Name: Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Lernen Sie die Biobanking-Strategie für Ovarialkarzinom-Organoide zur Berücksichtigung der Patientenheterogenität über verschiedene histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg. Diese Methode ermöglicht personalisierte Therapieansätze.

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Gefördert wird die Studie vom Deutschen Krebsforschungszentrum DKTK, Partnerstandort München, einer Partnerschaft zwischen dem DKFZ und dem Universitätsklinikum LMU München. Die Studie wird auch durch die Deutsche Krebshilfe (#70113426 und #70113433) unterstützt. Die Paraffineinbettung von Gewebe und Organoiden wurde an der Core Facility des Instituts für Anatomie der Medizinischen Fakultät der LMU München, München, durchgeführt. Die konfokale Bildgebung wurde in der Core Facility Bioimaging am Biomedical Center (BMC) durchgeführt. Die Autoren danken Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink und Martina Rahmeh für die technische Hilfe.

Standardisierung des organoiden Biobankings für Eierstockkrebs

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
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<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
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<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Fuerer, C., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+to+probe+and+manipulate+the+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway.</a> PLoS One. 5 (2), e9370(2010).</li>
<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microm+EC350+Modular+tissue+embedding+center+Instruction+manual%22">Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual</a>. , (2009).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K. ist als Erfinder in einem Patent aufgeführt, das sich auf ein Medium für Eierstockkrebs-Organoide bezieht. F.T. erhielt Forschungsgelder, Beirat, Honorare und Reisekosten von AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA Diagnostics und Tesaro/GSK. S.M. erhielt Forschungsgelder, Beirat, Ehren- oder Reisekosten: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Das entworfene Protokoll adressiert frühere Herausforderungen des Biobankings von Ovarialkarzinom-Organoiden in Bezug auf die Organoidbildung und das langfristige Passagepotenzial und stellt die Generierung vollständig expandierbarer Linien aus der Mehrheit der soliden Tumorablagerungen sicher. Der chirurgische Entnahmeprozess von Tumorproben, die für die Organoiderzeugung verwendet werden sollen, wirkt sich erheblich auf die Ausbeute und das Expansionspotenzial aus. Tumorgewebeproben können während verschiedener Verfahren gewonnen werden, einschließlich multiviszeraler Chirurgie, diagnostischer Laparoskopie oder Biopsie. Der erfahrene gynäko-onkologische Chirurg sollte der Entnahme sauberer Tumorproben aus Peritonealstellen Vorrang einräumen. Insbesondere wurde beobachtet, dass makroskopisch nekrotische Bereiche innerhalb großer Tumorablagerungen für die erfolgreiche Erzeugung von Organoidkulturen weniger geeignet sind. Da die Probenreinheit entscheidend ist, um molekulare und phänotypische Eigenschaften für nachgelagerte Anwendungen widerzuspiegeln, sind synchronisierte Anstrengungen sowohl der klinischen als auch der Laborteams für ein optimales Biobanking erforderlich, um sicherzustellen, dass die Linien aus den relevantesten Regionen des Tumors erstellt werden.
Während dieses Protokoll Variationen der Wachstumsfaktorabhängigkeiten abdeckt, die wir während 2 Jahren Biobanking beobachtet haben, ist es klar, dass eine zusätzliche Verfeinerung gerechtfertigt ist, um die Wirksamkeit weiter zu erhöhen, da wir in 20% der Fälle immer noch kein Organoidwachstum beobachteten und die Anzahl der Linien, die ein begrenztes Expansionspotenzial zeigten, auf eine suboptimale Aufrechterhaltung der Stammzellen hindeutete. Obwohl unsere Organoid-Biobank derzeit nur Eierstockkrebsproben der serösen Histologie (HGSOC und LGSOC) umfasst, zeigten unsere Erfahrungen mit Proben aus verschiedenen epithelialen Ovarialkarzinom-Histologien vor dem strukturierten Biobanking-Programm vergleichbare Erfolgsraten ohne spezifische Unterschiede. Bemerkenswert ist, dass die Mehrheit der epithelialen Ovarialkarzinom-Subtypen eine ähnliche säulenförmige pseudostratifizierte Morphologie mit Geweben aufweist, die sich aus dem Müller-Trakt (Eileiter, Gebärmutter, Gebärmutterhals) entwickelt haben, während im Gegensatz dazu das Eierstockepithel selbst entwicklungsbedingt aus dem Genitalkamm und dem Mesonephros stammt und mit einer einzigen Schicht quaderförmigem Epithel bedeckt ist. Da Entwicklungswege, die die Epithelhomöostase regulieren, eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des adulten Stammzellpotenzials spielen, sollten die Unterschiede im embryonalen Ursprung bei der Entwicklung von Protokollen für das Biobanking von Organoiden berücksichtigt werden. Daher glauben wir, dass Vorläuferzellen von der Oberfläche des Eierstocks wahrscheinlich organspezifische Kulturbedingungen benötigen, um ein langfristig stabiles Wachstum aufrechtzuerhalten.
Bemerkenswert ist, dass sich das Protokoll in unserem Labor auch für post-neoadjuvante Eierstockkrebsproben als erfolgreich erwiesen hat, obwohl die neoadjuvante Chemotherapie die Zellviabilität und den Gewebephänotyp beeinflusst. Diese Proben weisen mehr Trümmer und extrazelluläre Gewebeaggregate auf als Proben, die aus Chemotherapie-naivem Gewebe primärer Debulking-Operationen stammen, was das Organoidbildungspotenzial beeinträchtigen könnte. In diesen Fällen haben wir die Erfahrung gemacht, dass eine angemessene Menge an chirurgischem Gewebe und die strikte Einhaltung der empfohlenen Transportbedingungen für eine erfolgreiche Organoidgenerierung entscheidend sind, da die postneoadjuvanten Proben empfindlicher sein könnten.
Ein sehr interessantes Phänomen der positiven Wirkung einer kurzen Expansion auf Kunststoff in 2D von frisch isolierten Vorläuferzellen auf das nachfolgende Organoidwachstum, das wir wiederholt beobachtet und daher in das standardisierte experimentelle Verfahren einbezogen haben, ist eine wichtige Ergänzung der Methodik des Krebsorganoid-Forschungsfeldes, das weitgehend auf direkten Seeding-Strategien beruht. Es ist verlockend zu spekulieren, dass die Empfindlichkeit von Vorläuferzellen nach enzymatischer Verdauung und die Fähigkeit von Wachstumsfaktoren, sie angemessen zu primen, die zugrunde liegenden Mechanismen hinter diesem Unterschied sein könnten, der in einigen Fällen ein entscheidender Faktor ist, wenn die Linie etabliert werden kann. Es ist jedoch mehr Forschung erforderlich, um klare Abhängigkeiten herzustellen.
Bei der Bewältigung der Herausforderungen, die sich aus einer hohen Zelladhäsion und funktionellen Verbindungen in schwer verdaulichen 3D-Ovarialkarzinom-Organoiden ergeben, kann eine Kombination aus mechanischer und enzymatischer Dissoziation mit Nadel und Spritze helfen, wenn nach der Trypsinisierung große Klumpen zurückbleiben. Das Experimentieren mit verschiedenen enzymatischen Bedingungen könnte zu weiteren Verbesserungen führen.
Nach der Langzeitlagerung können Organoidlinien aufgetaut und gemäß dem Versuchsdesign in Kultur gebracht und für nachfolgende Anwendungen verwendet werden. Dies ermöglicht jederzeit den Zugriff auf bereits generierte Organoidlinien für spezifische Forschungszwecke und ist besonders interessant, um das Langzeitverhalten bestimmter Linien im Hinblick auf den Krankheitsverlauf des Patienten zu untersuchen. Die Kryokonservierung von Eierstockkrebs-Organoiden bleibt jedoch eine Herausforderung. Temperaturschwankungen während der Gefrier- und Auftauzyklen können sich negativ auf die Lebensfähigkeit, Funktionalität und das Expansionspotenzial von Organoiden auswirken. Die Langzeitlagerung ist in flüssigem Stickstoff stabiler, wo sehr niedrige Temperaturen das Risiko eines Abbaus minimieren, so dass die Integrität der Organoide erhalten bleiben kann. Eine kontinuierliche Optimierung ist jedoch gerechtfertigt, um konsistente Verfahren für das Einfrieren, Lagern und Auftauen zu etablieren, um diese Prozesse weiter zu verbessern.
Trotz der genannten offenen Fragen demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit, konsistent stabile Organoidlinien aus soliden Tumorproben von Patientinnen mit Eierstockkrebs zu erzeugen. In unserem Labor haben wir bisher 120 primäre Eierstockkrebs-Gewebeproben verarbeitet und in etwa 50 % der Fälle Erfolge erzielt, darunter ein breites Spektrum histologischer Subtypen und Stadien der Erkrankung mit primärem Debulking, rezidivierenden Erkrankungen und postneoadjuvanten chirurgischen Proben. Durch die Bereitstellung eines strukturierten Rahmens für die Erzeugung von Organoiden aus verschiedenen Patientenproben, das parallele Seeding in verschiedenen Medien und die Implementierung verschiedener Seeding-Strategien bietet dieses Protokoll die Möglichkeit, individuelle Unterschiede im Stammpotenzial zu bewerten und so zusätzliche Informationen über die Tumorbiologie zu liefern. Unseres Wissens folgt die überwiegende Mehrheit der Studien in der Regel dem umgekehrten Ansatz, die Mediumkomponenten an einer kleinen Anzahl von Proben zu testen und der Einfachheit halber meist ein optimales Medium auszuwählen. Unsere systematischen Tests der Wirkung von HER1ß, der Wirkung von RSPO1- und FGF10-Supplementierung und 2D/3D-Seeding zeigen schlüssig, dass Eierstockkrebsgewebe eine gewisse Variabilität zwischen den Patienten in den Stammeigenschaften aufweist und das optimale Medium in der Tat patientenspezifisch ist. Daher ist eine systematische parallele Prüfung verschiedener Medienzusammensetzungen, die unterschiedliche exogene parakrine Signalumgebungen bieten, unerlässlich.
Die Einrichtung einer lebenden Biobank mit einem umfangreichen Panel von Organoiden verschiedener Eierstockkrebspatientinnen zusammen mit ihren prospektiv gesammelten klinischen Informationen dient als wertvolle Ressource für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen und spiegelt die heterogene klinische Landschaft wider, die möglicherweise für eine größere Patientenpopulation anwendbar ist17. Langzeitkultivierung und Kryokonservierung ermöglichen experimentelle Konsistenz und die wiederholte Zugänglichkeit derselben Organoidlinie über die Zeit und dienen als Grundlage für longitudinale experimentelle Designs mit unveränderten zellulären Eigenschaften der Tumorlinie.
Durch die Beibehaltung der Epithelarchitektur und Polarisation sind die Organoidlinien ein geeignetes Modell, um die Zell-Zell-Kommunikation und kontextabhängige Zellschicksalsentscheidungen zu untersuchen, die durch parakrine Signalwege vermittelt werden. Die Einbettung der Organoide in das histologische Gel ist ein praktischer und effizienter Zwischenschritt, um Materialverluste nach der Fixierung zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Weiterverarbeitung (Einbettung in Paraffin und Schnitt) parallel zu Gewebeproben durchgeführt werden kann. Der Verlust von Organoiden während des Fixierungsvorgangs ist ein kritisches Problem, wenn die Anzahl der Organoide sehr begrenzt ist. Diesem Verlust kann jedoch entgegengewirkt werden, indem die Organoide durch Waschen in einem kalten Basalkulturmedium gründlich aus der extrazellulären Matrix entfernt werden und vor der Fixierung mindestens zwei ausgewachsene Wells einer Platte im 24-Well-Format gepoolt werden. Das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht eine hochauflösende konfokale Bildgebung, um molekulare und phänotypische Eigenschaften der Eierstockkrebs-Organoide mit dem elterlichen Tumorgewebe zu korrespondieren, ist aber auch ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der zellulären Reaktion auf chemische Verbindungen oder zur Charakterisierung genetisch veränderter Linien. Die Methode eignet sich auch für die histologische Färbung ohne spezifische Modifikationen. Je nach Zweck der Studie sollten dünnere Schnitte in Betracht gezogen werden, die mit einem Mikrotom (2-3 μm) geschnitten wurden.
Wichtig ist, dass eine stabile Langzeitkultur eine Voraussetzung für Gen-Editing-Experimente und funktionelle Assays über das Ansprechen und die Resistenz von Medikamenten gegen neuartige und Standardtherapien ist17,21. Insbesondere Organoide, die aus Rebiopsien generiert werden, die während des Krankheitsverlaufs und -rezidivs durchgeführt werden, bieten die Möglichkeit für direkte vergleichende Analysen zwischen dem therapienaiven Ursprungstumor und den neu erworbenen Merkmalen, die während des Rezidivs beobachtet werden. Die Identifizierung patientenspezifischer Behandlungsansprachen und die Bildung von Therapieresistenzen in vitro bringen das Gebiet der Präzisionsmedizin in der Eierstockkrebsforschung voran21.

Die klinische Behandlung von Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom bleibt aufgrund des heterogenen klinischen Erscheinungsbilds in fortgeschrittenen Stadien und der hohen Rezidivrateneine Herausforderung 1. Um die Entwicklung und das biologische Verhalten von Eierstockkrebs besser zu verstehen, sind Forschungsansätze erforderlich, die sich mit der patientenspezifischen Variabilität im Krankheitsverlauf, dem Ansprechen auf die Behandlung und den histopathologischen sowie molekularen Merkmalen befassen2.
Biobanking, das sich durch die systematische Sammlung und Langzeitkonservierung von Tumorproben von Eierstockkrebspatientinnen zusammen mit ihren klinischen Informationen auszeichnet, bietet die Erhaltung einer großen Patientenkohorte in verschiedenen Krankheitsstadien, einschließlich Tumorproben aus primären Debulking-Operationen, nach neoadjuvanter Chemotherapie und nach rezidivierenden Erkrankungen. Es birgt wertvolles Potenzial für die Weiterentwicklung der Krebsforschung und dient als Ressource für vielversprechende prognostische Biomarker und therapeutische Ziele3. Herkömmliche Biobanking-Methoden wie Formalinfixierung und Einfrieren sind jedoch aufgrund des Verlusts der Lebensfähigkeit und der Störung der nativen dreidimensionalen Gewebearchitektur nicht für die Durchführung funktioneller Studien an den ursprünglichen Tumorproben geeignet 4,5.
Studien zu molekularen Mechanismen in der Onkologie und darüber hinaus hängen entscheidend von der Verwendung geeigneter experimenteller Modelle ab, die die Biologie der Krankheit getreu widerspiegeln und die in vitro Eigenschaften des in vivo beobachteten Gewebes beibehalten. Von Patienten stammende Organoide, die auf der Erhaltung des Erneuerungspotenzials basieren, reproduzieren im Labor die ursprüngliche Struktur und Funktion des Epithels und ermöglichen Tests in einem patientenspezifischen Kontext. Daher haben sie sich als vielversprechende Werkzeuge für die Krebsforschung und die personalisierte Medizin erwiesen, die die Lücke zwischen klinischer Vielfalt und Laborforschung schließen 6,7,8,9. Maßgeschneiderte therapeutische Strategien, die auf individuellen Wirkstoffreaktionen von Organoidlinien und der Prüfung der funktionellen Relevanz molekularer Profile basieren, können möglicherweise direkt auf die Patientenversorgung angewendet werden10,11. Die Möglichkeit der langfristigen Kultivierung unter Einbeziehung patientenspezifischer Merkmale und der Sammlung relevanter prospektiver klinischer Daten im Laufe der Zeit ist vielversprechend, um neue prognostische und prädiktive Faktoren zu identifizieren, die an der Krankheitsprogression und den Resistenzmechanismen beteiligt sind 3,9.
Der Aufbau einer Biobank, die Organoide aus verschiedenen Tumorproben enthält, erfordert jedoch eine Kombination aus strikter Einhaltung komplexer Methoden und der Einrichtung von Protokollen für eine einfache Wartung12. Die Prozessstandardisierung stellt sicher, dass die Biobank auch bei hohem Umsatz effizient von geschultem Personal aufgebaut und gepflegt werden kann und gleichzeitig höchste Qualitätsstandards eingehalten werden13. Mehrere Studien berichteten über die erfolgreiche Erzeugung stabiler Ovarialkarzinom-Organoidlinien, die dem Mutations- und phänotypischen Profil des ursprünglichen Tumors mit unterschiedlichen Effizienzraten entsprechen. Dennoch bleibt das routinemäßige Biobanking in der Praxis eine Herausforderung, insbesondere für ein langfristig stabiles Wachstum der Linien, das eine Voraussetzung für eine groß angelegte Expansion oder eine erfolgreiche Genomeditierung ist.
Insbesondere das Problem der Erweiterbarkeit bleibt in der Praxis vage definiert, da Organoide, die ein langsames und begrenztes Wachstumspotenzial aufweisen, gelegentlich als etablierte Linien gezählt werden. Wie ursprünglich von Hoffmann et al. gezeigt, einer Studie, deren Hauptergebnisse die Grundlage für dieses weiterentwickelte Protokoll bildeten, erfordert der optimale Umgang mit Eierstockkrebsgewebe eine einzigartige Strategie, um der Heterogenität Rechnung zu tragen14. Die phänotypische Charakterisierung der mit dieser Methode erhaltenen Organoide und die enge Ähnlichkeit mit dem elterlichen Tumorgewebe wurden durch Panel-DNA-Sequenzierung und Transkriptomik-Analyse reifer Kulturen (4-10 Monate Kultivierung) bestätigt, was die Stabilität des Modellsbelegt 8,9,12,14.
Im Gegensatz zur parakrinen Umgebung, die die Homöostase in den gesunden Eileitern reguliert, ist die Epithelschicht, die wahrscheinlich hochgradigen serösen Ovarialkrebs (HGSOC), das Krebsregenerationspotenzial und die Organoidbildungskapazität hervorbringt, weniger abhängig von einer exogenen Wnt-Supplementierung. Darüber hinaus erwies sich die aktive Signalgebung des Bone Morphogenetic Protein (BMP), die durch das Fehlen von Noggin im Organoidmedium gekennzeichnet ist, als vorteilhaft für die Etablierung von Langzeitkulturen aus festen Gewebeablagerungen von Eierstockkrebs14,15. Während des systematischen Biobankings von festen Ablagerungen von Eierstockkrebs haben wir diese Ergebnisse bestätigt und die Pipeline eingerichtet, wobei die Details in diesem Protokoll beschrieben sind, die in den meisten Fällen eine nachhaltige langfristige Expansion gewährleisten. Wir stellen fest, dass parallele Tests verschiedener Medienzusammensetzungen und Aussaatmodalitäten bei der Arbeit mit primären Isolaten unerlässlich sind, um die Etablierung langzeitstabiler Organoidlinien zu verbessern und die Ausbeute zu erhöhen, die eine robuste Vermehrung und Erweiterung auf Multiwell-Formate ermöglicht, die für nachgelagerte Experimente erforderlich sind16.
Darüber hinaus sind die Reinheit und Qualität der während der Operation entnommenen Proben von entscheidender Bedeutung für das translationale Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden in der Grundlagenforschung und molekularen Diagnostik. Die Komplexität der klinischen Präsentation von HGSOC erfordert eine enge Zusammenarbeit zwischen den Chirurgen, Onkologen und den Wissenschaftlern im Labor, um sicherzustellen, dass relevantes Material korrekt identifiziert, die Transportbedingungen konstant gehalten und Organoidlinien mit hoher Effizienz erzeugt werden, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit jedes Patienten darstellen. Dieses Protokoll bietet einen standardisierten, aber anpassungsfähigen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung der Heterogenität zu erfassen, die Eierstockkrebs charakterisiert16,17. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll ein zuverlässiges Biobanking des breiten Spektrums des klinischen Erscheinungsbildes von Eierstockkrebs, einschließlich verschiedener histologischer Typen (hochgradiger und niedriggradiger Eierstockkrebs, LGSOC), verschiedener Ablagerungen von denselben Patientinnen, die Unterschiede in der Stammzellregulation aufweisen, Gewebe von Operationen in postneoadjuvanter Umgebung, Biopsiematerial und Proben von Operationen in der rezidivierenden Phase des Krankheitsverlaufs.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-Fc</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>Alternative: R-Spondin1 exprimierende Zelllinie, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b RI Kinase Inhibitor IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53-Antikörper (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8-Antikörper</td><td>Proteintech, Manchester, Vereinigtes Königreich&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Nachtrag (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenaufsatz-Vakuumfilter 0,2 &Mikro; m</td><td>Corning, Berlin, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturflasche, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Österreich</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturflasche, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Österreich</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturflasche, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Österreich</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-Well Clear TC-behandelt&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Deutschland&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; Human Centered Science, Heidelberg, Deutschland</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Basalmembranextrakt mit reduziertem Wachstumsfaktor, Typ 2, Pathclear</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>3533-005-02</td><td>Alternativ: Matrigel, Wachstumsfaktor-reduzierte Basalmembranmatrix&nbsp; Corning, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; Citrat Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti Kaninchen Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Polystyrol&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>Federskalpell&nbsp;</td><td>Pfm medical, Köln, Deutschland</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalin 37% säurefrei, stabilisiert</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Deutschland</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>Humane EpCAM/TROP-1 Antikörper</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>Humanes FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X Kernsoftware</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp; Weißlicht-Laser-Konfokalmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Ergänzung (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin-Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omnilab, München, Deutschland</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Deutschland</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro; m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Deutschland</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, Frankreich</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Buffer für rote Blutkörperchen</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Kryofläschchen</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Deutschland</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Deutschland</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie für das biobanking von ovarialkarzinom-organoiden: berücksichtigung der heterogenität zwischen patienten über histologische subtypen und krankheitsstadien hinweg

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Während die Einrichtung einer Eierstockkrebs-Biobank aus patienteneigenen Organoiden zusammen mit ihren klinischen Hintergrundinformationen Fortschritte in der Forschung und Patientenversorgung verspricht, bleibt die Standardisierung aufgrund der Heterogenität dieser tödlichen Malignität in Kombination mit der inhärenten Komplexität der Organoidtechnologie eine Herausforderung. Dieses anpassungsfähige Protokoll bietet einen systematischen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung einer patientenspezifischen Variabilität der Vorläuferzellen auszuschöpfen. Durch die Implementierung eines strukturierten experimentellen Arbeitsablaufs zur Auswahl optimaler Kulturbedingungen und Seeding-Methoden mit parallelen Tests der direkten 3D-Seeding im Vergleich zu einer 2D/3D-Route erhalten wir in den meisten Fällen robuste, langfristig expandierende Linien, die für eine breite Palette von Downstream-Anwendungen geeignet sind. 
Insbesondere wurde das Protokoll in einer großen Anzahl von Fällen (N = 120) mit sehr heterogenem Ausgangsmaterial, einschließlich hochgradigem und niedriggradigem Eierstockkrebs und Stadien der Erkrankung mit primärem Debulking, rezidivierender Erkrankung und postneoadjuvanten chirurgischen Proben, getestet und als wirksam erwiesen. In einer exogenen Umgebung mit niedrigem Wnt und hohem BMP beobachteten wir, dass Vorläuferzellen unterschiedlich anfällig für die Aktivierung des Heregulin 1 ß (HERß-1)-Signalwegs sind, wobei HERß-1 in einigen die Organoidbildung fördert, während sie in anderen gehemmt wird. Für eine Teilmenge der Patientenproben erfordern eine optimale Organoidbildung und ein langfristiges Wachstum die Zugabe von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und R-Spondin 1 zum Medium. 
Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte der Gewebeverdauung und der Vorläuferisolierung hervor und weisen auf Beispiele hin, bei denen eine kurze Kultivierung in 2D auf Kunststoff für die anschließende Organoidbildung in der Basalmembranextrakt-Typ-2-Matrix von Vorteil ist. Insgesamt erfordert ein optimales Biobanking eine systematische parallele Prüfung aller Hauptbedingungen, um ein adäquates Wachstumsumfeld für einzelne Sparten zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt auch das Handhabungsverfahren für effizientes Einbetten, Schneiden und Färben, um hochauflösende Bilder von Organoiden zu erhalten, die für eine umfassende Phänotypisierung erforderlich sind.

Nach anfänglicher Gewebedissoziation, Filtration und Zählung werden die Zellen parallel direkt im 3D-Format ausgesät, wie oben erläutert, sowie die Suspension im Kolben für eine kurze 2D-Expansion. In einigen Fällen beeinflusst die vorübergehende 2D-Expansion die Organoidbildung positiv, und die Langzeitlinie wird auf diesem Weg erfolgreich etabliert, während eine vergleichende parallele 3D-Aussaat zu einem Wachstumsstillstand führen kann (Abbildung 1). Für jedes Spendergewebe, das aufbereitet wird, werden die Zellen gemäß der Medienmatrix getestet. Nach dieser Strategie enthält unsere Biobank nun Linien, die für jede Standardwachstumsbedingung repräsentativ sind, wie in Abbildung 2 dargestellt. Durch die stringente Implementierung dieser Mini-Screening-Plattform zum Testen verschiedener Medien und Aussaatmodi haben wir erfolgreich Organoidlinien aus verschiedenen histologischen Typen und Stadien der Krankheitsentwicklung von Eierstockkrebs (Abbildung 3) von primären hochgradigen serösen, postneoadjuvanten Intervalloperationen und von rezidivierenden Erkrankungen generiert. Die phänotypische Charakterisierung der Organoidlinien durch Immunfluoreszenzfärbung der Hauptmarker im Vergleich zum elterlichen Gewebe zeigt überzeugend, dass die Merkmale des epithelialen Tumorkompartiments im Organoidmodell erhalten bleiben: Epithelarchitektur und Adhäsion markiert durch (EpCAM), Linienidentität (PAX8) und typische TP53-Punktmutation, die für HGSOC charakteristisch ist und zu einer Akkumulation im Zellkern führt (Abbildung 4).
Einige wichtige methodische Punkte sind auch für eine effiziente Entscheidungsfindung beim Organoid-Biobanking zu beachten. Das Wachstumspotenzial von Organoiden wird nicht nur durch die Zunahme des Organoiddurchmessers bestimmt. Darüber hinaus bestimmen phänotypische Merkmale Ausdehnungspotenziale wie Farbe, Dunkelheit und Konturintegrität. Die Bildung von zytoplasmatischen Stressvakuolen weist auf suboptimale Bedingungen hin. Erste Probleme in Bezug auf Wachstum und Organoid-bildendes Potenzial können aufgrund ungeeigneter Transportbedingungen und Verzögerungen der Gewebeverarbeitung auftreten. Da innerhalb der Tumorlinien eine hohe interindividuelle Variabilität des Expansionspotenzials beobachtet wird, empfehlen wir, mindestens 14 Tage zu warten, bevor eine endgültige Entscheidung über das Wachstumspotenzial getroffen wird. Wenn zunächst ähnliche Wachstumsmuster in verschiedenen Medien beobachtet werden, sollten mehrere Bedingungen erweitert werden. Aus unserer Erfahrung ist eine klare Unterscheidung von langfristig stabilem Wachstumspotenzial oft erst nach einer mehrwöchigen oder monatelangen Kultivierung möglich.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> Abbildung 1: Vorteile der kurzen Aussaat in 2D von primären Isolaten für die nachfolgende Organoid-Generierung. (A) Schema des Versuchslayouts mit bidirektionaler, paralleler Seeding-Strategie: 2D/3D und direktes 3D-Seeding in vier verschiedenen Medien. (B) Bild der adhärenten primären Isolate vor der Trypsinisierung und dem 3D-Transfer. (C) Ein Beispiel für die primäre Lagerstätte, bei der die parallele Aussaat den klaren Vorteil der 2D/3D-Route zeigte, da eine langfristige Organoidexpansion nur aus Vorläuferzellen möglich war, die ursprünglich auf Kunststoff isoliert waren. Das Bild oben links zeigt eine 3D-Kultur 7 Tage nach der Isolierung an Passage 0 (als P0 bezeichnet) mit unzureichender Organoidbildung nach der ersten Passage (als P1 bezeichnet) im unteren linken Bild. Nach der 2D-Aussaat auf Kunststoff (siehe Abbildung 1B) und dem anschließenden Transfer in eine 3D-Kultur ist bereits bei P0 eine bessere Organoidbildung erkennbar, während das langfristige Expansionspotenzial bei Passage 4 (P4) bestätigt wird. Maßstabsbalken = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> Abbildung 2: Patientenspezifischer Medienbedarf. Beispiele für vier verschiedene langzeitstabile, expandierte Linien, die jeweils in einem anderen Medium wachsen. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzungen: OCM = Eierstockkrebs mittel; her = Heregulin 1β; HGSO = hochgradiger seröser Eierstockkrebs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> Abbildung 3: Organoidbildung aus allen Stadien der Krankheit. Bilder von langfristig stabilen expandierenden Linien, von hochgradigem serösem und niedriggradigem serösem Eierstockkrebs in der Primärerkrankung, von Intervalloperationen (nach neoadjuvanter Chemotherapie) und von rezidivierendem Krebsgewebe. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzungen: HGSOC = hochgradiger seröser Eierstockkrebs; LGSOC = niedriggradiger seröser Eierstockkrebs; NACT = neoadjuvante Chemotherapie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> Abbildung 4: Enge Übereinstimmung des Phänotyps von Organoiden und elterlichem Krebsgewebe. Konfokale Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von (A) Krebsgewebe und (B) gepaarter Organoidlinie zeigen eine sehr hohe Ähnlichkeit im Färbemuster und Expressionsniveau aller Marker, EpCAM (grün), PAX8 (rot), TP53 (magenta). Maßstabsbalken = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung des in diesem Protokoll verwendeten Mediums und Aufschlussgemisches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen für die Etablierung von Eierstockkrebs-Organoiden aus verschiedenen Krankheitsstadien und adressiert die Herausforderungen der patientenspezifischen Variabilität, um die Ausbeute zu erhöhen und eine robuste langfristige Expansion für nachfolgende Anwendungen zu ermöglichen. Es umfasst detaillierte Schritte für die Gewebeverarbeitung, die Aussaat, die Anpassung der Medienanforderungen und die Immunfluoreszenzfärbung.

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

Das beste klinische Management in der translationalen Spitzenforschung für Patientinnen mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs hat an unserer Einrichtung höchste Priorität. Mit dem Biobanking von patientengewonnenen Organoiden haben wir große Fortschritte in Richtung eines individuell zugeschnittenen Managements erzielt. Dies ermöglicht es uns, patientenspezifische Merkmale zu bewerten und prädiktive Biomarker zu identifizieren.Wir haben in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte bei der Verbesserung der radikalen multiviszeralen Chirurgie, der Chemotherapie, der anti-angiogenen Therapie und auch der PARP-Inhibitor-Therapie bei Patientinnen mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs gemacht und die Überlebensraten trotzdem verbessert. Der nächste große Schritt wäre nun, besser vorherzusagen, welcher Patient von welcher spezifischen Behandlung profitieren würde. Derzeit basieren klinische Behandlungsentscheidungen auf allgemeinen histopathologischen Merkmalen und auf Informationen über homologen Empfehlungsmangel oder werden in paraffineingebettetem Tumorgewebe getestet.Biologische Modelle, die das spezifische Ansprechen auf Chemotherapien und gezielte Behandlungen bewerten, sind in der klinischen Routine noch nicht implementiert. Wir haben Schlüsselmerkmale von Eierstockkrebsgewebe identifiziert, insbesondere die Kulturanforderungen, die erforderlich sind, um sein Erneuerungspotenzial in vitro aufrechtzuerhalten, und nutzen dieses Wissen, um ein robustes langfristiges Wachstum von Organoidlinien zu erreichen und eine Biobank aus Proben in verschiedenen Stadien der Krankheit zu erstellen. Unsere tägliche Erfahrung im Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden zeigt effektiv eine bemerkenswerte Heterogenität in der Biologie dieser Malignität, die den Weg für eine neue Klassifizierung ebnen oder die Grundlage für neue therapeutische Lösungen schaffen könnte, die auf das Potenzial von STEMI abzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.

Kultur von Blasenkrebs-Organoiden als Werkzeuge der Präzisionsmedizin

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Wir stellen ein Protokoll vor, mit dem therapeutische Arzneimitteltests mit Patientinnen-Ovarialkarzinom-Organoiden durchgeführt werden können.

Ovarialkarzinom-Patientinnen-abgeleitete Organoid-Modelle für präklinische Medikamententests

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung dreidimensionaler (3D) Gewebeorganoide aus primären humanen Zellen des Oberflächenepithels der Eierstöcke (hOSE). Das Protokoll umfasst die Isolierung von hOSE aus frisch entnommenen Eierstöcken, die zelluläre Expansion des hOSE, Kryokonservierungs- und Auftauverfahren und die Ableitung von Organoiden. Immunfluoreszenz, quantitative Analyse und die Präsentation des Nutzens als Screening-Plattform sind enthalten.

Organoide des menschlichen Oberflächenepithels der Eierstöcke als Plattform zur Untersuchung der Geweberegeneration

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Mausmodellen (HGSOC) in vitro und in vivo. Von der Gewinnung von murinen Eileiter-Organoiden über ihre genetische Modifikation zur Rekapitulation der menschlichen HGSOC-Genetik bis hin zu ihrer Einführung in den Eierstockschleimbeutel syngener Mäuse für die in vivo-Entwicklung von Tumoren.

Entwicklung von mausabgeleiteten Organoidlinien aus Epithelzellen des Eileiters für die Modellierung des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms

Lernen Sie die Biobanking-Strategie für Ovarialkarzinom-Organoide zur Berücksichtigung der Patientenheterogenität über verschiedene histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg. Diese Methode ermöglicht personalisierte Therapieansätze.

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg (Video) | JoVE Journal

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg

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