Name: Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Generierung von Melanom-Patienten-Organoiden zur Untersuchung von Tumorbiologie und Immuntherapieantworten. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krebsbehandlungen und verbessert Arzneimittelentwicklungsstrategien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Vom Patienten stammende Melanom-Organoide: Eine Grenze in der Krebsimmuntherapie

<ol><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Lines+Are+Useful+Model+Systems+for+Medical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2 mL Kryo-Fläschchen aus Polypropylen mit roter Kappe und Innengewinde</td><td>Corning</td><td>431420</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>105 mm Polystyrol-Pinzette Sterile</td><td>Caplugs Evergreen&nbsp;</td><td>222-1121-B1I</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Zellkulturflasche</td><td>Corning</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (1x) Reduziertes Serummedium (1:1)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Anti-Human-Perforin-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>308120</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Human-Antikörper Ki-67</td><td>BioLegend</td><td>350522</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human-CD366 (Tim-3) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>345028</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 Anti-Human-CD45-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Einsätze 0,4 & Mikro; m, 30 mm Durchmesser</td><td>Millipore Sigma</td><td>PIHP03050</td><td></td></tr><tr><td>Zellfärbepuffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m Nylon</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 & Mikro; m Nylon</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ IV, Pulver</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Rattenkollagen I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatte, PS, 48 Vertiefungen, TC behandelt mit Deckel, steril</td><td>Max Scientific</td><td>07-6048</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - hoher Glukosegehalt 4,5 mg/mL</td><td>Corning</td><td>MT10-0130CV</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I - Grade II</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td> DPBS, <td></td></tr><tr><td>1%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, FBS</td><td>Corning</td><td>MT35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptose-Nachweiskit I</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>556547</tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Nahrungsergänzungsmittel</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Schinken F12 Nährstoffmischung</td><td>ThermoFisher</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B (50 mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Zelle</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Phenolfrei & Tatsache des Wachstums. Reduzierter</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Millex PVDF-Spritzenvorsatzfilter, 0,22 &mu; M</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nunc TripleFlask Behandelte Zellkulturflasche</td><td>ThermoFisher</td><td>132867</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanin5 Anti-Human-CD8a-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>301010</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Maus Anti-Human CD279 (PD-1)</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>561272</tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human FGF-sauer</td><td>Peprotech</td><td>100-17A Natriumbicarbonat</td><td></td></tr><tr><td>Lösung (NaHCO3) (7,5%)</td><td>Qualität Biologisch&nbsp;</td><td>118-085-721</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klingen aus Edelstahl Nr. 22</td><td>Integra</td><td>4-322</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr></tbody></table>

aufdeckung therapeutischer möglichkeiten mit organoidmodellen von melanom-patienten

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

Die Form und Größe der MPDOs wurden im Laufe der Zeit überwacht, um ihre Wachstumsdynamik zu untersuchen. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, nahm die Größe der Organoide während der anfänglichen Wachstumsphase während der dargestellten 7 Tage erheblich zu. Nach der Beobachtung der MPDO-Wachstumsdynamik wandte sich die Aufmerksamkeit der Bewertung der Immunzellzusammensetzung zu, um die originalgetreue Rekapitulation der Organoide zu verifizieren. Diese Bewertung, die sich hauptsächlich auf die αβ-T-Zell-Häufigkeit konzentrierte, lieferte Einblicke in die Ähnlichkeit zwischen den Organoiden und dem elterlichen Tumor. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied im αβ-T-Zell-Verhältnis zwischen den elterlichen Tumoren und den jeweiligen Organoiden, die entweder in Matrigel oder Kollagen kultiviert wurden. Nachdem wir Ähnlichkeiten zwischen elterlichen Tumoren und Organoiden gezeigt hatten, untersuchten wir als nächstes die T-Zell-Aktivität mittels Durchflusszytometrie. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 4 zu finden, die durch die Definition einzelner, lebender Leukozyten und anschließendes Gating an den CD3+ - und CD8+ -T-Zellpopulationen erhalten wurde, um gemeinsame T-Zell-Aktivierungsmarker zu untersuchen.
Angesichts der Rolle zytotoxischer T-Zellen bei der Erzeugung von Zytokinen und der Freisetzung zytotoxischer Moleküle wie Granzym B und Perforin wurde ihre Expression gemessen. Die Expression von Granzym B und Perforin wurde bei 35,1 % bzw. 2,17 % nachgewiesen17. Die Expression von T-Zell-Immunglobin und Muzindomäne 3 (Tim3) in 1,83% der CD8+ T-Zellen stimmt mit den Eigenschaften des Immunsuppressivums TME18 überein. Die Expression des programmierten Todesrezeptors (PD-1) in 49,5% der CD8+ -Population innerhalb der MPDOs unterstreicht die immunsuppressive Natur der Mikroumgebung des Organoids. Schließlich wurde auch die Expression von Kiel 67 (Ki67), ein Marker für die Proliferation, in CD8+ T-Zellen mit 26,8 % bewertet19
MPDOs können auch verwendet werden, um die Abtötungsfähigkeit von γδ-T-Zellen zu beurteilen. Mehrere 10 Tage alte MPDOs wurden mit γδ T-Zellen behandelt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die MPDOs gesammelt und in eine Einzelzellsuspension dissoziiert und in 100 μl Bindungspuffer resuspendiert, der 5 μl AV-FITC und 5 μl PI enthielt. Nach einer 15-minütigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die γδ-T-Zell-induzierte Zytotoxizität an den Zellen in den MPDOs zu bestimmen. Wie in Abbildung 5 A,B zu sehen ist, zeigten nach der Behandlung mit γδ T-Zellen mehr Zellen in den MPDOs Merkmale der Apoptose (80,5%). Dies steht im Vergleich zum Kontrollexperiment, bei dem nur eine Minderheit der Zellen Merkmale der Apoptose zeigte (19,2%).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kultur von MPDOs. Herausgeschnittenes frisches Melanomgewebe wird mechanisch und enzymatisch aufgeschlossen, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Diese Suspension wird dann in Vertiefungen kultiviert, die mit Matrigel oder Kollagengel beschichtet sind, um Organoide zu bilden. Abkürzung: MPDO = Melanom Patient Derived Organoid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig02.jpg"> Abbildung 2: Konfokale Mikroskopie-Aufnahmen von MPDOs, die an den Tagen 2 und 7 in Matrigel eingelegt wurden. Einzellige Suspension aus frischem Melanomgewebe wird im Matrigel kultiviert. Die Bilder wurden an Tag 2 und Tag 7 mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Die Größe der Organoide nimmt allmählich zu. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: MPDO = Melanom Patient Derived Organoid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig03.jpg"> Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analyse zum Vergleich der αβ-T-Zellzusammensetzung im elterlichen Tumor mit Organoiden, die in Kollagengel oder Matrigel kultiviert wurden. Die Quantifizierung von Immunzellen in MPDOs erfolgte mittels FACS. Vergleich von αβ T-Zellen in elterlichen Tumoren, MPDOs, die nach 7 Tagen in Kollagengel oder Matrigel kultiviert wurden. n = 8; ns = keine Signifikanz (nichtparametrischer Mehrfachtest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie und -Analyse zur Charakterisierung von Immunzellen am Tag 10 MPDOs, die in Matrigel kultiviert wurden. Gating-Strategie zur Unterscheidung von Immunzelluntergruppen, gefolgt von Quantifizierung und Profil der verschiedenen Marker, die in den Organoiden exprimiert werden. Abkürzungen: MPDO = Melanom Patient Derived Organoid; FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Höhe; FSC-H = Vorwärts-Scatter-Peak-Höhe; SSC-A = Seitliche Streu-Peak-Fläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig05.jpg"> Abbildung 5: Die γδ-T-Zell-Behandlung induziert die Zelltötung bei MPDOs. MPDOs wurden 24 h lang mit γδ T-Zellen inkubiert, dann wurden die MPDOs gesammelt und in eine Einzelzellsuspension dissoziiert. (A) Annexin-V- und PI-Färbung von Organoiden, die nach γδ-T-Zell-Behandlung in Matrigel kultiviert wurden. Eine Verschiebung zur Nekrose nach Behandlung mit γδ T-Zellen ist offensichtlich. (B) Quantifizierung apoptotischer Zellen in MPDOs nach γδ T-Zell-Behandlung. n = 5 *p &lt; 0,05; **p &lt; 0,01 (nichtparametrischer Mehrfachtest). Abkürzungen: MPDO = Melanom Patient Derived Organoid; PI = Propidiumiodid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung aller Medien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509_Table%201%20(2).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

unveiling-therapeutic-opportunities-with-melanoma-patient-derived

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video werden vom Menschen stammende Melanomzellen subkutan in die Flankenregion einer immungeschwächten Maus implantiert. Das PDX-Modell ermöglicht die präklinische Untersuchung von Melanomzellen, die die in  vivo beobachtete Tumorheterogenität und Melanomaggressivität besser rekapitulieren.

Patienten-abgeleitete Xenotransplantat-Modellierung: Eine Technik zur Generierung von Melanom-Mausmodellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Patienten-abgeleitete Xenograft -Modelle (PDX) rekapitulieren die molekularen und biologischen Merkmale des Melanoms robuster und sind prädiktiver für die Therapiereaktion im Vergleich zu herkömmlichen auf Kunststoffgewebekulturen basierenden Assays. Hier beschreiben wir unser Standard-Betriebsprotokoll für die Etablierung neuer PDX-Modelle und die Charakterisierung/Experimentierung bestehender PDX-Modelle.

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Es wird eine Methode beschrieben, um Organoide unter Verwendung von patientenabgeleiteter Xenografts (PDX) für das In-vitro-Screening herzustellen, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. PDX-Tumoren wurden mechanisch oder enzymatisch in kleine Stücke geerntet / verarbeitet, gefolgt von der Clevers-Methode, um Tumororganoide zu züchten, die passageiert, kryokonserviert und gegen das ursprüngliche PDX charakterisiert wurden.

Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Bewertung von Arzneimittelsensitivitäten gegenüber zielgerichteten Signalinhibitoren in NSCLC-patientenabgeleiteten Organoidmodellen.

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Wir stellen ein Protokoll vor, mit dem therapeutische Arzneimitteltests mit Patientinnen-Ovarialkarzinom-Organoiden durchgeführt werden können.

Ovarialkarzinom-Patientinnen-abgeleitete Organoid-Modelle für präklinische Medikamententests

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Wir bieten einen umfassenden Überblick und eine Verfeinerung bestehender Protokolle für die Bildung von Organoiden des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die alle Stadien der Organoidkultivierung umfassen. Dieses System dient als wertvolles Modell für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten.

Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Erfahren Sie die Generierung von Melanom-Patienten-Organoiden zur Untersuchung von Tumorbiologie und Immuntherapieantworten. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krebsbehandlungen und verbessert Arzneimittelentwicklungsstrategien.

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

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