Name: Wundmodelle von Mäusen und Herstellung von Einzelzellsuspensionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 3 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Mäusehaut und die Erstellung eines stabilen Wundmodells zur Untersuchung der Wundheilung auf Einzelzellebene. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zellulärer Dynamiken.

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Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China finanziert (#82373494).

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des siebten medizinischen Zentrums des chinesischen PLA General Hospital, China, genehmigt. Es wurden männliche C57/BL6-Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet. 
1. Modell zur Heilung von Mauswunden
<ol>
	<li>Gruppierung von Tieren
	<ol>
		<li>Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip Versuchs- und Kontrollgruppen (jeweils 6) zu. Unterbringen Sie Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Tiereinrichtung mit einer Temperatur von 23-25 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 50 % bis 60 % und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.</li>
		<li>Bieten Sie Mäusen uneingeschränkten Zugang zu Standardfutter und autoklaviertem Leitungswasser.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Präoperative Vorbereitung
	<ol>
		<li>Halten Sie die Maus vorsichtig mit einem Rückhaltesystem fest oder halten Sie die Maus sicher in Bauchlage. Füllen Sie die Spritze mit 1 % Pentobarbital-Natrium, das auf Raumtemperatur wiederhergestellt wurde, und verabreichen Sie es in einer Dosis von 0,1 ml/20 g Körpergewicht. 
		HINWEIS: Die 1%ige Pentobarbital-Natriumlösung sollte in einer dunklen Umgebung bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>Reinigen Sie den Bauch der Maus mit Alkohol-Wattestäbchen. Führen Sie die Spritze in einem leichten Winkel in den Bauch ein. Vor der Injektion aspirieren, um eine versehentliche Verabreichung in die Blase oder den Darm zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten.</li>
		<li>Nachdem die Maus aufhört zu zucken und nicht mehr auf Reize reagiert, tragen Sie weißes Vaseline auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Verwenden Sie einen Rasierer, um längeres Rückenfell zu kürzen.</li>
		<li>Tragen Sie Enthaarungscreme auf den Rücken auf, warten Sie 2 Minuten und wischen Sie sie vorsichtig mit feuchter Gaze ab, um die Haut der Maus nicht zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass die Enthaarungscreme nicht über einen längeren Zeitraum einwirkt.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die umliegende Haut sanft mit drei abwechselnden Tupfern Betadin und 70% Alkohol.</li>
		<li>Autoklavieren Sie Hautbiopsienstanze, Scheren, Pinzetten und andere Instrumente für die Sterilisation. Pflegen Sie einen sterilen Arbeitsbereich. Führen Sie die anschließende Operation mit einem frischen OP-Tuch durch.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exzision der Haut in voller Dicke 
	HINWEIS: Das Wundschienenmodell wurde verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung für die Wundheilung zu beurteilen.
	<ol>
		<li>Markieren Sie mit einem Permanentmarker den oberen mittleren Bereich des Rückenbereichs der Maus mit einem Kreis von 8 mm Durchmesser.</li>
		<li>Heben Sie die Rückenhaut mit einer sauberen Pinzette an und machen Sie den ersten Schnitt mit einer feinen chirurgischen Schere. Halten Sie nach dem ersten Schnitt die teilweise entfernte Hautpartie mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die markierten Kreise vorsichtig aus.</li>
		<li>Verwenden Sie einen speziell angefertigten Edelstahlring (Innendurchmesser 15 mm, Außendurchmesser 18 mm). Den Metallring mit 5-0 nicht resorbierbaren Nähten an die Peripherie der Inzisionsstelle nähen, um eine Kontraktion der Haut an der Inzisionsstelle zu verhindern (Abbildung 1A). Verwenden Sie Edelstahl als Ringmaterial, um Rost und Verformung zu vermeiden.</li>
		<li>Verabreichen Sie eine einzelne subkutane Injektion von 0,1 ml mit 10 % Buprenorphinhydrochlorid-Verdünnung in der Nähe der Wunde, um postoperative Schmerzen zu behandeln.</li>
		<li>Führen Sie die Maus wieder ein, um einzelne Käfige zu reinigen. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bevor die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.</li>
		<li>Beobachten und fotografieren Sie die Mauswunde alle 2 Tage, um die Wundgröße nach der Anästhesie, wie in Schritt 1.2 beschrieben, zu messen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wundstempelmarkierung zur Gewinnung von Biopsiegewebe
	<ol>
		<li>Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, wie in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben.</li>
		<li>Erstellen Sie benutzerdefinierte Markierungsstempel für Mauswunden mit einem Kreisdurchmesser von 8 mm und einer quadratischen Seitenlänge von 10 mm (Abbildung 1B).</li>
		<li>Positionieren Sie die Maus in Bauchlage und desinfizieren Sie die Rückenhaut mit alkoholischen Wattestäbchen. Tauchen Sie den Stempel in Tinte. Markieren Sie den oberen mittleren Teil des Rückens der Maus mit dem Stempel.</li>
		<li>Schneiden Sie vorsichtig die gesamte Hautschicht des Rückens entlang der kreisförmigen Markierung mit einer chirurgischen Schere heraus und legen Sie die Muskelschicht vollständig frei. Lassen Sie die Wunde ohne Verband offen, um den Zustand der Wunde nicht zu beeinträchtigen. Halten Sie die Sterilität der Wunde aufrecht, indem Sie die Maus in eine saubere und desinfizierte Umgebung bringen und die Wunde auf natürliche Weise einen Schorf bilden lassen.</li>
		<li>Verabreichen Sie eine einzelne subkutane Injektion von 0,1 ml mit 10 % Buprenorphinhydrochlorid-Verdünnung in der Nähe der Wunde, um postoperative Schmerzen zu behandeln.</li>
		<li>Führen Sie die Maus wieder ein, um einzelne Käfige zu reinigen. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bevor die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.</li>
		<li>Beobachten und fotografieren Sie die Mauswunde alle 2 Tage, um die Wundgröße nach der Anästhesie, wie in Schritt 1.2 beschrieben, zu messen.</li>
		<li>Die Behandlung wird wie in 1.4 beschrieben durchgeführt</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Verabreichung der Behandlung
	<ol>
		<li>4 Stunden, nachdem die Maus das Bewusstsein wiedererlangt hat, führen Sie eine Anästhesie durch, wie in den Schritten 1.2.2-1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Subkutan injizieren Sie die gewünschte Behandlung, hier 100 μg mesenchymales Stammzell-Exosom (hucMSC-Exo) des menschlichen Nabelschnurnabelschnurs, gelöst in 200 μl PBS um die Inzisionsstelle für die Behandlungsgruppe.</li>
		<li>Injizieren Sie subkutan 200 μl PBS um die Inzisionsstelle für die Kontrollgruppe.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2 und 1.5.3 alle zwei Tage für bis zu 14 Tage. Untersuchen Sie die Injektionsstelle auf Schwellungen, Rötungen oder Anzeichen einer Infektion.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Vorbereitung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung
<ol>
	<li>Gewebeentnahme und -aufbereitung
	<ol>
		<li>Führen Sie die Anästhesie wie in den Schritten 1.2.2-1.2.3 beschrieben durch.</li>
		<li>Heben Sie die Rückenhaut mit einer sauberen Pinzette an und entfernen Sie den Schorf. Schneiden Sie etwa 2 cm2 der Haut in der Nähe der Wunde ab und schneiden Sie Fettgewebe und große Blutgefäße ab.</li>
		<li>Übertragen Sie die Hautbiopsie mit einer sterilen Pinzette in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit vorgekühlten 4 mL PBS gefüllt ist.</li>
		<li>Waschen Sie mit PBS, indem Sie die Biopsie nacheinander in neue Vertiefungen (6-Well-Platte) übertragen, die mit 4 ml PBS gefüllt sind, bis kein sichtbares Blut mehr vorhanden ist.</li>
		<li>Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell in ca. 2 mm große Stücke, waschen Sie sie weiter in DPBS mit 0,04 % BSA und entfernen Sie alle Ablagerungen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enzymatische Dissoziation (Abbildung 2)
	<ol>
		<li>Kombinieren Sie 1 ml Kollagenase I (10 mg/ml), 1 ml Kollagenase IV (5 mg/ml), 1 ml Kollagenase D + Dispase II (15 mg/ml), 1 ml DNase I (5 mg/ml) und 6 ml DPBS in einem sterilen konischen Röhrchen, um die Aufschlusslösung herzustellen. Mischen Sie die Komponenten gründlich, um die Homogenität zu gewährleisten.</li>
		<li>Stellen Sie das konische Rohr für 10 Minuten in ein auf 37 °C eingestelltes Wasserbad, um die Aufschlusslösung vorzuwärmen.</li>
		<li>Geben Sie 2,5 ml Aufschlusslösung in das Gewebe und verdauen Sie es 70 Minuten lang bei 37 °C, wobei Sie das Reagenzglas alle 10 Minuten wenden, um es gründlich zu mischen.</li>
		<li>Ein 70 μm Sieb mit Waschpuffer (0,2 % BSA in PBS) vorbefeuchten. Übertragen Sie das Reaktionsgemisch, einschließlich dissoziierter Zellen und restlicher Gewebefragmente, mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung auf das Sieb.</li>
		<li>Filtrieren Sie diese Mischung durch das vorfeuchte 70-μm-Zellsieb in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch mit verdautem Gewebe bei 300 x g, Raumtemperatur für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet (die Zellen) für den nächsten Dissoziationsschritt aufbewahren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lyse der roten Blutkörperchen
	<ol>
		<li>Verdünnen Sie die Lyselösung für rote Blutkörperchen (10x) im Verhältnis 1:10 mit doppelt destilliertem Wasser. Verdünnen Sie die Zellen mit 1x Erythrozyten-Lyselösung im Verhältnis 1:10 in einem konischen Röhrchen.</li>
		<li>Die Mischung 5 s lang vortexen, 2 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Den Überstand aspirieren, die Zellen in DPBS gleichen Volumens resuspendieren und auf Eis lagern.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Filtrierung
	<ol>
		<li>Entnehmen Sie die Zellsuspension und filtrieren Sie sie durch ein 40-μm-Sieb in ein neues konisches Röhrchen.</li>
		<li>Spülen Sie das Röhrchen 2x mit 4,5 mL RPMI (10 % FCS), um die Entnahme aller verbleibenden Zellen sicherzustellen.</li>
		<li>Fahren Sie fort, die Zellsuspension bei 300 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten lang zu zentrifugieren.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, schnippen Sie vorsichtig mit dem Pellet und resuspendieren Sie die Zellen mit breiten Spitzen in 50 μl 0,04 % BSA PBS. Halten Sie die Zellen während dieses Prozesses auf Eis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Entfernung abgestorbener Zellen
	<ol>
		<li>Mischen Sie das Totzellenentfernungskit 20x Stammpuffer mit nukleasefreiem Wasser im Verhältnis 1:20, um einen 1x Bindungspuffer zu erhalten.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 μl Mikrokügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen für 60 mg Hautprobe hinzu.</li>
		<li>15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie Stammpuffer hinzu, bis er 500 μl erreicht. Laden Sie die Probe in die vorbereitete Säule des Kits und befestigen Sie sie am Dissoziator.</li>
		<li>Führen Sie das Dissoziatorprogramm aus, um lebende Zellen zu trennen. Nach Beendigung des Programms wird die Suspension durch einen 30-μm-Filter filtriert und mit gleichem Volumen D-PBS. 
		HINWEIS: Wenn sich die Tropfgeschwindigkeit merklich verlangsamt, tauschen Sie die Säule sofort aus, um zu verhindern, dass Verunreinigungen die Poren verstopfen und die Zellregeneration beeinträchtigen.</li>
		<li>Führen Sie die Färbung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) und die Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler durch. Verwenden Sie die folgenden Akzeptanzkriterien: Zellviabilität ≥ 85 %, Zellaggregationsrate < 20 % und keine sichtbaren roten Blutkörperchen oder Zellfragmente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissoziationsverfahren für das Multigewebe-Dissoziationskit (Alternative)
	<ol>
		<li>Mischen Sie 2,5 ml RPMI 1640, 100 μl Enzym D, 50 μl Enzym R und 12,5 μl Enzym A1 in ein schonendes MACS C-Röhrchen (Komponenten aus dem Multi Tissue Dissociation Kit).</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe in das sanfte MACS C-Röhrchen mit dem Enzymmix und verschließen Sie es fest.</li>
		<li>Legen Sie das Röhrchen bei 37 °C für 90 Minuten in ein Wasserbad mit sanfter Inversion alle 10 Minuten, um eine ausreichende Exposition des Gewebes mit der Dissoziationslösung zu gewährleisten.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Dissoziationslösung und waschen Sie das Taschentuch mit DPBS.</li>
		<li>Einzelzellsuspensionen nacheinander durch 70 μm und 40 μm Zellsiebe passieren und 10 min bei 4 ΰC bei 300 x g zentrifugieren.</li>
		<li>Lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit dem Reagenz für die Lyse roter Blutkörperchen nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.3.</li>
		<li>Entfernen Sie tote Zellen mit dem Kit zur Entfernung toter Zellen nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.58.</li>
		<li>Führen Sie AO/PI-Färbung und Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler durch. Verwenden Sie die folgenden Akzeptanzkriterien: Zellviabilität ≥ 85 %, Zellaggregationsrate < 20 % und keine sichtbaren roten Blutkörperchen oder Zellfragmente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Protocol for Mouse Wound Healing Model with Stem Cell-Derived Exosomes

<ol><li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Wu, J., Landén, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+skin+wound+healing+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigation of skin wound healing using a mouse model.</a> Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265(2013).</li>
<li>Ganguli-Indra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cutaneous+wound+healing+assay+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model.</a> Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+differentiation+and+characterization+of+vascular+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).</li>
<li>Dead cell removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline">https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline</a> (2015).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+wound+closure+in+mice+using+skin-punch+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).</li>
<li>Gao, C., Zhang, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+two+single-cell+sequencing+platforms%3A+Bd+rhapsody+and+10x+genomics+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium.</a> Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Mehrere entscheidende Schritte waren für den Erfolg des Protokolls unerlässlich. Zu diesen Schritten gehörten die präzise Vorbereitung des Wundbereichs durch gründliches Rasieren und Reinigen, das Anlegen standardisierter Wunden bestimmter Größe und Tiefe sowie die sorgfältige Nachsorge nach der Wunde, um Infektionen zu überwachen und geeignete Behandlungen durchzuführen. Die Standardisierung dieser Verfahren gewährleistete die Konsistenz unter allen experimentellen Bedingungen und erhöhte dadurch die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse10.
Wir haben die Wundstempelmarkierung für die Sequenzierung verwendet, da andere Methoden zusätzliche Variablen wie den Wundkratzer der Maus und den Nahtrisseinführen 2,5. Das Stempelmodell verbessert die anfängliche Konsistenz von Wunden bei Mäusen und bietet einen standardisierten Maßstab für die Beurteilung der Wundheilung, wodurch potenzielle Ungenauigkeiten bei der Schätzung der Wundheilungsrate in Mausmodellen reduziert werden. Darüber hinaus erleichtert die Stempelmarke die Verwendung von Software wie ImageJ. Da jedoch kein Verband verwendet wird, um die Wunde abzudecken, stellt das Prägeverfahren viel höhere Anforderungen an die Desinfektion der Umwelt. Das Experiment muss wiederholt werden, wenn eine Infektion auftritt.
Die biologische Variabilität zwischen einzelnen Mäusen kann zu Variabilität in die experimentellen Ergebnisse führen, was größere Stichprobengrößen für robuste statistische Analysen erfordert. Dieses Modell kann auf andere Sequenzierungstechniken, wie z. B. die räumliche Sequenzierung, erweitert werden, um seinen Nutzen weiter zu verbessern.
Die Optimierung der Bedingungen für die scRNA-Seq-Dissoziation und die Auswahl geeigneter Dissoziationsmethoden sind wichtige Schritte im experimentellen Arbeitsablauf. Zu den derzeit häufig verwendeten Methoden gehört der enzymatische Aufschluss in Verbindung mit dem empfohlenen 10x-Genomik-Reagenzien-basierten Ansatz11. Bemerkenswert ist, dass der enzymatische Aufschluss wesentlich kostengünstiger ist als die reagenzienbasierte Methode; Es sind jedoch mehrere präexperimentelle Iterationen erforderlich, um die Enzymauswahl und die Verdauungsdauer zu optimieren.
In dieser Studie wurden Vorversuche mit verschiedenen Enzymkombinationen durchgeführt. Die ausgewählte Methode erfüllte die grundlegenden Anforderungen für die nachgelagerte Qualitätskontrolle, obwohl ein 10-fach-Genomik-Reagenzienkit fehlte, das speziell für die Hautdissoziation von Mäusen in voller Dicke entwickelt wurde. Stattdessen wurde das Multigewebe-Dissoziationskit 1 verwendet, um hochwertige Einzelzellsuspensionen zu erhalten. Es ist jedoch wichtig, die relativ hohen Kosten zu beachten, die mit dieser Methode verbunden sind, obwohl sie im Vergleich zu hauseigenen Enzymaufschlusstechniken eine überlegene Stabilität bietet. Für wertvolle Proben wird die Verwendung der 10x genomics Reagenzien-basierten Dissoziationsmethode empfohlen.
Es ist von entscheidender Bedeutung, den potenziellen Einfluss interindividueller Variabilität auf die Zellviabilität zu berücksichtigen, da dies dazu führen kann, dass einige Proben die erforderlichen Kriterien nicht erfüllen und dadurch die nachgelagerte Datenqualität beeinträchtigen12.
Positiv zu vermerken ist, dass diese Methode Möglichkeiten zur Integration mit räumlicher Transkriptomik oder anderen Multi-Omics-Ansätzen bietet und somit einen umfassenderen analytischen Rahmen bietet13. Darüber hinaus unterstreichen die potenziellen klinischen Anwendungen seine Vielseitigkeit und Relevanz über die Grundlagenforschung hinaus.

Die Maus ist ein weithin anerkanntes Tiermodell in der Forschung wegen ihrer hochgradig homologen genetischen Sequenz zum Menschen, der schnellen Fortpflanzung, der Kosteneffizienz und der überschaubaren Größe1. Allerdings gibt es Unterschiede in der Hautstruktur zwischen Mäusen und Menschen. Mäuse haben eine ausgeprägte Hautmembranschicht, die zur Hautkontraktion beiträgt und eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung bei dieser Spezies spielt. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Wundheilung beim Menschen in erster Linie die Reepithelisierung und die Bildung von Granulationsgewebe1.
Trotz dieser Unterschiede in der Hautstruktur zwischen den Spezies bleibt das Mausmodell die bevorzugte Wahl in der Wundheilungsforschung und behält im Vergleich zu anderen Tiermodellen eine signifikante Bedeutung2,3. Bei der Verwendung von Maushaut zur Nachahmung menschlicher Wundheilungsprozesse ist eine sorgfältige Abwägung verschiedener Einflussfaktoren unerlässlich. Zu diesen Faktoren gehören die Auswahl geeigneter Stellen für chirurgische Eingriffe, die Berücksichtigung des Follikelzyklus der Maushaare und das Verständnis der Auswirkungen der Hautmembrankontraktion4,5. Die Implementierung entsprechender Maßnahmen ist von entscheidender Bedeutung, um die Versuchsbedingungen zu optimieren und die Genauigkeit der Beobachtungsergebnisse zu verbessern.
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) sequenziert Zellen auf einem viel feineren Niveau als die herkömmliche RNA-Sequenzierung und stellt eine viel höhere Anforderung an die Probenqualität mit minimalen Unterschieden innerhalb der Gruppe. Es wurden mehrere Experimente durchgeführt, um ein stabiles Mausmodell für akute Hautdefekte in voller Dicke zu verfeinern. Diese Experimente nutzten eine Kombination aus etablierten Methoden aus der Literatur und innovativen Ansätzen, um die Wundheilung umfassend zu bewerten2,5. Um das Wundheilungsmodell zu entwickeln, wurde die Exzision der Haut von Mäusen in voller Dicke verwendet, um den physiologischen Prozess der Wundheilung und -regeneration zu replizieren. Ziel war es, die potenziellen Veränderungen zu bewerten, die durch verschiedene Behandlungen mit scRNA-seq induziert werden. Die Dissoziation von Hautgewebe bei Mäusen stellt bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen eine Herausforderung dar, einschließlich geringer Zellviabilität und hoher Aggregationsraten6. Diese Schwierigkeiten können zu Problemen wie Verstopfungen des Geräts und anomaler Zellenerfassung führen, die die Datenqualität beeinträchtigen können. Angesichts der erheblichen Kosten der Einzelzellsequenzierung ist die Durchführung mehrerer Vorversuche von entscheidender Bedeutung, um die Stabilität und Zuverlässigkeit der Einzelzellsuspension zu gewährleisten. In dieser Studie wurde die Wirksamkeit der Dissoziation gemischter Enzyme und der Dissoziationsmethode des Gewebekits untersucht, um den optimalen Ansatz für die Dissoziation des Gewebes zu identifizieren6,7. Diese Studie schafft eine solide Grundlage für weitere vertiefende Untersuchungen.

<table><tbody><tr><td>75% Alcolchol</td><td>Liuhe</td><td>JIUJING500ML</td><td></td></tr><tr><td>C57/BL6J Mäuse</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D + Dispase II</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Roche</td><td>5349907103</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Roche</td><td>5267439001</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Haishi</td><td>MIANQIAN</td><td></td></tr><tr><td>Kit zur Entfernung toter Zellen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>gentleMAC Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Medizinischer Nylonfaden</td><td>Jinlong</td><td>HM507</td><td></td></tr><tr><td>Multigewebe-Dissoziationskit 1</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-201</td><td></td></tr><tr><td>Stanze Biopsienadel</td><td>Integra Miltex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Jinglu</td><td>JIANDAO</td><td></td></tr><tr><td>Weißes Vaseline</td><td>Shangyuan</td><td>BAIFANSHILIN</td><td></td></tr></tbody></table>

maus-wundmodelle und herstellung von einzelzellsuspensionen

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

Die Behandlung von akuten Hautverletzungen in voller Dicke stellt in der klinischen Praxis eine erhebliche Herausforderung dar. Die Komplexität der Wundheilung, an der verschiedene Zellpopulationen und die komplizierte Wundmikroumgebung beteiligt sind, erschwert die Bewertung von Behandlungseffekten und deren Wechselwirkungen mit herkömmlichen experimentellen Ansätzen. Die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierungstechnologie hat das Verständnis der zellulären Funktionen und Mechanismen während der Wundheilung revolutioniert. Die Variabilität der Methoden zur Erstellung von Mauswundmodellen führt jedoch zu Störfaktoren, die sich auf die experimentellen Ergebnisse auswirken können. Darüber hinaus stellt der Prozess der Dissoziation von Maushautgewebe erhebliche technische Hürden dar, was den dringenden Bedarf an hochwertigen Einzelzellsuspensionen für eine genaue Transkriptomsequenzierung unterstreicht. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Konstruktion von Mauswundmodellen zu optimieren, um Veränderungen des Wundverschlusses genau zu beurteilen und gleichzeitig Variablen zu eliminieren, die das nachfolgende Sequenzierungsergebnis beeinflussen könnten. Darüber hinaus wurde die Herstellung von Einzelzellsuspensionen sowohl unter Verwendung von Enzymvorbereitungsprotokollen als auch von Testkit-Protokollen durchgeführt, um Kosten und Wirksamkeit zu optimieren.

Es wurden mehrere Variationen des Verfahrens untersucht. Stanzprotokolle wurden bevorzugt, da sie die Wundheilung nur minimal beeinträchtigen und die Wundintegrität gegenüber Störungen wie Kratzen und Nähten bewahren. Dies dient dazu, Störgrößen auf Einzelzell-Ebene bei der nachfolgenden Sequenzierung zu vermeiden. Die Anlage von Wunden auf beiden Seiten einer Maus führte aufgrund der inhärenten Elastizität der Mäusehaut zu erkennbaren Unterschieden in der Wundfläche (Abbildung 3A,B). Bilaterale Punktionen platzierten die Wunden näher an den Rändern, einem Bereich, der anfällig für das selbstverursachte Kratzen der Maus ist. Mäuse im Alter von 7 Wochen und älter galten als ungeeignet für die Studie, da eine Teilgruppe von ihnen um den 10ten Tag nach der Operation eine unregelmäßige Verdunkelung der dorsalen Haut zeigte, was auf den Beginn des Haarwachstums hindeutete (Abbildung 4A). Dies führte zu einer zusätzlichen unerwünschten Variablen.
Wenn Gummiringe verwendet wurden, lösten sich diese unabhängig davon, ob weiches oder hartes Gummi verwendet wurde, aufgrund der häufigen Bewegungen der Mäuse und der begrenzten Haftfähigkeit der Ringe oft innerhalb von etwa 12 Stunden von der Wundstelle. Gummiringe, die mit Nähten befestigt waren, neigten zum Einreißen, was wiederholte Nähte zur Stabilisierung erforderlich machte. Dieses wiederholte Nähen verursachte wiederum zusätzliche Traumata bei den Mäusen (Abbildung 4B,C). Im Gegensatz dazu zeigten Metallringe eine überlegene Stabilität und verbesserte Haftungseigenschaften, wodurch die Beurteilung von Reepithelialisierungseffekten ohne Störung durch Wundkontraktion ermöglicht wurde.
Angesichts des Potenzials des metallischen Ring-nahtfixierten Spreizers, zusätzliche Hautschäden außerhalb des Wundbereichs zu verursachen und ungleichmäßige mechanische Spannungen über die Wunde zu erzeugen, wurde ein standardisierter Stempel mit festgelegten Abmessungen verwendet, um nachfolgende Analysen zu erleichtern.
Die Untersuchung zeigte, dass die Beispielbehandlungsgruppe (hucMSC-Exo) im Vergleich zur Kontrollgruppe eine schnellere Heilungsgeschwindigkeit aufwies (Abbildung 5A). Obwohl die vollständige Heilung im Stempelmodell schneller eintrat als in der genähten Metallringgruppe, die die Wundkontraktion begrenzt, wurde während der ersten 7 Tage kein statistisch signifikanter Unterschied in den Heilungsraten beobachtet (Abbildung 5B). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Arbeiten von Lin et al. überein, die darauf hindeuten, dass die ersten 10 Tage der Heilung bei muriner Haut hauptsächlich eine Reepithelialisierung und keine Kontraktion beinhalten9.
Vergleich der Dissoziation 
Nach umfangreicher Optimierung der Enzymzusammensetzung zeigte die Kombination aus Dispase II und Kollagenase eine überlegene Leistung im Vergleich zur Verwendung eines einzelnen Enzyms (Tabelle 1). Wichtig ist, dass die Anwesenheit von roten Blutkörperchen oder zellulärem Detritus minimal war und somit die entscheidenden Kriterien für die maschinelle Verwendung erfüllt wurden, darunter eine Zellviabilität von über 85 % und eine Aggregationsrate unter 20 %.
Im Gegensatz dazu zeigte der Testkit-Ansatz vielversprechende Ergebnisse mit einer relativ höheren Zellviabilität und einer geringeren Zellaggregationsrate (Tabelle 1). Darüber hinaus wurden keine roten Blutkörperchen oder Zellfragmente beobachtet, was auf eine insgesamt überlegene zelluläre Qualität im Vergleich zu anderen Methoden hinweist.
<img alt="Chirurgisches Gerät auf Tierhaut; schematische Darstellung eines kreisförmigen Einschnitts; Wunde mit Maßstab." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Fertiges Maus-Wundmodell. (A) Stellvertretendes Bild des genähten individuellen Metallrings. (B) Stellvertretendes Bild des Hautstempels und der ausgeschnittenen Wunde. Durchmesser: 8 mm. Randabstand: 1 cm. (C) Wundverschlussrate. Fehlerbalken: Standardfehler. Zweiseitiger T-Test (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Zellpräparationsprozess: Probenpräparation, Dissoziation, Lyse der roten Blutkörperchen, Entfernung abgestorbener Zellen, Einzelzell-Suspensionen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Herstellung von Einzelzell-Suspensionen. Die Schritte umfassen Probenentnahme, Dissoziation, Lyse der roten Blutkörperchen, Entfernung abgestorbener Zellen und die Herstellung einer Einzelzell-Suspension. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Wundheilungsexperiment an Ratten; Zeitstrahlbilder, Tag 1 und 6 nach der Operation; Maßstab." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Maus-Wundmodell mit Wunden auf jeder Seite. (A) Ein repräsentatives Bild des Maus-Wundmodells mit Wunden auf jeder Seite ist dargestellt. Weißer runder Referenzdurchmesser: 8 mm. (B) Repräsentatives Bild der Wundheilung zu verschiedenen Zeitpunkten für Wunden auf jeder Seite. Die Haut auf dem Rücken der Maus in der Nähe des Schwanzes heilte schneller als die in der Nähe des Nackens. Kantenlänge des weißen quadratischen Referenzobjekts: 1 cm. Durchmesser des weißen runden Referenzobjekts: 8 mm. Abkürzungen: POD = postoperative Tage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Diagramm des Wundheilungsversuchs mit Messung, POD 1 bis POD 10, Untersuchung an Rattenhautschnittwunde." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4: Maus-Wundmodell mit einzelnen Wunden. (A) Repräsentatives Bild der Wundheilung in verschiedenen Haarwachstumsphasen von 7 Wochen alten Mäusen. Die Mäuse befinden sich am 10. postoperativen Tag (POD) in unterschiedlichen Haarwachstumsphasen. Dunklere Haut heilte schneller. (B) Repräsentatives Bild von gummiartigen Kleberingen. Weiße quadratische Referenzobjektkante: 1 cm. (C) Repräsentatives Bild von Nähten. Weißer runder Referenzobjektdurchmesser: 8 mm. Abkürzungen: POD = postoperative Tage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Wundverschlussrate über die Zeit; experimentelle Balkendiagramme zum Vergleich der Behandlungswirksamkeit; statistische Analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5: Wundverschlussrate. (A) Vergleich zwischen Kontroll- und hucMSC-Exo-Gruppen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardfehler. Zweiseitiger T-Test (n=6). (B) Vergleich zwischen Stempel- und Metallring-Gruppen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardfehler. Die Signifikanz wurde mittels zweiseitigem t-Test berechnet (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rate der Zellviabilität</td>
			<td>Rate der Zellaggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eigene Methode</td>
			<td>86,90 %</td>
			<td>18,50 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methode mit Testkit</td>
			<td>90,65 %</td>
			<td>13,73 %</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Überlebensfähigkeit und Aggregationsrate der beiden Zellpräparationsansätze.

Diese Studie stellt zwei entscheidende experimentelle Techniken vor: die Konstruktion eines murinen Wundmodells zur Beurteilung des Wundverschlusses und die Herstellung von einzelligen Suspensionen aus der Haut von Mäusen, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

The management of acute full-thickness skin injuries presents a considerable challenge in clinical practice. The complexity of wound healing, involving ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wundmodelle von Mäusen und Herstellung von Einzelzellsuspensionen 

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Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

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Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

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