Name: Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Präzisionsdissektion von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe unter dem Mikroskop zur Verbesserung der RNA-Ausbeute und histologischen Analyse. Diese Methode ermöglicht effiziente Genexpressionsstudien.

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Diese Arbeit wird vom NIDDK des NIH unter der Fördernummer R01DK116899, USDA/ARS unter der Fördernummer 3092-51000-064-000D und einem Pilotpreis des Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute unterstützt. Die Flussdiagramme wurden mit BioRender erstellt.

Morphologische und molekulare Charakterisierung der scBAT bei Mäusen

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<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
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<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren zur Dissektion und Verarbeitung von scBAT für H&E- und Genexpressionsanalysen detailliert vor. Da sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses befindet und entlang der großen Venen liegt, erfordert die Isolierung dieses Depots eine präzise Technik. Um eine klare Sicht auf das Depot zu erhalten, empfehlen wir, die Maus nach dem Öffnen des Halses unter ein Präpariermikroskop zu legen. Verwenden Sie eine superfeine Pinzette, um scBAT von der Speicheldrüse und den umgebenden Venen abzuziehen, und achten Sie darauf, dass die Venen nicht punktiert werden. Übermäßige Blutungen können die Lokalisierung des scBAT erschweren. Um scBAT für die H&E-Färbung zu verarbeiten, passten wir die Verwendung eines veröffentlichten Protokolls19 mit leichten Modifikationen an, um die Verwendung von 4 % PFA, Dehydrierungsalkoholen und einem organischen Lösungsmittel, Toluol, für die Gewebeverarbeitung einzubeziehen, wie im Protokollabschnitt gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert ~6 Tage, und H&E-gefärbte Objektträger können am nächsten Tag nach Abschluss der Färbung abgebildet werden.
Die RT-qPCR mit RNA als Ausgangsmaterial ist die am häufigsten verwendete Methode zur Genexpressionsanalyse im Bereich der Fettgewebebiologie. Da scBAT im Vergleich zu iBAT ein relativ kleines BAT-Depot ist, kann es schwierig sein, ausreichend RNA für die Genexpression zu erhalten. Um die RNA-Ausbeute zu erhöhen, empfehlen wir, sequentielle Lysatvorbereitungsschritte wie im Protokollabschnitt beschrieben anzuwenden, beginnend mit dem Pulverisieren des Gewebes mit einem Stößel und Mörser im gefrorenen Zustand. Mit dieser Lysat-Präparationsmethode ist es uns gelungen, eine ertragreiche und qualitativ hochwertige RNA-Probe für die Genexpressionsanalyse von scBAT von einer erwachsenen Maus zu erhalten. Diese Lysatherstellungsmethode kann auch angewendet werden, um hochwertige Proteinlysate aus scBAT für Western Blotting unter Verwendung von Proteinlysepuffer zu erhalten.
Mit Hilfe von Maus-iBAT haben Forscher umfangreiche Erkenntnisse über die BAT-Funktion in der Thermogenese und im Stoffwechsel gewonnen. Die jüngste Identifizierung einiger bisher unerkannter BAT-Depots bei Mäusen und Menschen, einschließlich scBAT, zeigte, dass weitere Studien erforderlich sind, bevor wir den physiologischen Beitrag von BAT bei Mäusen und erwachsenen Menschen vollständig verstehen können. Insbesondere sind Studien gerechtfertigt, die die Ursprünge, Funktionen und die Beteiligung dieser neu gefundenen BAT-Depots an der Thermogenese und dem regionalen oder Ganzkörperstoffwechsel beleuchten.

Die zunehmende Prävalenz von Fettleibigkeit in den USA und weltweit hat ein großes Interesse am Verständnis ihrer Ätiologie und an der Identifizierung potenzieller Behandlungen geweckt 1,2. Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, und eine Fehlregulation des Fettgewebes kann zur Entwicklung von Fettleibigkeit führen. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Fettgewebe, weißes und braunes Fettgewebe. Während weißes Fettgewebe (WAT) chemische Energie speichern und endokrine Faktoren absondern kann, kann braunes Fettgewebe (BAT) chemische Energie nutzen, um Wärme zu erzeugen und die Körpertemperatur in der Kälte aufrechtzuerhalten 3,4. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit kann die Aktivierung von BAT auch den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern5.
BAT übt seine Funktion durch nicht zitternde Thermogenese aus, ein Prozess, der durch die Entkopplung des Proteins 1 (UCP1)6 vermittelt wird. Säugetiere, einschließlich Mäuse und Menschen, besitzen unterschiedliche Mengen an BAT. Die klassische Ansicht von BAT ist, dass diese Fettgewebe bei Mäusen und Säuglingen häufiger vorkommen als bei erwachsenen Menschen. iBAT, das sich in der oberen dorsalen Flanke zwischen den Schulterblättern befindet, ist das am besten untersuchte BAT-Depot bei Mäusen. Durch die Anwendung von Radioisotopenbildgebung und Biopsietests identifizierten neuere Studien mehrere BAT-Depots bei erwachsenen Menschen. Einige von ihnen, einschließlich der Depots im tiefen Hals und im supraklavikulären Bereich, waren zuvor nicht bei Mäusen oder anderen Modelltieren identifiziert worden 7,8,9,10,11. Unter diesen BAT-Depots ist das scBAT das am häufigsten gesehene Depot bei erwachsenen Menschen. Um den Ursprung und den molekularen Beitrag dieser neu entdeckten BAT-Depots beim Menschen besser zu verstehen, ist es wichtig, äquivalente Depots in Mäusen zu identifizieren, die genetische und molekulare Manipulationen ermöglichen, um die funktionelle Rolle dieser Depots zu verfolgen und zu testen. Daher identifizierten wir und andere einige bisher unbekannte BAT-Depots an verschiedenen anatomischen Stellen bei Mäusen, darunter scBAT12,13, thorakale perivaskuläre BAT14,15, perirenale BAT16 und periaortale BAT17. Maus-scBAT ähnelt anatomisch dem menschlichen scBAT und ähnelt morphologisch dem klassischen iBAT, wobei es hohe Konzentrationen von UCP112 exprimiert.
Im Gegensatz zu Maus-iBAT, das leicht präpariert werden kann, befindet sich scBAT in der Zwischenschicht des Maushalses, unter den Speicheldrüsen und entlang der äußeren Halsvene. Die Isolierung dieses Depots für histologische und molekulare Analysen kann eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir detailliert das Verfahren zur Dissektion von scBAT aus postnatalen und adulten Mäusen und zur Verarbeitung dieses Depots für die Histologie und Genexpressionsanalyse.

<table><tbody><tr><td>95 % Dehydrierungsalkohol (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>100 % Dehydrierungsalkohol (Flex 100)</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Platte</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Binding Mini Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum High Stringency Wash</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Low Stringency Wash</td><td>Bio-Rad</td><td>7326804</td><td></td></tr><tr><td>Basisformen (zum Einbetten)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel 21g x 1 1/2"</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen ohne Kappe 2 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Niedrigviskoses Eindeckmedium</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td>SMZ1500</tr><tr><td>DNase Verdünnungslösung</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Elutionslösung</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 Einbettmedium Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (0,5 % w/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Formel R Infiltrationsmedium Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (für HCL-Ethanol)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI Einbettkassetten</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (für 70% Ethanol)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,7 mL</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Dichtungen (haftende Dichtungen)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologie</td><td>Grade Water Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mörser Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (für 0,85 % Kochsalzlösung)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinsektion Flotationsbad</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tube Strip</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Stößel von Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Stößel Pellet Motor</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Vakuumofen Modell 19&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>Grundierung: 36B4&nbsp; (vorwärts) 10 &mu; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: 36B4 (Rückseite) 10 &mu; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Fibel: Fabp4 (forward) 10 &mu; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Fibel: Fabp4 (Rückseite) 10 &mu; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Glut 4 (forward primer) 10 &mu; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Fibel: Glut 4 (umgekehrt) 10 &mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: PPARg (forward) 10 &mu; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Fibel: PPARg (Reserve) 10 &mu; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: Ppargc1a (Rückseite) 10 &mu; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: Ppargc1a(forward) 10 &mu; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: Ucp1 (forward) 10 &mu; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>Einführung: Ucp1 (umgekehrt) 10 &mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo-Datenbank</td></tr><tr><td>RNA-Isolationslösung (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (Oberflächendekontaminationsmittel)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor (RNase Out)</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen (Glas)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Trockenbank&nbsp;</td><td>Elektrothermisch (Cole-Parmer)</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Färbegestell</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop (zum Einbetten)</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Sugical Scissors</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>Superfeine Spitze Präparierzange</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transkriptase (enthält 5x Erststrangpuffer und 0,1 M DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET Spritze mit Nadel 25 G x 5/8", 1 mL</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (qPCR Enzym Master Mixture)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (Tiegel)</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>Artikelnummer: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion, histologische verarbeitung und genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem fettgewebe

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

Die durch braunes Fettgewebe (BAT) vermittelte Thermogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, und ihre Morphologie und Funktion kann durch Umweltreize bei Mäusen und Menschen stark beeinflusst werden. Derzeit ist das murine interscapulare BAT (iBAT), das sich zwischen zwei Schulterblättern in der oberen Rückenflanke von Mäusen befindet, das wichtigste BAT-Depot, das von Forschungslabors zur Untersuchung der BAT-Funktion verwendet wird. Kürzlich wurden einige bisher unbekannte BAT-Depots bei Mäusen identifiziert, darunter eines, das dem menschlichen supraklavikulären braunen Fettgewebe entspricht. Im Gegensatz zu iBAT befindet sich das murine supraklavikuläre braune Fettgewebe (scBAT) in der Zwischenschicht des Halses und ist daher nicht so leicht zugänglich.
Um die Untersuchung neu identifizierter Maus-scBAT zu erleichtern, wird hierin ein Protokoll vorgestellt, das die Schritte zur Sezierung von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen detailliert beschreibt. Aufgrund der geringen Größe von scBAT im Vergleich zu anderen Fettdepots wurden die Verfahren speziell für die Verarbeitung von scBAT modifiziert und optimiert. Zu diesen Modifikationen gehört der Einsatz eines Präpariermikroskops während der Gewebeentnahme, um die Präzision und Homogenisierung von gefrorenen scBAT-Proben zu erhöhen, um die Effizienz der nachfolgenden qPCR-Analyse zu erhöhen. Mit diesen Optimierungen können die Identifizierung, das morphologische Auftreten und die molekulare Charakterisierung des scBAT in Mäusen bestimmt werden.

Im Gegensatz zu iBAT, das sich in der subkutanen Schicht des Rückens zwischen zwei Schulterblättern befindet, befindet sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses und erstreckt sich tief zwischen den Schichten der Skelettmuskulatur und der Speicheldrüse, während es entlang der äußeren Halsvene wächst (Abbildung 1A). Das Sezieren von scBAT ist nicht so einfach wie iBAT. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren mit entscheidenden Schritten zur Dissektion von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen vor (Abbildung 1B,C). Nach dem Öffnen des Halses mit dem mitgelieferten Protokoll kann eine dünne Schicht scBAT unter einem Präpariermikroskop identifiziert und mit einer Pinzette von der angeschlossenen Speicheldrüse und der Vena jugularis externa abgezogen werden (Abbildung 1D,E). Um die Morphologie des Depots zu beurteilen, wurde frisch isoliertes scBAT unter Verwendung des bereitgestellten Verarbeitungsverfahrens in Kombination mit einem zuvor veröffentlichten H&amp;E-Färbeverfahren19 verarbeitet (Abbildung 2A). Wie in Abbildung 2B gezeigt, besitzt scBAT Gewebestrukturen, die für BAT-Depots typisch sind, und besteht aus vielen kleinen, multilokulären Adipozyten in gesunden postnatalen und adulten Mäusen. Um die Genexpressionsniveaus in scBAT zu bestimmen, wurde RNA aus isolierten scBAT-Depots mit den bereitgestellten Verfahren extrahiert (Abbildung 3A). Die Expressionsniveaus von Genen von Interesse können dann mit Standard-RT-qPCR-Methoden bewertet werden (Abbildung 3A). Wie in Abbildung 3B gezeigt, die unterschiedlichen Expressionsniveaus von Genen, die an der Vermittlung der scBAT-Funktion beteiligt sind, einschließlich Pparg, dem Hauptregulator der BAT-Entwicklung; Fabp4 und Glut4, zwei Nährstofftransporter; und Ucp1 und Ppargc1a, zwei Gene, die an der Thermogenese beteiligt sind, können leicht bestimmt werden. Zum Vergleich wurde RNA aus isoliertem iBAT extrahiert und die Expression der oben aufgeführten Gene ebenfalls mit den bereitgestellten Verfahren bewertet (Abbildung 3A). Die Expressionsniveaus dieser Gene sind zwischen diesen beiden Depots relativ ähnlich. (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg"> Abbildung 1: Anatomische Lage von scBAT und Prozess seiner Dissektion. (A) Lage von scBAT in der Zwischenschicht des Halses. (B) Die oberflächliche Schicht des Halses vor und nach der Hautentfernung. Maßstabsleiste = 250 μm. Gepunktete gelbe Linien umreißen den Bereich, der nach dem U-förmigen Schnitt freigelegt werden sollte. (C) Bild eines Mauskadavers, der unter einem Präpariermikroskop platziert wurde, um die visuelle Klarheit während der Sektion zu erhöhen. (D,E) Repräsentative Bilder der Zwischenschicht des Halses vor und nach der scBAT-Entnahme von Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten. Maßstabsleiste = 250 μm. Gepunktete gelbe Linien umreißen exponierte bilaterale scBAT-Depots; n = 2. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; SFI = oberflächliche Schicht; sg = Speicheldrüse; tr = Luftröhre; JV = Vena jugularis externa; SM = Skelettmuskel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg"> Abbildung 2: Verarbeitung von scBAT für die H&amp;E-Färbung. (A) Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte der scBAT-Verarbeitung für die H&amp;E-Färbung veranschaulicht. Nach dem Präparieren des Gewebes wird es nacheinander fixiert, dehydriert, eingebettet, geschnitten und gefärbt. (B) Repräsentative Bilder von H&amp;E-gefärbten scBAT von Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten; n = 3 für jedes Entwicklungsstadium; Maßstabsleiste = 250 μm für Bilder mit geringerer Vergrößerung; Maßstabsleiste = 50 μm für Bilder mit höherer Vergrößerung. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; PFA = Paraformaldehyd; H&amp;E = Hämatoxylin und Eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg"> Abbildung 3: Vorbereitung der RNA aus scBAT für die Genexpressionsanalyse. (A) Flussdiagramm, das die Stadien der RNA-Isolierung und der RT-qPCR-Analyse der scBAT-Genexpression veranschaulicht. Aufgrund seiner geringen Größe und weichen Textur ist das Einfrieren des scBAT-Depots und das Mahlen in flüssigem Stickstoff entscheidend für eine erfolgreiche RNA-Isolierung. (B) Relative Expression von Markergenen, einschließlich Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 und Ppargc1a, in scBAT und iBAT, isoliert aus männlichen Mäusen im Alter von 3 Monaten, n = 5. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. 36B4 wurde als Haushaltsgen zur Normalisierung verwendet. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; RT-qPCR = reverse Transkriptions-quantitative PCR; LN2 = flüssiger Stickstoff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir das chirurgische Verfahren zur Isolierung des subkutanen weißen Fettgewebes und des interscapularen braunen Fettgewebes einer neugeborenen Maus.

Entnahme von weißem und braunem Fettdepot von Mäusewelpen: Ein chirurgischer Eingriff zur Entnahme von weißem Fettgewebe und braunem Fettgewebe von Mäusewelpen

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Adipozyten gibt es in diskreten Depots und haben unterschiedliche Rollen in ihren einzigartigen Mikroumgebungen. Da regionale Unterschiede in Adipozytencharakter und Funktion aufgedeckt werden, ist eine standardisierte Identifizierung und Isolierung von Depots entscheidend für die Weiterentwicklung des Feldes. Hierin stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Exzision verschiedener Mausfettdepots vor.

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

Visualisierung und Quantifizierung von braunem und beigem Fettgewebe in Mäusen mittels [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Erfahren Sie die Präzisionsdissektion von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe unter dem Mikroskop zur Verbesserung der RNA-Ausbeute und histologischen Analyse. Diese Methode ermöglicht effiziente Genexpressionsstudien.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

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