen, ist es wichtig, die Herausforderung zu erkennen, die mit der Infektion von Primärzellen mit dem BacMam-Vektor verbunden ist. Die Bedingungen sollten für einzelne Zelltypen optimiert werden, um eine ausreichende Expression des Biosensors zu erreichen. Nichtsdestotrotz eignet sich der Biosensor aufgrund seiner Empfindlichkeit und Skalierbarkeit gut für Hochdurchsatz-Assays.
Eine weitere Verbesserung der Verwendung dieses Biosensors gegenüber FRET-basierten Sensoren ist die Minimierung des Photobleachings. Viele fluoreszierende Biosensoren unterliegen nach längerer und wiederholter Anregung einer Photobleichung. Die hier beschriebenen Protokolle beinhalten kurzzeitige Anregungen, die 30 s voneinander entfernt sind. Der Biosensor ist außerdem extrem hell, wodurch das potenzielle Photobleichen für diese Art der Analyse begrenzt wird. Photobleiche würde während der anfänglichen Baseline als Drift beobachtet werden. Wenn eine Drift der Basislinie auftreten sollte, könnte man die driftende Basislinie von den Daten subtrahieren, bevor man die Kurve anpasst, oder das Abtastintervall erhöhen, um die Häufigkeit der Anregung zu verringern.
Wie andere cAMP-Biosensoren weist auch dieser Biosensor eine hohe Spezifität für die Bindung an cAMP auf. Folglich korrelieren die von diesem Assay erzeugten Signale direkt mit den cAMP-Spiegeln, wodurch die potenziellen Interferenzen durch andere zelluläre Komponenten erheblich reduziert und zuverlässige Ergebnisse geliefert werden. Darüber hinaus ist die Vielseitigkeit des Biosensors hervorzuheben. Obwohl der GloSensor-Assay in der Praxis weit verbreitet ist, weist er gewisse Einschränkungen auf. So kann beispielsweise die transiente Transfektion zu Ineffizienzen bei bestimmten Zelltypen führen, und die Analyse mehrerer Parameter oder Prozesse innerhalb derselben Zelle ist eine Herausforderung. Darüber hinaus stützt sich der Assay auf Luziferase-Enzyme, die durch bestimmte Verbindungen beeinflusst werden können, was möglicherweise zu einer beeinträchtigten Ergebnisgenauigkeit führt21. Auf der anderen Seite kann der Biosensor in verschiedenen Zelltypen und experimentellen Systemen eingesetzt werden, einschließlich Adhärent- und Suspensionszellen. Seine Kompatibilität mit verschiedenen zellulären Kontexten ermöglicht es den Forschern, die cAMP-Dynamik in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen 22,23,24. Die Integration dieses Biosensor-Assays in die Fluoreszenzmikroskopie erhöht seinen Nutzen noch weiter, da auch zellmorphologische Informationen gesammelt werden können 25,26,27.
Dieser Assay bietet Forschern eine große Flexibilität bei der Versuchsplanung und ermöglicht eine breite Palette von Untersuchungen im Zusammenhang mit der cAMP-Signalübertragung. Es dient mehreren Zwecken, indem es die Messung des basalen cAMP-Spiegels, die Untersuchung von cAMP-Schwankungen als Reaktion auf verschiedene Reize oder Behandlungen und die Erforschung der cAMP-Dynamik unter verschiedenen physiologischen oder pathologischen Zuständen ermöglicht. Eine der wichtigsten Stärken des Assays ist seine Kompatibilität mit anderen Techniken, die ein umfassenderes Verständnis der cAMP-Signalübertragung ermöglicht. Durch die Kombination des Biosensors mit Methoden wie Immunfluoreszenzfärbung oder genetischer Manipulation10 können Forschende tiefere Einblicke in die präzise räumliche und zeitliche Regulation von cAMP innerhalb bestimmter zellulärer Kompartimente oder Signalwege gewinnen. Durch diese Integration können Forschende die vielfältigen Funktionen von cAMP in verschiedenen Kontexten untersuchen, was zu wertvollen Einblicken in die Komplexität von cAMP-vermittelten zellulären Prozessen führt. Der Einsatz dieser Techniken ermöglicht es den Forschern, die cAMP-Spiegel sowohl auf der Ebene der einzelnen Zellen als auch der Population zu visualisieren und zu quantifizieren, was ein umfassendes Verständnis ihrer Verteilung innerhalb der Zelle ermöglicht, einschließlich der Identifizierung von cAMP-Pools. Die Kombination dieser Methoden ermöglicht die Erfassung präziser Daten und trägt wesentlich zu unserem Wissen über die cAMP-Signalübertragung bei.
Während sich traditionelle Methoden für die cAMP-Analyse als wertvoll erwiesen haben, stellt die Einführung von cADDis einen vielversprechenden Fortschritt auf diesem Gebiet dar. Seine Spezifität, Sensitivität und Echtzeitfähigkeiten machen es zu einer wertvollen Ergänzung des Werkzeugkastens des Forschers, insbesondere aufgrund seiner Kompatibilität mit lebenden Zellen. Mit der Fähigkeit, die cAMP-Spiegel in Echtzeit zu überwachen, und seiner hohen Empfindlichkeit bietet der Biosensor einen erheblichen Vorteil in verschiedenen experimentellen Umgebungen. Dieser Fortschritt trägt zu einem tieferen Verständnis der dynamischen Natur des cAMP-Signalwegs und seiner funktionellen Implikationen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Prozessen bei.

Adenosin-3′,5′-cyclisches Monophosphat, cAMP, spielt eine zentrale Rolle bei der zellulären Kommunikation und der Koordination verschiedener physiologischer Prozesse. cAMP fungiert als zweiter Botenstoff, der externe Signale von Hormonen, Neurotransmittern oder anderen extrazellulären Molekülen weiterleitet, um eine Kaskade intrazellulärer Ereignisse zu initiieren1. Darüber hinaus ist cAMP an verschiedenen Signalwegen beteiligt, einschließlich solcher, die mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Adenylylcyclasen assoziiert sind. Das Verständnis der Rolle von cAMP bei der zellulären Signalübertragung ist von grundlegender Bedeutung, um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, die normalen zellulären Funktionen zugrunde liegen, und um potenzielle Therapien für eine Vielzahl von Erkrankungenzu entwickeln 2.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Methoden eingesetzt, um cAMP direkt oder indirekt zu messen. Dazu gehörten die Radiomarkierung von zellulären ATP-Pools, gefolgt von der Säulenreinigung, HPLC, Radioimmunoassays und enzymgebundenen Immunoassays 1,2. Diese Legacy-Assays sind durch die Tatsache eingeschränkt, dass es sich um Endpunktmessungen handelt, die eine große Anzahl von Proben erfordern, um zeitabhängige Reaktionen zu erstellen. In jüngerer Zeit wurden FRET-Sensoren (Fluorescence Resonance Energy Transfer) entwickelt, um Assays in lebenden Zellen zu erstellen, dynamische Echtzeitdaten zu erzeugen und Sensoren an verschiedenen subzellulären Orten anzuvisieren3. FRET nutzt zwei Fluorophore, einen Fluoreszenzdonor und einen Fluoreszenzakzeptor, so dass das Akzeptorfluorophor in unmittelbarer Nähe durch den Donorfluoreszenzausgang angeregt wird, wenn er sich in unmittelbarer Nähe befindet. Die beiden am häufigsten verwendeten Fluorophore sind das cyanfluoreszierende Protein (CFP) und das gelb fluoreszierende Protein (YFP), da diese kompatible Anregungs- und Emissionseigenschaften aufweisen. Neben CFP und YFP wird die Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) häufig für FRET-Biosensoren verwendet. cAMP FRET-Biosensoren funktionieren, indem sie einen Donor und einen Akzeptor an gegenüberliegenden Enden des Epac2 cAMP-Bindungsproteins haben. Die cAMP-Bindung verändert die Bestätigung von EPAC und vergrößert den Abstand zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren 3,4. Diese Konformationsänderung wird durch einen Verlust von FRET nachgewiesen, d. h. durch die Anregung des Akzeptorfluorophors durch Energie, die von den Donorfluorophortropfen3 übertragen wird. Obwohl es sich um einen scheinbar einfachen Prozess handelt, gibt es eine Fülle von Einschränkungen und Problemen mit dem FRET-Biosensor für die cAMP-Forschung5. Eine davon ist die Auswahl von fluoreszierenden Proteinen, z. B. GFP, die auf natürliche Weise dimerisieren können, wodurch die Empfindlichkeit verringertwird 6. FRET-basierte cAMP-Biosensoren wurden auf bestimmte Mikrodomänenausgerichtet 7, aber es kann aufgrund der Größe eines Konstrukts mit zwei Fluorophoren6 Einschränkungen geben. Ein weiteres wichtiges Problem ist das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis von FRET-Signalen, das sich aus der Überlappung zwischen Anregung und Emission des Fluorophors ergibt, was zu einer hohen Abtastfrequenz führt und die Analyse der Ergebnisse erschwert 4,5.
Zuletzt hat der neuartige Biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, diese und andere Einschränkungen bei der Untersuchung der Regulation der cAMP-Signalübertragung gelöst8. Eine wichtige Verbesserung ist die Abhängigkeit von einem einzigen Fluorophor. Dies ermöglicht ein schnelles und effizientes Signal mit einem größeren Dynamikbereich und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Infolgedessen kann die Genauigkeit höher sein, da es einen weniger breiten Bereich von Wellenlängen gibt, die durchkämmtwerden müssen 8. Wie FRET-Sonden wurde der Biosensor auf subzelluläre Stellen ausgerichtet, was die Erforschung der Kompartimentierungstheorie und die Erforschung von Lipid-Rafts und Nicht-Rafts sowie anderen subzellulären Domänen ermöglicht9. Am wichtigsten ist vielleicht die Eignung eines einzelnen Fluorophor-Biosensors für das Hochdurchsatz-Screening, der die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu FRET-basierten Biosensoren verbessert hat. Der Biosensor ist in einen BacMam-Vektor verpackt, der eine einfache Transduktion einer Vielzahl von Zelltypen und eine präzise Kontrolle der Proteinexpression ermöglicht.
Die Expressionskontrolle über den BacMam-Vektor kann besonders bei Assays mit GPCR-Orthologen verschiedener Spezies nützlich sein, um die Interpretation von Daten aus Tierversuchen zu erleichtern. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Rezeptorexpression entscheidend für die Messung der verschiedenen Grade der Arzneimittelwirksamkeit (z. B. inverse Agonisten und partielle Agonisten), und niedrige Rezeptorexpressionsniveaus sind nützlich, um die niedrigen Niveaus in tierischem Gewebe nachzuahmen. BacMam ist ein Baculovirus-Vektor, der modifiziert wurde, um Säugetierzellen wie primäre Zellkulturen und HEK-293-Linien zu transduzieren10. Dominante selektierbare Marker ermöglichen es BacMam, eine höhere Stabilität als herkömmliche Plasmidinfektionen zu bieten11. Solche selektiven Promotoren ermöglichen eine effizientere Genübertragung und -expression. Darüber hinaus erhöht die Zugabe von Trichostatin A (einem Histon-Deacetylase-Hemmer) den Reporterproteinspiegel11. Die Expressionsniveaus können über den Titer des verwendeten BacMam-Virus gesteuert werden und sollten für jeden Zelltyp optimiert werden. Im Falle dieses Biosensors ist ein rot oder grün fluoreszierendes Protein an den N- und C-Termini mit dem Epac verknüpft. Wenn cAMP bindet, bewegt eine Konformationsänderung im Biosensor Aminosäuren in die Nähe des fluoreszierenden Proteins. Eine solche Verschiebung verschiebt die Absorption vom anionischen Zustand in den neutralen Zustand bei 400 nm, wodurch die Fluoreszenz verringert wird.
Es gibt 90-120 GPCRs, die in einer einzigen Zelle exprimiert werden und auf eine Vielzahl von neurohumoralen Signalen reagieren12. Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass mindestens mehrere Dutzend GPCRs pro Zelle cAMP durch Gs- bzw. Gi-Kopplung stimulieren oder hemmen können. Während es Fortschritte bei der Überwachung dieses zweiten Botenstoffs in Echtzeit gibt, wie z. B. FRET, sind effizientere Methoden erforderlich. Die Methodik zur Überwachung der Synthese und Degradation von cAMP-Signalen mit cADDis in Echtzeit wird hier vorgestellt. Die Änderung der Fluoreszenz kann in Echtzeit mit einem Fluoreszenzplatten-Reader für Hochdurchsatz-Assays oder mit einem Fluoreszenzmikroskop für Einzelzell-Assays überwacht werden. Diese Methoden sind nützlich für eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zur GPCR-Signalübertragung über cAMP.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platte (klar)</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Schale</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627870</td><td>Zellkulturschalen mit Glasboden</td></tr><tr><td>96-Well-Platte&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>Schwarz mit klarem flachem Boden</td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisch (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Für HEK- und HASM-Medien</td></tr><tr><td>BZ-X Fluoreszenzmikroskop</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (IM)</td><td>Quality Biological Inc</td><td>E506</td><td>Für HASM-Medien</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ( 1x)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>HEK Medien</td></tr><tr><td>DPBS mit Mg2+ und Ca2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Mg2+ und Ca2+</td><td>Corning</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>R& D systems</td><td>S11195</td><td>Für HEK- und HASM-Medien</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Millipore</td><td>344270</td><td>Drug</td></tr><tr><td>Green Down cADDis cAMP Assay Kit</td><td>Montana Molecular</td><td>#D0200G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ham's F-12K&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21127022</td><td>Für HASM Medien</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Für HASM Medien</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>Wirkstoff</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Für HASM Medien</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Antibiotikum für HASM-Medien</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>weg Thermo Scientific</td><td></td><td>700511 Reagenz</td></tr><tr><td>Natriumhydroxidlösung</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>Für HASM-Medien</td></tr><tr><td>Spectrmax M5 Plattenleser</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>TCI America</td><td>T2477</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagenz</td></tr></tbody></table>

echtzeit-camp-dynamik in lebenden zellen mit dem fluoreszierenden camp-differenzdetektor in situ

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) ist ein neuartiger Biosensor, der die kontinuierliche Messung des cAMP-Spiegels in lebenden Zellen ermöglicht. Der Biosensor besteht aus einem zirkular permutierten fluoreszierenden Protein, das an die Scharnierregion von Epac2 gebunden ist. Dadurch entsteht ein einzelner Fluorophor-Biosensor, der bei Bindung von cAMP entweder eine erhöhte oder eine verringerte Fluoreszenz anzeigt. Der Biosensor gibt es in der roten und grünen Version nach oben sowie in der grünen Version nach unten und in mehreren roten und grünen Versionen, die auf subzelluläre Stellen ausgerichtet sind. Um die Wirksamkeit des Biosensors zu veranschaulichen, wurde die grüne, nach unten gerichtete Version verwendet, die bei cAMP-Bindung in der Fluoreszenz abnimmt. Es werden zwei Protokolle demonstriert, die diesen Sensor verwenden: eines mit einem 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer, das mit Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist, und ein anderes, das Einzelzell-Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop verwendet. Auf dem Platten-Reader wurden HEK-293-Zellen, die in 96-Well-Platten kultiviert wurden, mit 10 μM Forskolin oder 10 nM Isoproterenol stimuliert, was zu einer schnellen und starken Abnahme der Fluoreszenz in der grünen Abwärtsversion führte. Der Biosensor wurde verwendet, um den cAMP-Spiegel in einzelnen menschlichen Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur (HASM) zu messen, die unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht wurden. Der grüne, nach unten gerichtete Biosensor zeigte ähnliche Reaktionen auf Zellpopulationen, wenn er mit Forskolin oder Isoproterenol stimuliert wurde. Dieser Einzelzell-Assay ermöglicht die Visualisierung der Position des Biosensors bei 20- und 40-facher Vergrößerung. Somit ist dieser cAMP-Biosensor empfindlich und flexibel und ermöglicht die Echtzeitmessung von cAMP sowohl in immortalisierten als auch in Primärzellen sowie mit einzelnen Zellen oder Zellpopulationen. Diese Eigenschaften machen cADDis zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der cAMP-Signaldynamik in lebenden Zellen.

In der vorliegenden Studie wurde der zytosolische Biosensor sowohl in Platten-Readern als auch in Mikroskop-Assays validiert. Sobald die Zellen den Biosensor exprimiert hatten, wurden sie entweder mit 10 μM Forskolin (einem direkten Aktivator der Adenylylcyclase), 10 nM Isoproterenol (einem Agonisten an ß1AR und ß2AR) oder Vehikel stimuliert (Abbildung 1). Die nachfolgenden Änderungen der Fluoreszenz, die auf die cAMP-Produktion hinweisen, wurden alle 30 s erfasst.
Die Daten wurden als Änderung der Fluoreszenz gegenüber der anfänglichen Fluoreszenz (ΔF/F0) transformiert. Auf die Fluoreszenzdaten wurde ein Ein-Standort-Zerfallsmodell angewendet, um die zeitlichen Änderungen der cAMP-Spiegel unter den verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Parameter dieser Zerfallskurven können verwendet werden, um die Reaktion auf eine gegebene Konzentration des Arzneimittels zu quantifizieren. Es wurde das Produkt aus der Zerfallsrate (k) und dem Plateau als einzelner Wert verwendet, der die Arzneimittelreaktion quantifiziert, und diese wurden verwendet, um Konzentrations-Wirkungskurven zu erstellen, wenn mehrere Konzentrationen desselben Arzneimittels angewendet werden13.
Auf dem Platten-Reader zeigte der zytosolische Sensor nach Stimulation mit 10 μM Forskolin innerhalb von Sekunden eine beträchtliche Abnahme der Fluoreszenzintensität und entwickelte sich über viele Minuten hinweg (von 0 ΔF/Fo bei 200 s auf -0,7 ΔF/Fo bei 600 s) in HEK-293-Zellen (Abbildung 2A). Aufgrund des Designs des grünen Sensors deutet eine Abnahme der Fluoreszenz auf eine Zunahme der cAMP-Produktion hin, was darauf hindeutet, dass Forskolin einen gleichmäßigen Anstieg der cAMP-Spiegel im Zytosol verursachte. Die Stimulation von HEK-293-Zellen mit einer submaximalen Konzentration von Isoproterenol (10 nM) führte zu einer schnellen, aber geringeren Abnahme der Fluoreszenz des Biosensors (-0,3 ΔF/Fo bei 600 s, Abbildung 2A). Wenn diese niedrigeren Konzentrationen von Isoproterenol (10 nM und 100 nM) in einer einzigen Vertiefung von Zellen im Laufe der Zeit untersucht wurden, wurden Oszillationen der cAMP-Spiegel in HEK-293-Zellen beobachtet (Abbildung 2B). Die Periodizität dieser Schwingungen lag konstant bei etwa 200 s. Die routinemäßige Datenanalyse umfasst die Anpassung der Reaktion an ein Single-Site-Zerfallsmodell, das diese Schwingungen mittelt (siehe Verbindungslinie). Die gemeinsame Mittelung mehrerer Experimente führte in der Regel dazu, dass diese Oszillationen in den Daten verdeckt wurden. Nichtsdestotrotz weist der Biosensor eine Empfindlichkeit und schnelle Kinetik auf, die die Beobachtung von cAMP-Oszillationen ermöglicht.
cADDis können auch mit einem Fluoreszenzmikroskop gemessen werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von cAMP in einzelnen Zellen und kann auch angepasst werden, um Biosensoren zu visualisieren, die auf verschiedene subzelluläre Standorte ausgerichtet sind. In der vorliegenden Studie wurde der Biosensor in primären humanen Zellen der glatten Muskulatur der Atemwege (HASM) eingesetzt. Die Stimulation von HASM mit einem Vehikel, 10 μM Forskolin oder 10 nM Isoproterenol führt zu einer beobachtbaren Abnahme der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit (von 0 ΔF/Fo bei 120 s auf -0,9 ΔF/Fo bei 410 s) (Abbildung 3) (Video 1, Video 2 und Video 3). Die Fluoreszenz ist gleichmäßig im Zytosol der Zellen verteilt und schließt den Zellkern aus (siehe die Zeitraffer-Videos). So führten Forskolin und Isoproterenol zu einer ähnlich schnellen und beträchtlichen Abnahme der Fluoreszenz-HASM-Zellen. Diese Daten zeigen die Fähigkeit, den Biosensor in primären Zellkulturen einzusetzen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte des Biosensorprotokolls. Zunächst werden die Kulturzellen gespalten und mit frischen Medien resuspendiert, dann mit dem BacMam-Virus infiziert, das die cADDis-Sensoren trägt. Zellen nach der Transfektion werden mit pharmakologischen Wirkstoffen stimuliert, die zelluläre Signalwege auslösen, die cAMP verändern. Änderungen der Fluoreszenzintensität als Reaktion auf die variierende cAMP-Konzentration werden mit einem Plattenablese-Spektrophotometer (A) oder einem Fluoreszenzmikroskop (B) erfasst, was eine Echtzeit-Quantifizierung der cAMP-Dynamik ermöglicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig02.jpg"> Abbildung 2: Echtzeitüberwachung von cAMP in lebenden HEK-293-Zellen auf einem Plattenablese-Spektralphotometer. Die Fluoreszenz von HEK-293-Zellen auf 96-Well-Platten, die den Biosensor exprimieren, wurde über die Zeit gemessen. Nachdem die Fluoreszenz zu Studienbeginn etabliert war, wurde der Fluoreszenzzerfall 7 Minuten lang überwacht. (A) Der Fluoreszenzzerfall nach Zugabe von entweder 10 μM Forskolin oder 10 nM Isoproterenol wird als Mittelwert ± SEM von 10-15 Experimenten aufgetragen. (B) Fluoreszenzzerfallsoszillationen werden dargestellt, indem ein einzelnes Experiment nach der Zugabe von entweder 10 nM oder 100 nM Isoproterenol aufgetragen wird. Die Daten in beiden Diagrammen sind an ein Zerfallsmodell an einer einzelnen Stelle (Verbindungslinie) angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig03.jpg"> Abbildung 3: Echtzeit-Monitoring von cAMP in lebenden HASM-Zellen am Fluoreszenzmikroskop. Die Fluoreszenz von HASM-Zellen auf plattierten 35-mm-Schüsseln, die den Biosensor exprimieren, wurde über die Zeit gemessen. Nachdem die Ausgangswerte ermittelt worden waren, wurde der Fluoreszenzzerfall alle 30 s für 20 min gemessen. Das angegebene Mittel wurde bei 120 s (Pfeil) zugegeben. Die Fluoreszenzzerfallskurven des Biosensors reagieren entweder auf das Vehikel, 10 μM Forskolin oder 10 nM Isoproterenol. Die Daten eines einzelnen Experiments werden mit einer Verbindungslinie dargestellt. Zeitraffervideos von Zellen, die mit Vehikel (Kontrolle), Forskolin oder Isoproterenol behandelt wurden, sind enthalten, um eine visuelle Darstellung der Fluoreszenzreaktionen des Biosensors zu ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: Zeitraffervideo der Echtzeitüberwachung von cAMP in lebenden HASM-Zellen als Reaktion auf das Fahrzeug. Fluoreszenz-Abklingkurven des Biosensors in Bezug auf das Fahrzeug (Steuerung). Jedes Bild wurde alle 30 s für 20 Minuten aufgenommen. Maßstab: 40 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20jove%20control%20.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 2: Zeitraffervideo der Echtzeitüberwachung von cAMP in lebenden HASM-Zellen als Reaktion auf 10 μM Forskolin. Fluoreszenzzerfallskurven des Biosensors als Reaktion auf 10 μM Forskolin. Jedes Bild wurde alle 30 s für 20 Minuten aufgenommen. Maßstab: 40 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20FSK%20jove.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 3: Zeitraffervideo der Echtzeitüberwachung von cAMP in lebenden HASM-Zellen als Reaktion auf 10 nM Isoproterenol. Fluoreszenzzerfallskurven des Biosensors in Reaktion auf 10 nM Isoproterenol. Jedes Bild wurde alle 30 s für 20 Minuten aufgenommen. Maßstab: 40 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20iso%20jove.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Formulierung von Medien</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HASM mittel</td>
		</tr><tr><td>Name</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Hams F-12K</td>
			<td>419,65 mL</td>
		</tr><tr><td>FBS (Englisch)</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES (1M)</td>
			<td>12,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Natronlauge</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Calciumchlorid (1 M)</td>
			<td>0,850 mL</td>
		</tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Primocin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HEK mittel</td>
		</tr><tr><td>Name</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>DMEM (1x)</td>
			<td>444 mL</td>
		</tr><tr><td>FBS (Englisch)</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Primocin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Medienformulierung von HASM-Medium und HEK-Medium.

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll veranschaulicht die Wirksamkeit des cAMP Difference Detector In Situ bei der Messung von cAMP durch zwei Methoden. Bei einer Methode wird ein 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer mit HEK-293-Zellen verwendet. Die andere Methode zeigt einzelne HASM-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Wir dienen der Organisation von zyklischen KP-Mikrodomänen mit dem Schwerpunkt auf der Aufklärung, wie diese Kompartimente gebildet und aufrechterhalten werden. Wir versuchen, die Schlüsselkomponenten aufzudecken, die es Zellen ermöglichen, räumliche Signale innerhalb dieser Domänen zu erkennen, und untersuchen die Variation ihrer Interpretation und wie sich diese Merkmale bei Krankheiten wie Asthma und COPD verändern. Die Infektion von Primärzellen mit dem Beckman-Vektor ist eine Herausforderung.Dazu sollte der Zustand für den einzelnen Zelltyp optimiert werden, um eine ausreichende Expression des Biosensors zu erreichen. Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeit-Detektion und -Überwachung von Minuten bis Stunden sowie die Messung der Cyclocampu-Dynamik in lebenden Zellen. Dieser Biosensor hat eine hohe Spezifität für die Einhaltung des Cyclocamp-P. Folglich korrelieren die in diesem Aufsatz erzeugten Signale direkt mit zyklischen P-Spiegeln, wodurch die potenziellen Interferenzen durch die anderen zellulären Komponenten erheblich reduziert und zuverlässige Ergebnisse geliefert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI...

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Ein mikrofabriziertes Gerät mit verschließbaren Femtoliter-Volumen-Reaktionskammern wird beschrieben. Dieser Bericht enthält ein Protokoll zur Versiegelung zellfreier Proteinsynthese-Reaktanten in diesen Kammern, um die Rolle von Crowding und Confinement bei der Genexpression zu verstehen.

Plombierbare Femtoliter Kammer Arrays für Zellfreie Biologie

Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.

Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Lernen Sie die Echtzeit-Erfassung von cAMP-Dynamiken in lebenden Zellen mit einem spezifischen Fluoreszenz-Biosensor. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Messungen in HEK-293- und HASM-Zellen für die Signaltransduktionsforschung.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

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