Name: Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Lernen Sie die Blutstillung von Punktionswunden zur Analyse der Thrombenbildung mit Volumen-Elektronenmikroskopie in Mäusen. Diese Methode ermöglicht strukturelle Einblicke in die Hämostase.

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<meta charset="utf8"></head><body>Punktionswunden-Hämostase und montierte Elektronenmikroskopie

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,9% Normale Kochsalzlösung</td><td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint Kopfhautvenen-Set</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint Injektionsnadeln</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint Spezial-Injektionsnadeln</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konische Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Vorbereitungspads (70% Isopropylalkohol)</td><td>Medline</td><td>MDS090670Z</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte für Tiere</td><td>Physitemp Instruments</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 Color R2 Mikroskopiekamera</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Spritzen, 20 mL</td><td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen 35 mm x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Applikatoren mit Baumwollspitze</td><td>Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 Aktivator</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl Bernsteinsäureanhydrid / DDSA</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Verbandzange, 5", gebogen, gezackt, schmale Spitze</td><td>Integra Miltex</td><td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>Verbandzange, 5", Standard, gezahnt</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 Resin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, wasserfrei 200 proof</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4-Wege-Rohrgestell</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Einzelspritze Infusionspumpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>7801001</td><td></td></tr><tr><td>Mullschwämme 2" x 2" - 4-lagige</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (10% Lösung)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Flüssiges Inhalationsmittel Anästhesie, 100 mL</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler-Style Micro-Fine Pinzette, Typ 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td><td>Benötigt 2 Paar.</td></tr><tr><td>L/S Pumpenschlauch, Silikon, L/S 15; 25 Ft</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Blei Nitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>Malachitgrün 4</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>18100</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II Pumpenkopf</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digitalantrieb mit variabler Drehzahl</td><td>VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" Drahtschneider</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 4 % wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16 % Lösung)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp Temperaturregler</td><td>Physitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid, ACS Reagenz</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 20401</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glasbecher</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Rektale Temperatursonde für Mäuse</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"</td><td>3M Unternehmen</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat-Puffer 0,2 m, pH 7,4</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Elektronischer Verdampfer mit niedrigem Durchfluss</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Starter Kit für Mäuse</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Minutien Pins</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop steREO Discovery.V12</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Silikonmatte</td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazid (TCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat-Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Feder-Mikroschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Von Graefe Augenverbandzange, 2,75", gebogen, gezahnt</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818</td><td>Benötigen Sie 2 Paar.</td></tr><tr><td>Wagner Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura Tiertrimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite Software</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

blutstillung von punktionswunden und vorbereitung von proben für die montage der großflächigen elektronenmikroskopischen analyse

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Quantifizierung der Arzneimittelwirkungen auf die Blutungszeit von Stichwunden Die Blutungszeiten von Stichwunden liefern ein physiologisches Modell eines Arzneimittelrisikos, das bei Mäusen leicht durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse, die sich aus einem Experiment mit Punktionswunden ergeben, sind prädiktiv. Hier zeigen wir eine Dosis-Wirkungs-Blutungskurve von Dabigatran. Dabigatran, ein Thrombinhemmer, wird als orales direkt wirkendes Antikoagulans, ein sogenanntes DOAC12, eingesetzt. Das Modell der Jugularvenenpunktionswunde wurde verwendet, um das Risiko zu bewerten, das mit verschiedenen Dosen von Dabigatran verbunden ist, durch möglicherweise anhaltende Blutungen durch verzögerte Thrombusbildung bei Mäusen. Eine variierende Dosierung von 15, 50 oder 150 μg/kg Dabigatran wurde 20 min vor der Jugularvenenpunktion intravenös (i.v.) verabreicht. Wir zeigen die Mittelwerte der Blutungszeit bei verschiedenen Konzentrationen von Dabigatran (Abbildung 4). Bei der Dosierung wird eine signifikante Verlängerung der Blutungszeit beobachtet, p &lt;0,051. Dies deutet auf einen signifikanten Risikofaktor bei der Anwendung des Arzneimittels beim Menschen hin. Experimentell hat das Medikament in diesen Dosen einen signifikanten Einfluss auf die Ultrastruktur des sich bildenden Thrombus.
Beurteilung des Thrombozytenaktivierungszustands in einem Thrombus einer sich bildenden Punktionswunde Der WA-TEM-Ansatz bietet sowohl einen Überblick über einen Wundbereich in einer einzigen Ebene bei geringerer Vergrößerung als auch viele Details bei höherer Vergrößerung (Abbildung 5). Die gewonnenen Details können direkt in den Kontext der Übersicht gestellt werden. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um die Rekrutierung von scheibenförmigen Blutplättchen an einen sich bildenden Thrombus der Punktionswunde zu beurteilen. Zirkulierende Blutplättchen sind diskoid, daher der Name, und enthalten einen vollständigen Satz sekretorischer Granulate. Eine Schlüsselfrage war, wie zirkulierende Blutplättchen für den wachsenden Thrombus rekrutiert werden können, ohne die frei fließenden Eigenschaften der verbleibenden Blutplättchen zu stören. Unsere Arbeit deutet auf eine Tether and Activate-Hypothese hin, bei der zirkulierende Blutplättchen nacheinander durch einen Tethering-Prozess als diskoide Blutplättchen, die einen vollständigen Satz von Organellen enthalten, an den Thrombus rekrutiertwerden 2. Der Beweis dafür stammt aus der WA-TEM von Jugularvenenthromben 1 min nach der Punktion. Nach dem Schnitt, um volle Thrombusschnitte aus der Mitte der noch blutenden Wunde zu erhalten, bildeten wir 500-800 Frames mit einer Pixelgröße von 4.000 x 4.000 Pixeln und einer Pixelgröße von 3,185 nm in einem rechteckigen XY-Rastergitter über die gesamte Dimension des Thrombus im Querschnitt unter Verwendung eines automatisierten Tisches und eines Transmissionselektronenmikroskops unter Verwendung der SerialEM-Software10 ab. Die Rahmen wurden dann mit der eTomo-Software, die Teil der IMOD-Programmsuite11 ist, zusammengefügt. Das Ergebnis ist ein einzelnes Bild unterschiedlicher Größe, z. B. 120.000 x 90.000 Pixel, das mit der 3DMOD-Software, die wiederum Teil der IMOD-Programmsuite ist, bei niedrigem Zoom von 0,02 oder bei höheren Zooms von 0,25 bis 1,0 im Detailbildmodus angezeigt wird (Abbildung 5). In net ergab die softwaregestützte Analyse, dass peripher gebundene, thrombusassoziierte diskoide Blutplättchen innerhalb des Einstichlochs als Kügelchen auf einer Schnur voneinander entfernt waren. In einem kurzen Abstand innerhalb des Thrombus war die scheibenförmige Form weniger ausgeprägt und die Blutplättchen waren enger miteinander verbunden. Tiefer im Thrombus waren die Blutplättchen gerundet, dicht gepackt und teilweise degranuliert. Eine Sequenz der Morphologie deutete darauf hin, dass die anfängliche Bindung der Blutplättchen an den Thrombus durch ein langes Bindemolekül, wahrscheinlich den von-Willebrand-Faktor, und dass alle weiteren Schritte der Thrombozytenaktivierung auf das Innere des sich bildenden Thrombus beschränkt waren. Daher konnte die Thrombozytenrekrutierung zum Thrombus erfolgen, ohne die Blutzirkulation in der Halsvene zu stören.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> Abbildung 1: Chirurgischer Aufbau zur Durchführung eines Thrombus-Experiments an der Halsvene/Oberschenkelarterien. Chirurgische Geräte (A) und Instrumente (B) sind sorgfältig angeordnet, um eine effiziente Bewegung zu gewährleisten, da das Timing während des Experiments entscheidend ist. (C) Nach der Perfusionsfixierung wird der Teil des Gefäßes, der den Thrombus der Punktionswunde enthält, unter dem Lichtmikroskop auf eine Silikonmatte in einer 35-mm-Kulturschale gedrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> Abbildung 2: Übergang von einem Blutgefäß zu in Kunststoff eingebetteten Proben, die entweder für WA-TEM oder SBF-REM geschnitten werden. (A) Dargestellt ist eine Oberschenkelarterie mit einer Punktionswunde und einer sich ansammelnden extravaskulären Thrombusbildung (Kreis und Pfeil). (B) Ein Thrombus (Kreis und Pfeil) ist in Kunststoff eingebettet, um ihn für WA-TEM zu schneiden, mit einem Mikrotom für die anschließende 2D-Bildgebung. (C) Ein Thrombus (Kreis und Pfeil) ist in Kunststoff eingebettet und so getrimmt, dass ein kurzer Stab von weniger als 1 mm entsteht, der an einem Stift in einer SBF-REM-Bildgebungskammer befestigt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> Abbildung 3: Stichwunde bis Thrombusbildung: Ein Schema des präparativen Flusses von einer Punktionswunde (A) zu einem Bildschnitt eines Thrombus der Jugularvene 1 min nach der Punktion (B). Die Gefäßwand ist auf dem Bildausschnitt blau beschriftet, die kleinen schwarzen Punkte in der Nähe der Gefäßwand sind rote Blutkörperchen und die Thrombus-Thrombozytenaggregate erscheinen als dunkelgraue Bereiche. Diese Zahl wurde von1 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> Abbildung 4: Ein Beispiel für Daten in grafischer Form, die in einem Experiment mit einer Halsvenenpunktionswunde generiert wurden. Eine Dosis-Wirkungs-Blutungskurve von Dabigatran ist dargestellt. Diese Zahl wurde von1 geändert. Die Mittelwerte der Blutungszeit bei verschiedenen Konzentrationen von Dabigatran werden zusammen mit Fehlerbalken angezeigt, die eine Plus- oder Minus-Standardabweichung anzeigen. Die statistische Analyse mit dem t-Test der Studierenden ergab einen p-Wert von &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> Abbildung 5: WA-TEM-Bilder eines Schnitts, der zu einer Montage zusammengefügt wurde. (A) Einzelne hochauflösende Frames werden gesammelt und dann zusammengefügt, um Features in einen größeren Kontext zu stellen. (B) Durch Hochzoomen können wichtige Details im Kontext hervorgehoben werden (Poly: polymorphkernige Leukozyten, Endo: Endothel und Col: Kollagenfasern). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Forschung

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Medicine

Medizin

Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Cryo Elektronenmikroskope, entweder Scanning (SEM) oder Transmission (TEM), werden häufig für die Charakterisierung von biologischen Proben oder anderen Materialien mit einem hohen Wassergehalt 1 verwendet wird. Eine SEM / Focused Ion Beam (FIB) wird verwendet, um Merkmale von Interesse in Proben zu identifizieren und extrahieren eine dünne, elektronentransparenten Lamellen für die Übertragung auf eine Kryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Hier ist eine Methode zur Visualisierung der extrazellulären Matrix-Ultrastruktur in dezellularisiertem Herzgewebe dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Instrument und Verfahren zur Herstellung von Nanoliter große Probenvolumina für Transmissions-Elektronenmikroskopie wird vorgestellt. Papier-Blot-Schritte sind nicht erforderlich, wodurch die nachteiligen Folgen, die dies für Proteine, deutlich reduziert Probenverlust und ermöglicht die Analyse der einzelnen Zelle lysate für visuelle Proteomics haben kann.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Induzieren von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und verfolgen Denkwunden in Echtzeit. Zusätzlich werden Methoden zur Herstellung von Geweben für histologische, immunhistochemische und molekulare Analysen des Wundbettes bereitgestellt.

Durchführen von colonoscopic-Guided Pinch Biopsien bei Mäusen und Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen

Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.

Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor.  Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.

Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

Lernen Sie die Blutstillung von Punktionswunden zur Analyse der Thrombenbildung mit Volumen-Elektronenmikroskopie in Mäusen. Diese Methode ermöglicht strukturelle Einblicke in die Hämostase.

Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse (Video) | JoVE Journal

Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

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