Name: Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie NMR-Methoden zur Charakterisierung von Glykan-Protein-Wechselwirkungen in Lösung. Dieses Protokoll zeigt Saturation Transfer Difference und chemische Verschiebungsanalyse für strukturelle Glykobiologie.

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Wir danken der spanischen Agencia Estatal de Investigación für die Akkreditierung des Severo Ochoa Center of Excellence CEX2021-001136-S, finanziert von MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, und CIBERES, einer Initiative des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanien). Wir danken auch der Europäischen Kommission für das Projekt GLYCOTWINNING.

Fortschrittliche NMR-Techniken für die Analyse von Glykan-Protein-Wechselwirkungen

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<li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li>
<li>Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li>
<li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+shape%2C+motions%2C+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li>
<li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRules+of+Engagement%26%2334%3B+of+protein-glycoconjugate+interactions%3A+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">34;Rules of Engagement&#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li>
<li>Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li>
<li>Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22A+NMR+view.+Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li>
<li>Cañada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li>
<li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li>
<li>Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li>
<li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li>
<li>Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate-protein+interactions%3A+a+3D+view+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li>
<li>Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+of+glycoproteins%3A+profiling%2C+structure%2C+conformation%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li>
<li>del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR%3A+from+molecular+recognition+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li>
<li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STD-NMR%3A+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li>
<li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucl+Magn+Reson+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li>
<li>Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li>
<li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+in+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li>
<li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCPNMR+AnalysisAssign%3A+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+NMR%22%5BJournal%5D)">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li>
<li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding%3A+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die NMR (STD-NMR) hat sich zur am häufigsten verwendeten und vielseitigsten NMR-Methode zur Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen entwickelt. Wie oben gezeigt, beruht es auf dem Phänomen des Sättigungstransfers, und der Versuchsaufbau beinhaltet die Aufnahme von zwei eindimensionalen (1D) 1H-Spektren: dem On-Resonanz- und dem Off-Resonanz-Spektro. Während des On-Resonanz-Experiments wird die Sättigung spezifischer Protonen des Proteins erreicht, indem eine Reihe von Radiofrequenzpulsen mit geringer Leistung während eines bestimmten Zeitraums angewendet wird (die Sättigungszeit liegt typischerweise zwischen 1 und 3 s). Um eine direkte Sättigung des Liganden zu vermeiden, sind die Frequenz und Länge der Sättigungspulse für die selektive Bestrahlung spezifischer Protonen des Proteins optimiert; d.h. sie müssen mit einer Frequenz angewendet werden, die frei von allen Ligandensignalen ist, und mit einer angemessenen Länge (Abbildung 1). Als Faustregel für 50 ms Sättigungspulse gilt, dass 1 ppm Differenz zwischen dem Sättigungsbereich und den nächstgelegenen Ligandensignalen eingehalten werden sollte. Im Allgemeinen führen selektive Sättigungsimpulse, die auf die aliphatische Region des Proteins angewendet werden, zu erhöhten Sättigungseffekten. Alternativ können auch aromatische Protonen (6-7 ppm) bestrahlt werden, wenn das Ligandenmolekül keine aromatischen Signale enthält. Dies ist sehr nützlich für natürlich vorkommende Glykane, da sie keine aromatischen Gruppen tragen. Sobald eine bestimmte Region des Proteins selektiv bestrahlt wird, breitet sich die Sättigung entlang des Proteins durch dipolare 1 H-1 H-Kreuzrelaxation(Spindiffusion) aus. Schließlich erreicht die Sättigung die Proteinprotonen an der Bindungsstelle, die dann über intermolekulare 1 H-1H NOEs auf die Zuckerprotonen übertragen wird, die in engem Kontakt (r < 5 Å) mit dem Rezeptor stehen. Offensichtlich nimmt die Intensität der Signale der gesättigten Liganden Protonen ab. Nach Erhalt der Sättigung dissoziieren die transient gebundenen Liganden aufgrund der Bindungskinetik (ein schneller Austausch ist erforderlich) und die Sättigungsinformation wird im freien Zustand akkumuliert. Aufgrund dieses Prozesses weisen die NMR-On-Resonanz-Spektren verminderte Signale auf (Abbildung 2).
Um diese Intensitätsstörung der 1-H-Kerne eines bindenden Glykans eindeutig darzustellen, wird ein Kontrollprotonen-NMR-Spektrum (Off-Resonanz) aufgenommen, bei dem die Sättigung weit entfernt von jedem Rezeptor- oder Kohlenhydratsignal (normalerweise zwischen 40-100 ppm) unter den gleichen Bedingungen angelegt wird. Das subtrahierte 1D-Spektrum zwischen der Off-Resonanz und der On-Resonanz zeigt ausschließlich die Signale der 1H-Kerne des Liganden, die modifizierte Intensitäten aufweisen: diejenigen, die nahe genug an der Rezeptorbindungsstelle waren, um die Magnetisierung zu empfangen (Abbildung 2).
Dennoch erhalten nicht alle 1H-Kerne des gebundenen Kohlenhydrats die gleiche Sättigung. Theoretisch ist der Magnetisierungstransfer vom Rezeptor zum gebundenen Liganden abstandsabhängig (1/r6). Dies bedeutet, dass die Intensitäten der übertragenen Sättigung zwischen den Glykan-1H-Kernen Informationen über die räumlichen Abstände zwischen den Protonen des Liganden und denen des Rezeptors enthalten, und die STD-NMR-Intensitäten für diejenigen Protonen, die näher am Rezeptor liegen, größer sind. Dementsprechend ermöglicht das STD-NMR-Experiment auch die Bestimmung des Bindungsepitops des Kohlenhydrats (Abbildung 2 und Abbildung 3), da Protonen des Liganden, die näher an der Proteinoberfläche sitzen, höhere Intensitäten aufweisen als solche, die nicht direkt an der Bindung beteiligt sind.
Das Experiment kann auf Systeme mit schwacher bis mittlerer Affinität angewendet werden, selten auf Systeme mit starken Affinitäten im niedrigen μM- oder nM-Bereich. In der Tat erfordert es, dass die Dissoziationsrate in der Entspannungszeitskala schnell ist. Andernfalls geht die Information des Sättigungstransfers durch Relaxation verloren, bevor der Ligand dissoziiert.
Auf der anderen Seite sind proteinbasierte NMR-Experimente einzigartig, um die Liganden-Protein-Interaktion mit Genauigkeit auf Aminosäureebene zu entschlüsseln, ohne die Strukturen der atomaren Auflösung zu lösen. Es untersucht molekulare Erkennungsphänomene direkt in Lösung, ohne dass eine Kokristallisation erforderlich ist. Das CSP-Analyse-Mapping ist außergewöhnlich leistungsfähig für die Entdeckung von Liganden und die Kartierung der Proteinbindungsstelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Diese Methode ist auf jeden Bereich von Affinitäten zwischen dem mM- und dem nM-Bereich anwendbar, selbst für Systeme, bei denen der Austauschkurs in der Zeitskala der chemischen Verschiebung21 langsam ist.
Nichtsdestotrotz wird dieser Ansatz bei Proteinen mit Molekulargewichten über 30-40 kDa aufgrund von Relaxationsproblemen wahrscheinlich nicht funktionieren. Anschließend kann die TROSY-Alternative18 verwendet werden, die in Verbindung mit der Proteindeuterierung besonders leistungsfähig ist. Darüber hinaus sollte das Protein einheitlich mit 15N markiert werden (und eine weitere Probe mit 13C und 15N doppelt markiert werden, um die erforderliche Rückgratzuordnung abschließen zu können). Daher sollten die Proteinexpressionsbedingungen, einschließlich des entsprechenden Expressionssystems, optimiert werden, um Milligrammmengen an Protein erhalten zu können. Proteine, die eine Tendenz zur Oligomerisierung oder Aggregation aufweisen, sind für diese Analyse ebenfalls nicht geeignet. Das hierin verwendete Instrument zur Aufzeichnung der NMR-Daten ist ein Bruker 800 MHz Spektrometer, das mit einer TCI-Kryosonde ausgestattet ist. Es wäre eine große Herausforderung, diese Methode mit Instrumenten unter 600 MHz oder ohne kryogene Sonde anzuwenden.

Die molekulare Erkennung von Glykanen ist für viele Prozesse im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit unerlässlich. Die Spezifität und Selektivität biologischer Rezeptoren (Lektine, Antikörper, Enzyme) für Glykane hängt stark davon ab, wie das prekäre Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Komponenten der Enthalpie (CH-π und van der Waals, Wasserstoffbrückenbindungen, Elektrostatik) und der Entropie (Hydrophobie, Dynamik, Solvatations-Desolvatation)1 eingestellt wird.
Angesichts der großen chemischen Vielfalt und dynamischen Natur von Glykanen werden NMR-Methoden seit mehr als 25 Jahren in großem Umfang eingesetzt, um Glykanwechselwirkungenzu analysieren 2, da diese Methoden hervorragende Informationen über molekulare Erkennungsereignisse mit präzisen Details bei atomarer Auflösung 3,4 liefern, selbst wenn die erforderlichen Wechselwirkungsnachweise nicht mit anderen Methoden abgerufen werden können. Ein wichtiger Punkt ist, dass die NMR vielseitig ist und die Untersuchung dynamischer Ereignisse auf atomarer Ebene auf verschiedenen Zeitskalen ermöglicht, was bei weitem die beste Technik für die Untersuchung der Struktur, Konformation und Dynamik von Glykanen in Lösung darstellt. Nichtsdestotrotz kann die Entflechtung dieser Informationen ein recht komplexer Prozess sein, der den Einsatz klar definierter Strategien in Verbindung mit einer sorgfältigen Datenanalyse erfordert5.
NMR-Techniken sind vielfältig und in der Tat gibt es viele Methoden, die eingesetzt werden können, um Glykan-Protein-Wechselwirkungen zu entschlüsseln6. Wir beschreiben hier zwei grundlegende NMR-Ansätze, die derzeit zur Entschlüsselung von Glykan-Rezeptor-Wechselwirkungen eingesetzt werden 7,8, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie die Darstellung des Schlüssel-Glykan-Epitops sowie der Proteinbindungsstelle 9 entwirrt werdenkann.
Bei jedem molekularen Erkennungsereignis, wenn ein Rezeptor an einen gegebenen Liganden bindet, findet ein chemischer Austauschprozess statt, der viele NMR-Parameter der an der Bindung beteiligten Teilnehmer beeinflusst10. Aus der NMR-Perspektive kann die Interaktion daher entweder aus der Sicht des Glykanliganden oder aus der des Proteinrezeptors11 überwacht werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei dem Proteinrezeptor um ein großes Biomolekül (langsame Rotationsbewegung mit Raten in der ns-Zeitskala und daher schnelle transversale Relaxation), während das interagierende Glykan als kleines bis mittelgroßes Molekül betrachtet werden kann (schnelle Rotationsbewegung mit Raten auf der ps-Zeitskala und langsame transversale Relaxation)12. Aus der Standardperspektive sind die NMR-Signale des Glykans schmal, während die des Rezeptors breit sind13.
Ligandenbasierte NMR-Methoden beruhen auf der dramatischen Veränderung, die viele Glykan-NMR-Parameter beim Übergang vom freien in den gebundenen Zustanderfahren 14. STD-NMR ist die am häufigsten eingesetzte experimentelle NMR-Technik zur Bewertung verschiedener Glykanbindungsmerkmale15, von der Ableitung des Vorhandenseins einer Bindung im Lösungszustand bis zur Bestimmung des Glykanbindungshetops; das heißt, die Atome des Liganden, die mit dem Proteinrezeptor16 in Kontakt stehen.
Alternativ dazu überwachen rezeptorbasierte NMR-Methoden die Veränderungen, die in den Signalen des Proteinrezeptors in Gegenwart des Glykans im Vergleich zu den für den Apo-Zustand17 aufgezeichneten Veränderungen stattfinden. Diese konzentrieren sich hauptsächlich auf das Screening der chemischen Verschiebungsstörungen der Proteinsignale zwischen beiden Zuständen. Das am häufigsten verwendete Experiment ist 1 H-15N HSQC oder seine TROSY-Alternativen18.
Die Kombination beider Ansätze ermöglicht die Anwendung der NMR auf viele verschiedene Systeme, die ein breites Spektrum an Affinitäten aufweisen. Für die rezeptorbasierten NMR-Methoden muss jedoch im Gegensatz zu denen, die auf dem Liganden basieren, eine relativ große Menge an löslichem, nicht aggregiertem, stabilisotopenmarkiertem (15N) Protein zur Verfügung stehen.
Im Folgenden beschreiben wir beide Methoden und heben ihre Stärken und Schwächen hervor. Beachten Sie, dass die im Protokoll beschriebenen grundlegenden Schritte als Beispiele für die Verwendung von Bruker-Spektrometern dienen. Folglich stimmen die Namen von Befehlen und Parametern mit denen überein, die in TopSpin (der Spektrometersteuerungssoftware von Bruker) verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>5 mm Shigemi Mikroröhrchen-Set Matte</td><td>CortecNet SAS</td><td>S30BMS-005B</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Laktose-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich Qu&iacute; mica S.L.</td><td>7634-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (15 N, 99%)</td><td>LC-0179-N-50G</td><td>Tracer Tecnolog&iacute; als Anal&iacute; ticas S.L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin (Natriumsalz)&nbsp;</td><td>Melford Laboratories LTD</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>BIOVIA Discovery Studio&nbsp;</td><td>BIOVIA, Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Chemisch kompetente Zellen&nbsp;</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>CMC0014-40X40UL</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>Allegra X-22R</td><td></td></tr><tr><td>D2O&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-1000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &szlig;-D-1-thiogalactopyranosid)</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td></td><td></td>VW437144N</tr><tr><td>LacNAc</td><td>Elicityl</td><td>GLY008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bouillon</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC&nbsp;</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td>214-1137</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL Molecular Graphics System</td><td>Version 2.0 Schr&ouml; dinger</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics & Materialien, Inc.</td><td>VC 505</td><td></td></tr><tr><td>Supraleitender NMR-Magnet</td><td>Bruker</td><td>600 MHz AVANCE III</td><td></td></tr><tr><td>Supraleitender NMR-Magnet</td><td>Bruker</td><td>800 MHz AVANCE III</td><td></td></tr></tbody></table>

glykan-protein-wechselwirkungen entwirren: kernspinresonanz (nmr) als rettung

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

Die Wechselwirkungen von Glykanen mit Proteinen modulieren viele Ereignisse, die mit Gesundheit und Krankheit zusammenhängen. Tatsächlich sind die Etablierung dieser Erkennungsereignisse und ihre biologischen Konsequenzen eng mit den dreidimensionalen Strukturen beider Partner sowie mit ihren dynamischen Merkmalen und ihrer Präsentation auf den entsprechenden Zellkompartimenten verbunden. NMR-Techniken sind einzigartig, um diese Eigenschaften zu entwirren, und in der Tat wurden verschiedene NMR-basierte Methoden entwickelt und angewendet, um die Bindungsereignisse von Glykanen mit ihren assoziierten Rezeptoren zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von zwei der leistungsfähigsten NMR-Methoden , dieim Bereich der NMR-Glykobiologie eingesetzt werden, 1 H-Sättigungstransferdifferenz (STD) und 1 H,15N-Heteronukleare Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimente, die komplementär Informationen aus der Glykan- bzw. Proteinperspektive liefern. In Kombination bieten sie ein leistungsfähiges Instrumentarium, um sowohl die strukturellen als auch die dynamischen Aspekte molekularer Erkennungsprozesse aufzuklären. Dieser umfassende Ansatz verbessert unser Verständnis der Glykan-Protein-Wechselwirkungen und trägt dazu bei, die Forschung auf dem Gebiet der chemischen Glykobiologie voranzutreiben.

Darin stellen wir ein Protokoll für die Auswertung von 1H-STD NMR- und 1 H-15N HSQC-Experimenten vor, um die Details der Bindungsinteraktion zwischen Lektinen und kleinen Oligosacchariden zu entschlüsseln. Die Ergebnisse, die bei der Analyse der molekularen Erkennung von LacNAc durch hGalectin-7 (hGal-7) erzielt wurden, sind enthalten und dienen als illustratives Beispiel für die erfolgreiche Implementierung des Protokolls und die Wirksamkeit dieser NMR-Methoden zur Untersuchung der feinen Details des molekularen Erkennungsprozesses. Abbildung 3 zeigt das 1H-STD NMR-Spektrum für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Das Vorhandensein von STD-NMR-Signalen deutet auf eine Bindung hin (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigen sich nur die Signale, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen, was die Abgrenzung des Bindungsepitops ermöglicht (Abbildung 3B). Abbildung 4 zeigt, wie das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins als Fingerabdruck verwendet werden kann, und Abbildung 5 zeigt die Anwendung von 1 H-15N heteronuklearen Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimenten zur Definition der chemischen Verschiebungsstörung von hGalectin-7-Rückgrat-Amidgruppen bei LacNAc-Bindung. Diese Daten zeigen nicht nur die Existenz einer Interaktion, sondern beschreiben auch die Bindungsschnittstelle des Lektins. Abbildung 6 zeigt, wie die Analyse der Titrationsdaten die Abschätzung der Bindungsaffinität von LacNAc durch hGalectin-7 ermöglicht, die im hohen mikromolaren Bereich liegt. Dieser Befund steht im Einklang mit den Ergebnissen, die mit alternativen Techniken erzielt wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Auswahl der On-Resonanz-Frequenz. 1H-NMR-Spektrum von LacNAc:hGal-7 im Verhältnis 50:1 in deuterierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 ist dargestellt. Die Signale des Liganden (LacNAc) sind im Bereich zwischen 2,0 und 5,2 ppm begrenzt. Die Sättigungsfrequenz wird sorgfältig ausgewählt, um die Abwesenheit von Ligandenprotonen in einem Bereich von 1-2 ppm zu gewährleisten, was eine selektive Bestrahlung der Protonen des Proteins ermöglicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> Abbildung 2: Das STD-NMR-Experiment. Schematische Darstellung des STD-Experiments: Das erste Spektrum (Off-Resonanz) dient als Referenz, während im zweiten (On-Resonanz) die Proteinsättigung durchgeführt wird. Die Sättigung wird effizient über das gesamte Protein propagiert und auf die Ligandenprotonen übertragen, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Das resultierende Differenzspektrum (STD-Spektrum) liefert nur solche Resonanzen, die eine Sättigung erfahren haben. Die Analyse des STD-Experiments ermöglicht die Epitopkartierung des bindenden Zuckers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> Abbildung 3: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Liganden. (A) Überlagerung der Off-Resonanz und des 1H STD-NMR-Spektren für die Wechselwirkung von LacNAc mit hGal-7. Im STD-Spektrum tauchen nur die Signale auf, die zu Protonen gehören, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen. Die Annotation der 1H-Resonanzen des Liganden wird im Off-Resonanz-Spektrum berichtet. (B) Die relativen STD-Intensitäten wurden in die chemische Struktur von LacNAc eingefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> Abbildung 4: Das 1 H-15N HSQC-Spektrum eines Proteins stellt seinen Fingerabdruck dar. (A) 1 H-15N HSQC-Spektrum von 100 μM von hGal-7 in der Apo-Form. Das Spektrum wurde bei 25 °C aufgezeichnet. Einige NH-Cross-Peaks wurden mit der Markierung ihrer entsprechenden Aminosäure annotiert. (B) Jedes NH-Paar weist eine einzigartige chemische Verschiebung auf, die von der chemischen Umgebung und damit von der 3D-Struktur des Proteins abhängt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> Abbildung 5: Bindungsanalyse aus der Perspektive des Proteins. (A) Die Überlagerung der 1 H-15N HSQC-Spektren, die für die Titration von LacNAc in hGal-7-Lösung aufgezeichnet wurden, ist dargestellt. Die Untersuchung der Spektren, bei denen mehrere Cross-Peaks chemische Verschiebungsänderungen erfahren, deutet eindeutig auf eine Wechselwirkung hin. (B) Die Darstellung der maximalen chemischen Verschiebungsstörungen (maxCSP) der Rückgratamidsignale, abgeleitet aus der Titration von LacNAc (15 Äquivalente) mit hGal-7. (C) Die am stärksten gestörten Aminosäuren von hGal-7 werden gemäß der CSP-Analyse in die 5gal PDB-Struktur abgebildet. Im 3D-Modell bezieht sich die rote Färbung auf einen CSP-Wert über 2σ, während sich die rosa Färbung auf Werte zwischen 1σ und 2σ bezieht. Der farbige Bereich stellt wahrscheinlich die Bindungsstelle dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> Abbildung 6: KD-Bestimmung basierend auf 1 H-15N HSQC-Titrationsexperimenten. (A) Darstellung des Musters der 1 H-15N HSQC-basierten Titration in Abhängigkeit von der chemischen Austauschrate auf der NMR-Zeitskala des Systems in der Studie (schnell, mittel oder langsam). Ein schnelles Austauschregime wurde im Fall der LacNAc/h-Gal-7-Interaktion beobachtet. (B) Anpassungskurve und KD-Schätzung aus der CSP-Analyse bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen für das Modellsystem von hGal-7 und LacNAc-Disaccharid. Die geschätzte KD wird mit dem entsprechenden Fehler als Durchschnitt der Daten für 20 verschiedene Aminosäuren angegeben; (C) Ausschnitte aus den 1 H,15N-HSQC-Spektren, die die Verschiebung ausgewählter Querpeaks während der Titration zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.

Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

Unsere Forschung befasst sich mit der Erforschung verschiedener Glykan-Lektin-Systeme und erforscht ihre Verbindungen zu Gesundheit und Krankheit. Wir haben Methoden aus Chemie, Biologie und Biomedizin zusammengeführt, um die Rolle bei der Immunantwort auf Pathologen von Krebs bis hin zu bakteriellen und viralen Infektionen eingehend zu untersuchen. In jüngster Zeit haben die Glykowissenschaften bahnbrechende Meilensteine gesetzt, indem sie das Glykandesign, die Synthese und die Analyse von Aspekten der strukturellen molekularen Erkennung von der atomaren auf die zelluläre Ebene transformiert haben.Diese Fortschritte bilden zusammen die Voraussetzungen für fluoreszierende oder neuartige Glykan-basierte Therapien. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zum Erfassen, Verarbeiten und Analysieren von zwei der leistungsstärksten NMR-Methoden, die im Glykanbereich eingesetzt werden. Diese Methoden, die Sättigungstransferdifferenz und die chemisch sichere Störungsanalyse bieten ergänzend genaue Informationen über die strukturellen und dynamischen Aspekte der molekularen Erkennung von Flechten.

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Chemie

Dieses Video beschreibt die Kernspinresonanzspektroskopie-Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen 15N-markierten Wildtyp- und mutierten Envoplakin-Proteinen und dem unmarkierten Vimentin-Protein. Die erfolgreiche Interaktion zwischen Wildtyp-Envoplakin und Vimentin führt zu einer großflächigen Linienverbreiterung und zum Verschwinden von Peaks in den NMR-Spektren, während das Fehlen einer Wechselwirkung zwischen dem mutierten Envoplakin und Vimentin zu gut...

Kernspinresonanz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Herstellung und Reinigung von Proteinen, die gekennzeichnet sind mit stabilen Isotopen und anschließende Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Spektroskopie der Kernspinresonanz (NMR) und MicroScale Thermophorese (MST) Experimente.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Dieses NMR-basierte Protokoll untersucht schwache Protein-Glykan-Wechselwirkungen unter Verwendung von Cyanovirin-N und D-Mannose. Durch die Kombination von Liganden- und Proteindetektionsmethoden kartiert es Bindungsstellen, detektiert allosterische Effekte und identifiziert Begegnungskomplexe. Der Ansatz umreißt die Probenvorbereitung und Datenanalyse und bietet strukturelle und dynamische Einblicke, die für glykanspezifische Diagnose- und Erkennungsmechanismen wertvoll sind.

Erforschung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen: Fortschritte in der Kernspinresonanz

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Es werden zwei Verfahren zur Zuordnung der α- und ε-Dimethylamin-Kernspinresonanzsignale eines reduktiv 13C-methylierten N-terminalen Lysins beschrieben. Eine Methode nutzt die pH-induzierte Selektivität der reduktiven Methylierungsreaktion, und die andere verwendet Aminopeptidase, um das N-terminale Lysin selektiv zu entfernen.

Methoden, um die NMR-Resonanzen von Identify<sup&gt; 13</sup&gt; C-Dimethyl-N-terminalen Amins auf reduktiv methylierte Proteine

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Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)  analysiert werden.

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Ein Verfahren zur Isolierung von EOB-DTPA und anschließende Komplexierung mit natürlichen Ga (III) und 68 Ga hier präsentiert wird, sowie eine gründliche Analyse aller Verbindungen und Untersuchungen zur Kennzeichnung Effizienz, In - vitro - Stabilität und der n- Octanol / Wasser Verteilungskoeffizient des radiomarkierten Komplexes.

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Spin Sättigungstransfer-Differenz-NMR (SSTD NMR): Ein neues Werkzeug zu erhalten kinetischen Parameter der chemischen Austauschprozesse

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