Name: Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung und Pflege keimfreier Zebrafische von der Larve bis zum Jungstadium. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen und deren Einfluss auf Entwicklung und Immunität.

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Wir danken herzlich für die Unterstützung durch das Chongqing Medical University Talent Project (Nr. R4014 für DSP und R4020 für PPJ), die National Natural Science Foundation of China (NSFC, Nr. 32200386 für PPJ), das Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) und das Programm des China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research durch CAS.

Optimierung von GF Zebrafischmodellen: Erzeugung, Pflege und mikrobielle Studien

Das Protokoll von GF Artemia wurde von der China National Intellectual Property Administration als Patent erteilt, wodurch die eingeschränkte Verwendung der Methode nach Einholung der Erlaubnis der Autoren aufgehoben wird. Die Verfasser erklären, dass sie keine weiteren konkurrierenden oder finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte innerhalb der Protokolle von GF Fisch und GF Speisenzubereitung Bei der Generierung von GF Fischmodellen waren mehrere kritische Schritte erforderlich, darunter die Aufbereitung des sterilen Materials, die Sterilisation der Embryonen, die tägliche Erneuerung des GZM, die Entnahme verschiedener Proben und die sterile Untersuchung jeder Probe mit mehreren Methoden. Unter diesen Schritten ist die Erstbehandlung von Embryonen grundlegend und entscheidend für den Erfolg der GF Modelle. Die Kontrolle der Wirkstoffe, ihrer Konzentrationen und Behandlungszeiten ist entscheidend für die Erzielung optimaler Sterilisationsraten und des Schlupferfolgs. Beim Umgang von GF Fischembryonen mit Larven ist besondere Sorgfalt geboten, wobei das Medium täglich gewechselt wird und sichergestellt werden muss, dass Materialien und Plattformen gründlich mit ultraviolettem Licht sterilisiert oder autoklavierend sterilisiert werden, wenn die Platten aus dem Inkubator entnommen werden. Die Überwachung der Temperaturbedingungen und der Betriebszeit während des Winters ist unerlässlich, um das Absterben von Larven durch niedrigere Temperaturen in Reinbänken zu verhindern.
Steriles Eigelb und GF Artemia sollten vor der Verfütterung an Fische nach 7 dpf nachgewiesen werden, um ihren sterilen Zustand für GF-Langzeitmodelle zu gewährleisten. Während der Fütterungszeit ist die Reinigung von Futterresten wichtig, da sie Teil der Proben sind, die für den Nachweis bei der Erneuerung des Abfallmediums entnommen werden. Der Behälter, das GZM-Volumen und die Futtermasse sollten zusammen mit den Wachstums- und Entwicklungsstadien angepasst werden, um einen Verlust von GF-Fischen aufgrund der begrenzten Umgebung und der Wasserqualität zu verhindern. Ein regelmässiges Monitoring und Anpassungen dieser Parameter tragen zur erfolgreichen Pflege der Fischmodelle von GF bei.
Änderungen und Bedeutung dieser Protokolle Der vereinfachte dreistufige Prozess zur Erzeugung von GF Zebrafischembryonen mit optimierten Wirkstoffen, Konzentrationen und Expositionszeiten von AB-GZM-, PVP-I- und NaClO-Lösungen gewährleistet eine hohe Sterilitätsrate und eine gesunde Entwicklung der Modelle. Darüber hinaus wurden die sterilen Nachweismethoden für tägliche Proben perfektioniert, um Platten und Flüssigmediumkulturen unter aeroben und anaeroben Bedingungen sowie molekulare Techniken mit gängigen bakteriellen Primern einzubeziehen. Weitere Erfahrungen in der Untersuchung auf bakterielle und pilzliche Kontaminanten zielen darauf ab, Isolatorkontaminanten und sterile Tests bei GF Tierversuchenzu optimieren 48.
In unserer Studie wurde das spezifische Protokoll für GF Artemia-Nauplien als Lebendfutter für Fischmodelle untersucht, und PPJ und DSP wurde von der China National Intellectual Property Administration (No. ZL202210482684.8). Langzeitmodelle von GF-Fischen sind durchweg durch unzureichende und ungeeignete Ernährung eingeschränkt, was die Schwäche der Darmfunktionen im Zusammenhang mit Verdauung und Resorption verschlimmert. Als glaubwürdige Nahrungsquelle für Medaka- und Zebrafischmodelle in verschiedenen Lebensstadien sollte GF Artemia sp. mit einem einfachen Verfahren, einer kurzen Inkubationszeit und einer sterilen Detektion in Echtzeit für den täglichen Gebrauch leicht zuzubereiten sein. Bei dieser Methode werden normale Artemia-Zysten in einer ausreichenden Konzentration von NaClO gespült, um aseptisch zu sein, und dann in einer filmbeschichteten Flasche sowie auf einer Platte und in einem flüssigen Medium zum Nachweis inkubiert. Dies unterstützt frisch geschlüpfte Nauplien für die Fütterung von GF-Fischen. Die Sterilitätsrate und die Schlupfrate von Artemia sowie die Körperlänge, das Gewicht und die Aktivität von sind ausgezeichnet und weisen auf mögliche Anwendungen in der Praxis hin.
Die Bedeutung dieser Modifikationen in GF Fisch- und GF Futterprotokollen kommt den Forschern bei der Generierung von Modellen an Embryonen, Larven, Jungtieren und sogar frühen adulten und adulten Stadien bei Meeres- und Süßwasserarten zugute. Langzeit-GF-Tiere werden als In-vivo-Modelle in der Forschung zum Wirkstoffscreening und zu mikrobiellen Funktionen während des Wirtswachstums und der Wirtsentwicklung zugelassen, insbesondere in der Reife der Immunität und verwandter Darmzelllinien. Zum Beispiel besitzen Zebrafischlarven nur in der ersten Woche eine angeborene Immunität und entwickeln dann das adaptive Immunitätssystem während 7-21 dpf zusammen mit der Thymusreife31,49. Darüber hinaus können Fischmodelle von GF die Möglichkeit bieten, Bakterien-Bakterien- und Mikrobiota-Wirt-Interaktionen zu analysieren und dynamische Besiedlungs- und Migrationsprozesse in Organismen live zu beobachten50,51.
Einschränkungen der Methode Die Kultivierung von GF-Fischen von Jungtieren zu frühen adulten (28 dpf-2,5 mpf) und geschlechtsreifen adulten (>2,5 mpf) bleibt aufgrund der erhöhten Mortalität und des Risikos einer bakteriellen Kontamination während der Modellpflege eine Herausforderung. Diese Einschränkungen ergeben sich in erster Linie aus dem Fehlen geeigneter Autokultursysteme für Fische, die in einer GF-Umgebung leben. Diese Systeme sollten saubere Luft, sauberes Wasser und ein Futtersystem umfassen, um die Tiere und ihre Umgebung effektiv zu erhalten und eine vollständige Isolierung von externen Mikroorganismen zu gewährleisten. Im Gegensatz zu anderen GF Tiermodellen wie Mäusen und Hühnern52 ist die Gewinnung von GF Zebrafischen durch anatomische Operationen von den Eltern aus der Tschechischen Republik aufgrund ihrer aquatischen Gewohnheiten und ihres natürlichen Befruchtungsstils eine Herausforderung.
Es ist auch eine Herausforderung, erwachsene Tiere so zu behandeln, dass sie völlig frei von Darmmikrobiota sind. Während eine Antibiotikabehandlung einen ähnlichen Zustand wie bei spezifischen pathogenfreien (SPF) Tieren hervorrufen kann, der durch eine reduzierte Mikrobiota gekennzeichnet ist, die in Kotproben nachgewiesen werden kann, bleibt es schwierig, echte GF-Modelle für adulte Fische zu erreichen. Die Herausforderungen bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von GF-Modellen, insbesondere während des Übergangs vom Jugend- in den Langzeitzustand, sind gross. Die Bedeutung von GF-Nachkommen, wie z. B. GF F1- oder F2-Eiern von erwachsenen GF-Fischen, für die mikrobielle Forschung wird anerkannt. Die Überwindung von Herausforderungen bei der Etablierung und Pflege langfristiger adulter GF-Fischmodelle erfordert jedoch viel Zeit.
Es ist erwähnenswert, dass gnotobiotische Zebrafische mit spezifischer bakterieller Besiedlung entwickelt wurden, die auf der Grundlage von GF-Modellen ein chronisches Überleben zeigen. Dennoch bleibt ungewiss, ob diese Modelle als praktikable Alternativen zu GF-Modellen in der bakteriellen Infektions- und biomedizinischen Forschung dienen können.
Zukünftige Anwendungen von GF Fischmodellen In dieser Studie haben wir das Protokoll für die Generierung von GF-Zebrafischmodellen verfeinert, die von Embryonen zu Jungtieren fortschreiten. Dieser Fortschritt bietet bedeutende Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, Immunologie, der Erforschung von Krankheiten beim Menschen und der Organogenese. Durch Massenisolierung und -identifizierung erforscht die Studie die Funktionen, Mechanismen und aus dem Darm stammenden Metaboliten einzelner Bakterienstämme. Die Untersuchung umfasst die Infektion von GF Zebrafischmodellen nach Öffnung des Schlotes im Stadium47,53. Darüber hinaus erleichtern markierte Bakterien mit Fluoreszenz die Beobachtung der Besiedlung und Verteilung in lebenden GF-Larven, die frei von anderen mikrobiellen Einflüssen sind54. Ähnliche Fischmodelle von GF, wie z.B. Meer- oder Süsswasser-Medaka, können mit vergleichbaren Methoden mit verschiedenen Wirkstoffen oder Medienwechseln hergestellt werden.
Um die Krankheitsmechanismen des Menschen zu untersuchen, werden in der Studie FMT-Methoden eingesetzt, bei denen Proben von Patienten oder Spendern auf gesunde Tiere oder GF-Modelle übertragenwerden 55. Im Gegensatz zu konventionell gezüchteten Tieren (CR) bieten GF-Modelle robuste Beweise für mikrobielle Funktionen, Auswirkungen oder Reaktionen im Wirt, insbesondere in Kombination mit Bakteriophagen zur Regulierung von Zielbakterien in der Mikrobiota46.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GF Zebrafische aufgrund ihrer empfindlichen und reinen Darmumgebung als leistungsfähige Modelle für die Beurteilung der bakteriellen Sicherheit, der Wirksamkeit von Arzneimitteln, der Schadstofftoxizität oder der Interferenz von Verbindungen dienen. Die zukünftige Erforschung von GF Fischanwendungen sollte verschiedene Bereiche umfassen, wobei die Notwendigkeit besteht, adulte GF Fischmodelle für ein tieferes Verständnis der mikrobiellen Funktionen in verschiedenen Lebensphasen zu erstellen.

Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen 1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präsenz an verschiedenen Orten wie Nasenlöchern, Mund-, Haut- und Darmstellen wird dynamisch durch verschiedene Lebensräume und Umgebungen geprägt4. Die Darmmikrobiota in Organismen ist an der Nährstoffaufnahme, der Immunantwort, der Invasion von Krankheitserregern, der Stoffwechselregulation usw. beteiligt 5,6. Studien an Patienten haben gezeigt, dass Störungen der Darmmikrobiota mit Fettleibigkeit beim Menschen, Schlafstörungen, Depressionen, entzündlichen Darmerkrankungen (CED), neurodegenerativen Erkrankungen (Parkinson, Alzheimer), Alterung und verschiedenen Krebsarten zusammenhängen 7,8,9. Darüber hinaus umfassen interaktive Wege zwischen der Darmmikrobiota und den Wirten Entzündungsfaktoren, Neurotransmitter, Metaboliten, Darmbarriere und oxidativen Stress, wie in früheren Forschungen mit Mäuse- und Fischmodellen beobachtetwurde 10,11.
In jüngster Zeit wurden mehrere bakterienbezogene Ansätze oder Therapien, einschließlich potenzieller Probiotika und fäkaler Mikrobiota-Transplantation (FMT), für diese Erkrankungen in klinischen und Tiermodellen untersucht. Diese Untersuchungen basieren auf Entdeckungen im Zusammenhang mit der Mikrobiota-Darm-Gehirn-/Leber-/Nierenachse, von der Mikrobiota abgeleiteten Produkten und einer veränderten Rezeptoraktivität12,13. Die Entwicklung, die verschiedenen Funktionen und Mechanismen des Mikrobiota-Wirt-Systems sind jedoch aufgrund der Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und der Herausforderung, leistungsfähige menschenähnliche Krankheitsmodelle zu generieren, noch unvollständig verstanden und identifiziert.
Um diese Probleme anzugehen, wurden Mitte des 19. Jahrhunderts dringend keimfreie (GF) Tiermodelle vorgeschlagen, die vor allem im 20. Jahrhundert entwickelt wurden. Spätere Verfeinerungen, einschließlich antibiotikabehandelter und gnotobiotischer Modelle, sowie Fortschritte in der mikrobiellen Nachweis- und Beobachtungstechnologie perfektionierten diese Modelle weiter 14,15,16. GF-Tiere, die durch die Auslöschung ihres eigenen Hintergrunds und die Vermeidung von Umweltmikroben entstanden sind, bieten eine hervorragende Strategie, um die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und ihren Wirten zu erforschen17. Durch die Anwendung von Tiermodellen und verfeinerten Protokollen ist es den Forschern gelungen, ähnliche mikrobielle Zusammensetzungen zu replizieren, die bei Patienten in GF-Mäusen und -Fischen gefunden wurden. Darüber hinaus bieten andere Tiermodelle von GF, wie z. B. Hunde, Hühner und Schweine, vielfältige Optionen als Forschungsobjektean 18,19,20,21. Dieser Ansatz hat es ermöglicht, die potenziellen therapeutischen Wirkungen kommensaler Mikrobiome auf verschiedene Krankheiten, einschließlich der Krebsimmuntherapie beim Menschen, zu untersuchen16,18. GF-Modelle bieten genauere Einblicke in die Eigenschaften und Mechanismen der spezifischen bakteriellen Besiedlung, Migration, Vermehrung und Interaktion innerhalb von Wirten. Dies liefert entscheidende neue Einblicke in das Auftreten und die Entwicklung von Mikrobiota-bedingten Krankheiten22,23. Die Geschichte der Etablierung und Anwendung von GF-Zebrafischen in der mikrobiellen Forschung hat sich von den Berichten von Rawls et al. im Jahr 2004 und Bates et al. im Jahr 2006 bis zum Protokoll von Melancon et al. im Jahr 2017entwickelt 16,24,25. Die Machbarkeit von adulten oder gezüchteten GF-Modellen ist jedoch immer noch ein langwieriger Prozess, der mit unterschiedlicher Langlebigkeit, Erfolgsraten und gesundheitlichen Herausforderungen einhergeht.
Unter den verschiedenen Tiermodellen sticht der Zebrafisch (Danio rerio) aufgrund seiner vorteilhaften Ähnlichkeit mit menschlichen Organen und Genomik, seines kurzen Entwicklungszyklus, seiner hohen Fruchtbarkeit und seiner transparenten Embryonen als wichtiges Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die biomedizinische Forschung hervor19,26. Zebrafische, die als zuverlässige Krankheitsmodelle für den Menschen dienen, bieten eine visuelle Darstellung physiologischer und pathologischer Prozesse in vivo und geben Einblicke in die attraktiven Eigenschaften von Wirt-Mikroben-Interaktionen. Bemerkenswert ist, dass Zebrafische unterschiedliche Zelllinien aufweisen, die eine Abbildung der Darmphysiologie, der mikrobiellen Dynamik, der Gonaden und der Fortpflanzungsentwicklung, der Reifung des Immunsystems des Wirts, des Verhaltens und des Stoffwechsels ermöglichen27. Zebrafischembryonen entwickeln sich bis zum Schlüpfen in schützenden Chorionen und werden 3 Tage nach der Befruchtung zu Larven (dpf). Sie jagen aktiv bei 5 dpf nach Nahrung und erreichen die Geschlechtsreife etwa 3 Monate nach der Befruchtung (mpf)28. Der erste erfolgreiche keimfreie (GF) Zebrafisch, der von Rawls et al.24 berichtet wurde, zeigte, dass Larven, die nach der Dotterresorption mit autoklaviertem Futter gefüttert wurden, eine Gewebenekrose ab 8 dpf und einen vollständigen Tod bei 20 dpf aufwiesen. Dies deutete auf die Auswirkungen der Ernährung oder die Bedeutung der Berücksichtigung der exogenen Nährstoffversorgung in Experimenten mit Langzeit-GF-Fischen (>7 dpf) hin29. Nachfolgende Studien verbesserten das Generationsprotokoll von GF-Fischen, indem steriles Futter und Methoden verwendet wurden, die in verschiedenen Fischmodellen perfektioniert wurden16.
Die meisten Forschungen an GF-Zebrafischmodellen konzentrierten sich jedoch auf frühe Lebensstadien, die eine bakterielle Infektion bei 5 dpf für 24 h bis 48 h beinhalteten, wobei Proben vor 7 dpf am Ende der Experimente entnommen wurden 25,30,31. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mikrobiota in Organismen, einschließlich Menschen und Zebrafischen, zu Beginn des Lebens besiedelt und während des Wachstums und der Entwicklung geformt wird. Die Zusammensetzung bleibt im Erwachsenenstadium stabil, wobei die Rolle der Mikrobiota im Wirt während des gesamten Lebens von entscheidender Bedeutung ist, insbesondere bei Aspekten des Alterns, der neurodegenerativen, stoffwechselbedingten Fettleibigkeit und der Darmerkrankung3. So können Perspektiven von GF-Tieren mit längerem Überleben Einblicke in die Mechanismen mikrobieller Rollen bei der Entwicklung und Funktion von Wirtsorganen geben, unter Berücksichtigung des unreifen Immun- und Fortpflanzungssystems von Fischlarven im frühen Leben. Während in früheren Studien Bakterienstämme im Zebrafischdarm isoliert und identifiziert werden konnten, die das Potenzial für die Infektion von GF-Tiermodellen bieten, um Probiotika auszuwählen oder bakterielle Funktionen im Wirt zu erforschen19,25 war die Generierung und Anwendung von GF-Fischmodellen in erster Linie auf frühe Lebensstadien beschränkt. Diese Einschränkung, die auf den komplexen Produktionsprozess, die hohen Wartungskosten und die damit verbundenen Probleme mit der Nahrung und der Immunität zurückzuführen ist, behindert Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, die entwicklungsbedingten und chronischen Auswirkungen der Mikrobiota auf den Wirt zu untersuchen.
Die Überlebensrate, das Verhalten, das Wachstum, die Reifung und die allgemeine Gesundheit von Fischen, insbesondere in keimfreien (GF) Modellen, werden signifikant von den Fütterungspraktiken beeinflusst, die die Nahrungsaufnahme und -absorption während der Zeit des offenen Mundes von den frühen Larven bis zu den Jungtieren umfassen32,33. Eine der Herausforderungen in der Fischzucht von GF ist jedoch der Mangel an geeignetem sterilem Futter, der die Wirksamkeit der Ernährungsunterstützung zur Aufrechterhaltung des Wachstums und Überlebens der Larven einschränkt. Die Lösung dieses Problems ist entscheidend für die Wiederherstellung des Lebens von GF-Fischen, wenn man ihre entwicklungsfördernden Abwehrmechanismen und ihre schwachen Verdauungsfähigkeiten aufgrund des Fehlens eines Darmmikrobioms berücksichtigt. Was die Ernährung betrifft, so erweist sich die lebende Salinengarnele (Artemia sp.) als die am besten geeignete Nahrung für Larven mit offenem Mund bis hin zu Jungfischen. Es wurde beobachtet, dass Fische, die mit lebenden Salinengarnelen gefüttert werden, höhere Wachstums- und Überlebensraten aufweisen als Fische, die mit gekochtem Eigelb oder anderen natürlichen und synthetischen Ködern gefüttert werden34. Während frühe Lebensmodelle von GF-Fischen mit Dotterunterstützung überleben können und GF-Larvenmodelle durch sterile Fütterung erhalten werden können, bleibt die Generierung von Langzeitmodellen von Larven zu Jungtieren und das Erreichen der Geschlechtsreife eine Herausforderung. Darüber hinaus wird Flocken- oder Pulverfutter durch eine ungleiche Nährstoffzusammensetzung eingeschränkt und kann die Wasserqualität beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu hat lebende Artemia Vorteile wie das Überleben sowohl in Salz- als auch in Süßwasser, die geringe Größe, die für Larven bis hin zu erwachsenen Larven geeignet ist, die einfache Zusammenstellung und eine höhere Schlupfqualität35. Aufbauend auf den vorangegangenen Methoden 16,24,30 haben wir den komplexen Behandlungsprozess vereinfacht und die Herausforderung der Ernährung angegangen, indem wir leicht inkubierbares GF-Lebend-Artemia sp. als steriles Futter für eine längere Dauer als GF-Fische im frühen Leben etabliert haben.
Diese Studie stellt ein optimiertes Protokoll vor, das (1) die Generation, (2) die Erhaltung, (3) die Identifizierung der Sterilrate und (4) die Erhaltung und Fütterung abdeckt, um das Wachstum von keimfreien (GF) Zebrafischen von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren sicherzustellen. Die Ergebnisse liefern erste Hinweise auf das Schlüpfen, das Überleben, das Wachstum und die Sterilität von GF Zebrafischen sowie essentielle Indizes für GF Artemia sp. als steriles Futter. Die detaillierten Schritte zur Modellgenerierung und -aufbereitung von sterilem Lebendfutter bieten eine entscheidende technische Unterstützung für die Konstruktion und Anwendung von Langzeitmodellen von GF Fischen sowie von GF Artemia sp. in der Erforschung der Mikrobiota-Wirt-Interaktion. Das Protokoll befasst sich mit der Isolierung, Identifizierung und Infektion von Bakterien an GF-Fischmodellen, skizziert Methoden zur bakteriellen Fluoreszenzmarkierung und zur Beobachtung ihrer Besiedlung im Fischdarm unter einem Mikroskop. GF-Fische, gnotobiotische Fische mit bakterieller Infektion oder übertragene humane Mikrobiota-Modelle werden verschiedenen Detektionen unterzogen, um ihre Funktionen und Auswirkungen auf die Immunität, die Verdauung, das Verhalten, die transkriptomische Regulation und metabolische Aspekte des Wirts aufzuklären. Langfristig kann dieses Protokoll auf verschiedene Wildtyp-Fischarten, wie z. B. marine Medaka, und möglicherweise auf andere ausgewählte transgene Zebrafischlinien ausgeweitet werden, die mit bestimmten Geweben oder Krankheiten korrelieren.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>Amphotericin:Solarbio; &nbsp; kanamycin:Solarbio; Ampicillin: Solarbio.</td><td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin: CAS: 69-52-313.</td><td>49,6 mL GZM, 50 & Mikro; L Amphotericin Stammlösung (250 & Mikro; g/mL), 25 &Mikro; L Kanamycin-Stammlösung (10 mg/ml) und 250 &; micro; L Ampicillin-Stammlösung (20 mg/ml).</td></tr><tr><td>1,5 mL, 15 mL, 50 mL EP-Röhrchen</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Zum Sammeln von Proben und Halten von Mitteln</td></tr><tr><td>2,4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Verdünnt mit 8%iger wässriger Natriumhypochloritlösung.</td></tr><tr><td>6-Well-Platten, 24-, 48-Well-Platten</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>Zur Kultivierung von Fischen</td></tr><tr><td>Aeronomas</td><td>NCBI-Datenbank</td><td>Nr. MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>Anaerobe TSA-Platten</td><td>trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; Agar-Pulver: BioFroxx.</td><td>Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; Agar-Pulver: 9002-18-0.</td><td>Die TSA-Platten wurden mit 400 ml Medium hergestellt, das 6 g Trypton, 2 g Sojapepton, 2 g NaCl und 6 g Agarpulver unter dem anaeroben System enthielt.</td></tr><tr><td>Anaerober Arbeitsplatz</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>Isolierung von Bakterien, sterile Tests</td></tr><tr><td>Analyse GraphPad</td><td>Prism 5</td><td>v6.07</td><td>Zur Analyse der Daten</td></tr><tr><td>API 20 E Kits</td><td>&nbsp; BioMerieux SA, Frankreich</td><td>Nr.1005915090</td><td>Ref 20100 Kits zum Nachweis des bakteriellen</td></tr> <tr><td>StoffwechselsArtemia (Salzgarnelen)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td><td></td><td>Artemia-Zysten der Marke Aquamaster und Artemieer aus Salinengarnelen&nbsp;</td></tr><tr><td>Auto-Cycle-System für die Fischkultur</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat</td><td>Pflegen Sie den Fisch</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Eifer Weg</td><td>G154DWS</td><td>Bereiten Sie die Materialien</td></tr><tr><td>vor BHI Aerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI-Medium wurde hergestellt, wobei 100 mL Medium 3,7 g BHI-Pulver enthielt.</td></tr><tr><td>BHI Anaerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI Medium wurde unter dem anaeroben System hergestellt und in anaerobe Röhrchen unterteilt.</td></tr><tr><td>Biochemischer Inkubator</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>Für Fische und Platten</td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>Sterile Behandlung und Prüfung</td></tr><tr><td>Bleichmittel von 0,02 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Arbeitslösung mit Natriumhypochlorit (NaClO)-Konzentration: Verdünnt mit 8%iger wässriger Natriumhypochloritlösung oder 166,6 μl 6%igem Natriumhypochlorit mit 500 mL destilliertem Wasser.</td></tr><tr><td>Blutplättchen</td><td>Schafsblut:Solarbio</td><td>Kat.-Nr. TX0030</td><td>Steril defibriertes Schafsblut wurde TSA zugesetzt, um 5% der Blutplatten herzustellen.</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Zur Kultivierung von Fischen</td></tr><tr><td>CM-Dil Farbstoffe</td><td>Molekulare Sonden</td><td>Cat#C7000&nbsp; &nbsp;</td><td>Um die Bakterien zu markieren</td></tr><tr><td>Schüttelinkubator mit konstanter Temperatur</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td></td></tr><tr><td>Bakterienkultur-Datenbank</td><td>NCBI</td><td>Bakterien- und Archaeen-Datenbank</td><td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bakterien FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>Einweg-Pasteur-Pipette</td><td>biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>Wird verwendet, um Wasser zu wechseln und Eier zu übertragen</td></tr><tr><td>Einweg-Petrischale</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>Zur Kultivierung</td></tr><tr><td>von Fisch-DNA-Kits</td><td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>Bakterielle genomische DNA-Extraktionskits&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrische Pipette</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Wasser wechseln</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI Datenbank</td><td>Nr.MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Meersalz:LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>Bestehend</td><td>aus 1 l Wasser und 1,5 mL Meersalzlösung (40 g/l), autoklaviert. Der Gehalt an Meersalz in der GZM-Lösung betrug 60 mg/L.</td></tr><tr><td>Labor-Reinwassersystem</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>Bereiten Sie die Wirkstoffe</td></tr><tr><td>vor Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Mit Fluoreszenzlicht zur Beobachtung von Fischlarven</td></tr><tr><td>PCR-Kits</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq DNA-Polymerase-Kit</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>Wasserwechsel</td></tr><tr><td>Povidon-Jod (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Los#H1217005</td><td>Wässrige Lösung Povidon-Jod 0,4 g/L reines Wasser.</td></tr><tr><td>Timing-Wandler</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>Zur Regulierung des Lichts</td></tr><tr><td>TSA-Platten</td><td>Trypton: Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; Agar-Pulver: BioFroxx.</td><td>Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; Agar-Pulver: 9002-18-0.</td><td>Die TSA-Platten wurden mit 400 mL Medium hergestellt, das 6 g Trypton, 2 g Sojapepton, 2 g NaCl und 6 g Agarpulver enthielt.</td></tr><tr><td>TSB Aerobic</td><td>Trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112;</td><td>TSB-Medium wurde hergestellt, wobei 400 ml Medium 6 g Trypton, 2 g Sojapepton und 2 g NaCl enthielten.</td></tr><tr><td>TSB Anaerobes</td><td>Trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112;</td><td>Das TSB-Medium wurde aufbereitet und unter dem anaeroben System in die anaeroben Röhren aufgeteilt.</td></tr><tr><td>Ultra-saubere Werkbank</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>Sterile Behandlung und Prüfung</td></tr><tr><td>Ultrareines Durchflusssystem für Fischzucht</td><td>Unternehmen für marine biologische Ausrüstung</td><td>No Cat</td><td>Wasser für Fische produzieren</td></tr><tr><td>VibrioNCBI-Datenbank</td><td></td> <td>Nr. MK178501</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

generierung, pflege und identifizierung von keimfreien zebrafischmodellen von der larve bis zum jungstadium

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafische dienen als wertvolle Modelle für die Erforschung von Wachstum, Immunität und Darmmikrobiota aufgrund ihrer genomischen Ähnlichkeiten mit Säugetieren, transparenten Embryonen, die sich in einer relativ sauberen Chorionumgebung entwickelt haben, und der extrem schnellen Entwicklung von Larven im Vergleich zu Nagetiermodellen. Keimfreie (GF) Zebrafische (Danio rerio) sind entscheidend für die Bewertung der Schadstofftoxizität und die Etablierung menschenähnlicher Krankheitsmodelle in Bezug auf mikrobielle Funktionen. Im Vergleich zu konventionell gezüchteten (CR) Modellen (Fische in gemeinsamer Haltung) ermöglichen GF-Zebrafische eine genauere Manipulation der Wirtsmikrobiota und helfen bei der Bestimmung des kausalen Zusammenhangs zwischen Mikroorganismen und Wirten. Folglich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses dieser Beziehungen. GF-Zebrafischmodelle werden jedoch in der Regel in den frühen Lebensstadien (vom Embryo bis zur Larve) erstellt und erforscht, da die Immunfunktion und die Nährstoffaufnahme eingeschränkt sind. Diese Studie optimiert die Generierung, Erhaltung und Identifizierung von frühen GF-Zebrafischmodellen ohne Fütterung und mit langfristiger Fütterung mit GF-Futter (wie Artemia sp., Salinengarnelen). Während des gesamten Prozesses wurden täglich Probenahmen und Kulturen durchgeführt und durch mehrere Detektionen, einschließlich Platten und 16S rRNA-Sequenzierung, identifiziert. Die aseptische Rate, das Überleben und die Entwicklungsindizes von GF Zebrafischen wurden erfasst, um die Qualität und Quantität der generierten Modelle sicherzustellen. Wichtig ist, dass diese Studie Details zur bakteriellen Isolierung und zu Infektionstechniken für GF Fische liefert, die die effiziente Erstellung von GF Fischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium mit GF Futterunterstützung ermöglichen. Durch die Anwendung dieser Verfahren in der biomedizinischen Forschung können Wissenschaftler die Zusammenhänge zwischen den bakteriellen Funktionen des Darms und der Gesundheit des Wirts besser verstehen.

Die GF-Zebrafischmodelle können effizient hergestellt werden, indem die reichlich vorhandenen Eier von Zebrafischpaaren verwendet werden, wobei das Protokoll auf der Grundlage früherer GF-Fischmodelle optimiert wurde35. Eine einzige 6-Well-Platte kann etwa 30-48 Embryonen/Larven kultivieren, was eine umfangreiche Datenerfassung und statistische Analyse ermöglicht. Nach der sterilen Behandlung werden die GF-Embryonen in einem sauberen Inkubator kultiviert, bis sie nach 48-72 Stunden zu den Larven schlüpfen, und die GZM wird täglich mit dem Nachweis der entnommenen Proben gewechselt, was für die Aufrechterhaltung des keimfreien Zustands entscheidend ist (Abbildung 1). Nach 7 dpf sollte die Nahrung aus Eigelb und lebender Artemia für die Larven bis zum Jugendstadium zubereitet werden. Während des Wachstums und der Entwicklung von Fischen sollten das Volumen, der Behälter und die Dichte von GZM rechtzeitig reguliert oder geändert werden, um Tod und Versagen des sterilen Status zu vermeiden. Wenn der Nachweis keine bakterielle Belastung zeigt, können die erfolgreichen GF-Modelle als chronische Modelle vom Jugend- bis zum frühen Erwachsenenalter aufrechterhalten werden, aber die Überlebensrate ist in der Praxis viel niedriger. Schließlich können die Sterilitätsrate, die Überlebensrate, der Entwicklungsindex, das Verhalten, die histopathologische Analyse und das Transkriptionsprofil von GF- und CR-Fischmodellen gemessen werden, um den Einfluss der Mikrobiota und der Wirkstoffscreening-Felder zu untersuchen. In dieser Studie wurden die wichtigsten Entwicklungsindizes verglichen (Ergänzende Abbildung 1), und die Schlupfrate von GF-Fischen war 45,7 % niedriger als von CR-Fischen, mit 60 % bei 72 hpf. Die Herzfrequenzen von GF-Larven bei 7 dpf waren mit 18,2 Schlägen/10 s signifikant niedriger als bei CR-Fischen mit 22,6 Schlägen/10 s, aber es gab keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen bei 14 dpf mit Raten von 23,5-23,8 Schlägen/10 s. Die Überlebensrate von GF-Fischen bei 7 dpf war mit 86,7 % die gleiche wie bei CR-Fischen, sank jedoch auf 60 % bei 14 dpf im Vergleich zu 80 % bei CR-Fischen. Die Überlebensraten sowohl von GF- als auch von CR-Fischen sanken jedoch auf 25%-10% nach der Periode mit offenem Maul, in der sie Fressfähigkeiten oder -gewohnheiten erwarben. Das Versagen, den sterilen Status der Fische aufrechtzuerhalten, war einer der Gründe für die niedrigere Überlebensrate. Daher sind die Fütterung und die Nährstofferhaltung vom Jugend- bis zum frühen Erwachsenenalter kritische Herausforderungen in der Fischzucht.
Ein weiterer Schlüsselfaktor, der das Wachstum und die Entwicklung von Fischen beeinflusst, ist die Fütterung. In dieser Studie untersuchen wir mehrere Methoden, um GF Artemia als Lebendfutter für langfristige GF-Zebrafischlarven an Jungtiere und Erwachsene zu gewinnen (Prozess in Abbildung 2 gezeigt). Aufgrund der täglichen Verwendung von Futter für GF Fische sollte das optimierte Protokoll für GF Artemia in der Praxis einfach, zeitsparend und wirtschaftlich sein. Nach dem Vergleich der aktiven Bewegung und des Todes/der Unbeweglichkeit von Nauplien , die mit dem Mikroskop beobachtet wurden, der Eigenschaften von Nauplien, nicht geschlüpften Eiern und der Schale, wird die Methode perfektioniert. Nach täglicher Inkubation wurden die aus Flaschen gewonnenen Indizes von frischem GF Artemia , einschließlich der Schlupf-, Überlebens- und Deformitätsrate sowie der Länge und des Gewichts der Nauplien, unter dem Mikroskop beobachtet und gemessen (Abbildung 3). Nach der Behandlung war die Schlupfrate der Artemia-Zysten mit durchschnittlich 88,15 % hoch, die Überlebensrate der schwimmenden Nauplien betrug 77,83 % und die Missbildungsrate 1,87 %. Die Körperlänge der Nauplien betrug 546,70 μm und der Körpergewichtsindex 3,80 mg/100, die für den Fang und die Fütterung von Fischen ab der einmonatigen Periode der Larven bis hin zu den juvenilen und adulten Stadien geeignet sind.
Der Nachweis von GF Fischen und GF Artemia ist auch für die Modellpflege wichtig. Entsprechend der Probenentnahme und mehrerer Testmethoden können die Ergebnisse den Erfolg von behandelten Zebrafischembryonen und Artemia-Zysten in der Kulturplatte und im flüssigen Medium liefern (Abbildung 4). Die verschiedenen Proben, die täglich entnommen werden, sollten in allen Testmethoden als steril nachgewiesen werden, die dann zum Zeitpunkt der Entnahme auf die GF Modelle hinweisen können. Die GF Artemia sollte vor der Fütterung von GF Fischen nachgewiesen werden, oder die Ergebnisse der Platte und des mittleren Inkubators sollten sich auf den sterilen Zustand frischer lebender Nauplien beziehen. Das heißt, GF Artemia wird aus Zysten auf TSA-Platten oder TSB- oder BHI-Flüssigmediumglas in Schüttelinkubation kultiviert, das zur gleichzeitigen Erzeugung von GF Artemia und zur sterilen Verifizierung verwendet werden könnte. Das GF Artemia-Protokoll kann eine begrenzte Anzahl von Larven für die Fütterung aufnehmen. Während des Fressprozesses zeigte sich, dass die GF Artemia im GZM schwamm und dann von den GF Fischlarven gefangen und verzehrt wurde.
Die Anwendungen von GF Fischmodellen umfassen verschiedene Bereiche der Biologie und Medizin und ermöglichen unter anderem die Untersuchung von mikrobiellen Funktionen, Wachstum und Entwicklung, Krankheitsmechanismen sowie das Screening von Probiotika oder Medikamenten46. In dieser Studie wurden beispielsweise zwei wichtige Darmbakterien, Aeromonas sp. und Vibrio sp., aus Zebrafischen isoliert. Die Koloniemerkmale und die Identifizierung wurden durchgeführt, und mehrere Stoffwechselfunktionen wurden in vitro mit kommerziell erhältlichen Kits gemessen (Abbildung 5). Diese Bakterien wurden isoliert und mit 16S-Sequenzierung identifiziert, und die Blastenergebnisse wurden in einem früheren Bericht vorgestellt42. Die identifizierten Bakterienstämme ermöglichen die wissenschaftliche Erforschung des Einflusses einzelner oder kombinierter Mikrobiota auf die Gesundheit des Wirts durch die Infektion der GF Fischmodelle. Die Transparenz von Fischlarven ermöglicht die Beobachtung von fluoreszenzmarkierten Bakterienzellen mit CM-Dil-Farbstoffen, was die Besiedlung und Verteilung im Darm von GF-Fischen aufzeigt (siehe Abbildung 6). Nach einer bakteriellen Infektion bei 5 dpf können GF-Zebrafischlarven mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet und kontinuierlich von 6 bis 14 dpf beobachtet werden, was Einblicke in mikrobielle Funktionen in Kombination mit Entwicklungsindizes, histopathologischen Veränderungen und molekularen Veränderungen gibt47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> Abbildung 1: Protokoll des GF-Zebrafisches von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren. Zu den wichtigsten Schritten bei der Erzeugung von GF-Zebrafischen gehören: (1) Entnahme von Embryonen aus Wildtyp-Zebrafischen und Platzierung in AB-GZM. (2) Spülen Sie die Behandlung mit PVP-I- und NaClO-Mitteln, um vollständige Sterilität zu gewährleisten. (3) Kultivierung von GF Embryonen/Larven in 6-Well-Platten mit GZM, wobei das Medium täglich erneuert wird. (4) Regulierung der Kulturbedingungen für optimales Wachstum und Entwicklung. (5) Probenahme in verschiedenen Entwicklungsstadien, gefolgt von Sterilitätstests mit Platten- und Flüssigmediummethoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> Abbildung 2: Protokoll der Zubereitung von GF Artemia als Lebendfutter für GF Fische. Zu den wichtigsten Schritten gehören: (1) Spülbehandlung von Artemia-Zysten für vollständige Sterilität. (2) Vorbereitung von GF-Zysten im Medium. (3) Inkubation in einer Salzlösung für 24 Stunden, um das Schlüpfen zu fördern. (4) Filtration von fehlgeschlagenen und leeren Eiern zum Auffangen aktiver Nauplien. (5) Waschen von gesammelten Nauplien , um Rückstände zu entfernen und so ein hochwertiges und schadstofffreies Lebendfutter zu gewährleisten. (6) Sterilitätstest der GF Artemia vor der Verfütterung an GF Fischlarven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> Abbildung 3: Indizes von GF Artemia-Zysten und - Nauplien , die 24 Stunden lang inkubiert wurden. (A) Unbehandelte Artemia-Zysten mit Verunreinigungsfilm (Maßstab: 500 μm). (B) Behandelte Artemia-Zysten mit einer leicht konvexen Oberfläche nach Wasseraufnahme und einem saubereren Aussehen (Maßstab: 500 μm). (C) Mikroskopische Untersuchung von frisch inkubierten lebenden GF Artemia-Nauplien (Maßstab: 2000 μm) und (D) Vergrößerung mit einem Maßstabsbalken von 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> Abbildung 4: Steriler Nachweis von GF-Fischen in jedem Lebensstadium und GF Artemia. (A) Sterile Tests von CR- und GF-Fischproben mit TSB- und BHI-Flüssigmedium, TSA und Blutplatten unter aeroben und anaeroben Bedingungen. (B) Sterile Tests von unbehandelten Artemia-Zysten , GF-Artemia-Zysten und Nauplien unter Verwendung von TSB- und BHI-Flüssigmedium, TSA und Blutplatten unter aeroben und anaeroben Bedingungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> Abbildung 5: Isolierung und Identifizierung von Darmbakterien im Zebrafisch. (A) Bakterienstämme, Eigenschaften von Kolonien, 16S-Sequenzierungskarten (Beispiele: Aeromonas sp. und Vibrio sp.). (B) Gattungs- und NCBI-Akzessionen. (C) Stoffwechselfunktionen von Bakterien, die aus dem Darm von Zebrafischen isoliert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> Abbildung 6: Infektion und Besiedlung von Darmbakterienstämmen im GF Zebrafisch. (A) Gewinnung isolierter und identifizierter Bakterienstämme für Infektionsexperimente. (B) Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen und Infektion von GF-Zebrafischlarven bei 5 dpf. Vergrößerung: 1x. (C) Beobachtung der Verteilung und Besiedlung von Bakterien (Vibrio sp.) im Darmgewebe in vivo. Vergrößerung: 3x. (D) Zählung der KBE von Bakterien (Aeromonas sp. und Vibrio sp.) in jeder Fischlarve durch tägliche Probenahme. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Zündkapseln</td>
			<td>Sequenzen(5'-3')</td>
			<td>Länge des Produkts</td>
		</tr><tr><td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 bp</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr><tr><td>63F</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 bp</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Primer für den Bakteriennachweis.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponenten</td>
			<td>Einheiten</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq-DNA-Polymerase</td>
			<td>2,5 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>10× Puffer (Mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>dNTP-Gemisch</td>
			<td>2,5 Mio. M.</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>Grundierung 27F</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Grundierung 1492R</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA-frei H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>Template-DNA</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Gesamtvolumen</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Endkonzentration und Volumen der Komponenten pro Reaktion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Schritt</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr><tr><td>Anfängliche Denaturierung</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 Minuten</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Denaturierung</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>Glühen</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Erweiterung</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Letzte Verlängerung</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>10 Minuten</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Halten</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: PCR-Programm zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens.
Ergänzende Abbildung 1: Die kritischen Entwicklungsindizes von GF- und CR-Zebrafischmodellen. (A) Die Schlupfrate von CR- und GF-Zebrafischen bei 72 hpf und (B) Herzschläge/10 s von CR- und GF-Fischen bei 7 dpf und 14 dpf. Die Überlebensraten (%) von CR- und GF-Fischen sanken von 7 Tagen auf 14 Tage mit 86 %, 60 %-80 % auf 10 %-25 % bei 30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Gewinnung keimfreier (GF) Fischembryonen und deren Erhaltung von Larven bis zum Jugendstadium, einschließlich der Probenahme und des Nachweises ihres sterilen Status. Die Verwendung von GF-Modellen mit Infektionen ist wichtig, um die Rolle von Mikroben für die Gesundheit des Wirts zu verstehen.

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Ziel dieser Forschung ist die Generierung neuartiger, keimfreier Tiermodelle, die hilfreiche und leistungsfähige Werkzeuge bei der Untersuchung verschiedener Mikrobiomfunktionen sein werden. In diesem Bereich wurden in letzter Zeit die frühen keimfreien Fischmodelle verwendet, aber die Langzeitmodelle sind aufgrund verschiedener Kulturbedingungen und der Entwicklungsabwehr des Personals noch begrenzt. Bei den aktuellen GF-Fischmodellen handelt es sich in der Regel um Fischmodelle im frühen Leben.Daher sind die Technologien, einschließlich der sterilen Waage, der Probennachweismethoden und der Bereitstellung steriler Lebensmittel, sehr wichtige Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt. Das keimfreie Zebrafischmodell ist entscheidend für die Untersuchung der Interaktion zwischen Wirt und Mikrobiota und deren Auswirkungen auf die Entwicklung, die Immunität und die Krankheit. Dieses Modell ermöglicht es den Forschern, die einzelnen Darmbakterien präzise zu manipulieren und ihre Wirkung auf die transparenten Zebrafischembryonen zu beobachten.Es bietet wertvolle Einblicke in die Rolle der Darmmikroben, die die Krankheit erben. In Zukunft wird sich unsere Forschung vor allem darauf konzentrieren, ein keimfreies Zebrafischmodell für den gesamten Lebenszyklus zu etablieren, um die Funktion des Darmmikrobioms besser zu verstehen.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Wartung und Pflege, um optimale Bedingungen für die Zebrafisch Haltung beizubehalten. Das Video veranschaulicht das Protokoll, für die Systemwartung, regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven.

Regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Labor: Eine Einführung

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

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Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Der Zebrafisch wurde kürzlich als Modell zur Validierung potenzieller Strahlungsmodifikatoren genutzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Verwendung von Zebrafischembryonen für strahlenbasierte Screening-Experimente und einige Beobachtungsansätze, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und Bestrahlungen zu bewerten.

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Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Erfahren Sie die Erzeugung und Pflege keimfreier Zebrafische von der Larve bis zum Jungstadium. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen und deren Einfluss auf Entwicklung und Immunität.

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

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