Name: Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Live-Bildgebung von Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung zellulärer Bewegungsmuster und morphologischer Veränderungen während der embryonalen Entwicklung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Aufklärung des Verhaltens von Mikroglia bei der Entwicklung des optischen Tectums von Zebrafischen

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
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<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+colonization+of+developing+zebrafish+midbrain+is+promoted+by+apoptotic+neuron+and+lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine.</a> Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Thion, M. S., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ontogeny%2C+diversity+and+neurodevelopmental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions.</a> Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development%2C+homeostasis%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+zebrafish+brain+is+seeded+by+a+lymphatic-dependent+population+of+mrc1%2B+microglia+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors.</a> Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
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<li>Zengeler, K. E., Lukens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+at+the+crossroads+of+healthy+brain+maturation+and+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders.</a> Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
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<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+developing+brain+in+living+zebrafish+using+Brainbow+and+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60593(2020).</li>
<li>Tayanloo-Beik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+modeling+of+autism+spectrum+disorders%2C+current+status+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective.</a> Front Psychiatry. 13, 911770(2022).</li>
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<li>Langova, V., Vales, K., Horacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zebrafish+and+laboratory+rodents+in+schizophrenia+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research.</a> Front Psychiatry. 11, 549232(2020).</li>
<li>Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+organism+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease.</a> Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).</li>
<li>Astell, K. R., Sieger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+vivo+models+of+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Zuchtbecken</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Verdünnt auf 0,2 mM in E3, um die Pigmentierung des Embryos zu verhindern</td></tr><tr><td>Bildgebungsschale aus Unterglas</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipette mit Graduierung</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>Trockenblockheizung</td><td>Novolab</td><td>Grant QBD4</td><td>Um niedrigschmelzende Agarose bei 37 &° zu halten; C</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>Imaris File</td><td>Converter Oxford Instruments</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop Nikon</td><td></td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose Lonza</td><td></td><td>&nbsp; 50081</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (90 mm)</td><td>avantor</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Edelstahl-Pinzette Dumont Nr. 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>Zur Montage der Embryonen-Nadel</td></tr><tr><td></td><td>Avantor</td><td>76549-024</td><td></td></tr></tbody></table>

live-bildgebung und charakterisierung der mikroglia-dynamik im zebrafischembryo

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Mikrogliazellen, die grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimieren, und Endothelzellen, die DsRed in Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL:CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) wurden dreifach transgene Embryonen14 gemäß dem beschriebenen Protokoll bei 3 dpf abgebildet. Ein einzelner Zebrafischembryo wurde in 1 % niedrigschmelzender Agarose auf einer unteren Glasplatte montiert, und das bildgebende Verfahren behinderte das Wachstum des Embryos während der Aufnahmezeit nicht. Der Zeitraffer wurde mit einem kommerziellen konfokalen Punktscanning-Mikroskopiesystem aufgenommen, das mit einer 10x 0,45 NA Trockenobjektivlinse ausgestattet war, und 488 nm und 561 nm Anregungslaser wurden für die Abbildung von Mikroglia bzw. Endothelzellen verwendet. Darüber hinaus betrugen das Zeitintervall, die Bildauflösung, die Pixelgröße und der Z-Schritt 30 Sekunden (s), 1024 x 1024, 0,49 μm bzw. 2,5 μm. Die Zeitrafferaufnahme dauerte 3,5 Stunden (h).
Das erworbene Sichtfeld erstreckte sich über den gesamten Kopf des Embryos, aber die Analyse konzentrierte sich speziell auf das optische Tectum, da Mikroglia in der ersten Entwicklungswoche hauptsächlich auf die neuronale Soma-Schicht dieser Region des dorsalen Mittelhirns beschränkt sind, was es den Forschern ermöglicht, die gesamte Population gleichzeitig sichtbar zu machen15. Die 3D-Tracking-Analyse wurde, wie oben erläutert, mit Imaris 10.0 durchgeführt. Wie in Abbildung 4 gezeigt, war das Tracking erfolgreich, was zu 25 Spuren führte, die der erwarteten Anzahl von Mikrogliazellen im optischen Tectum bei 3 dpf16 entsprachen. Eine minimale manuelle Spurkorrektur war erforderlich. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für die Daten, die aus einem erfolgreichen Nachverfolgungsexperiment extrahiert werden können. Die gleichzeitige Markierung von Makrophagen und Endothelzellen ermöglicht die Quantifizierung der Position der Mikroglia relativ zu letzteren, so dass die Forscher den relativen Abstand jeder Zelle zur nächstgelegenen Endothelzelle in der Zeit visualisieren und die Häufigkeit und Anzahl potenzieller Wechselwirkungen untersuchen können (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den experimentellen Ablauf. (A) Vorbereitung des Zebrafischembryos und Anästhesie. (B) Montage und Positionierung der Probe. (C) Bilderstellung. (D) Bildverarbeitung und Extraktion von Motilitätsdaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg"> Abbildung 2: Mikroglia-Bildgebung und Wechselwirkungen mit der zellulären Umgebung des Gehirns im Zebrafischembryo. (A) Hellfeldaufnahme eines embryonalen Zebrafischkopfes und -gehirns mit 3 dpf (dorsale Ansicht), mit Beschriftung des optischen Tectums und des Hinterhirns. Das Gehirn des embryonalen Zebrafisches kann in diesem Stadium aufgrund seiner geringen Größe und optischen Transparenz in seiner Gesamtheit abgebildet werden. (B-D) Die Lokalisation und das Verhalten der Mikroglia können durch die Verwendung transgener Linien wie (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 und (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23 und die Fokussierung auf den OT visualisiert werden. (B) Neuronen und ihre Zellkörper können mit Hilfe der Reporterlinie Tg(XlTubb:D sRed)zf148 identifiziert werden, und Mikroglia-Neuronen-Interaktionen können sichtbar gemacht werden, indem die beiden Kanäle in Linien zusammengeführt werden, die beide Transgene koexprimieren. Zu sehen ist eine Verschmelzung der grünen (Mikroglia) und roten (Neuronen, in Magenta) Signale. (C,D) Reporterlinien können auch Aufschluss über die Wechselwirkungen von Mikroglia (in grün) mit Endothelzellen geben, hier rot markiert mit dem (C) Doppel-Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) Transgene oder mit Gliazellen wie Oligodendrozyten und deren Vorläufern unter Verwendung des (D) doppelten Tg(olig2:EGFP; MPEG1:Mcherry ) transgene Linie. 1: Oligodendrozyten und Vorläuferzellen im OT, 2: Eurydendroiden-Neuronen im Kleinhirn. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; OT = optisches Tectum; HB = Hinterhirn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg"> Abbildung 3: Morphologische und räumliche Disparität zwischen Hautmakrophagen und Mikroglia in einem 3 dpf Zebrafischembryo. (A,B) Dorsale Ansicht eines Tg(mpeg1:eGFP)gl22 Zebrafischembryos bei 3 dpf, dargestellt (A) parenchymale Mikrogliazellen (markiert durch magentafarbene Sternchen) im Vergleich zu Hautmakrophagen (weiße Sternchen), identifiziert anhand ihrer relativen Position entlang der z-Achse, wie in (B zu sehen)), in dem das monochrome 3D-Bild angezeigt wird, das mit der Farbcodierung der Z-Achse gerendert wurde. (C,D) Seitenansicht von (C) A und (D) B, die die z-Tiefen von mpeg1:eGFP+ -Zellen im Kopf des Embryos zeigt und die oberflächliche Lokalisation von Hautmakrophagen im Vergleich zu Mikrogliazellen hervorhebt. (E-K) Hohe Vergrößerung jeder Zelle, gekennzeichnet durch ein Sternchen in A und B, bietet eine detaillierte Visualisierung der unterschiedlichen Morphologien zwischen (E-G) Amöben-Mikroglia und (H-K) länglichen Hautmakrophagen. Maßstabsleisten = 30 μm. Abkürzung: dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg"> Abbildung 4: Verfolgung von Mikrogliazellen in einem 3 dpf Zebrafischembryo. (A) Kopf-Rückenansicht eines 3 dpf Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress,sd5; mpeg1:eGFPgl22) dreifach transgener Embryo mit Mikroglia (grün) und der Oberflächendarstellung der Gefäße (magenta). (B-D) Repräsentative Verfolgung von Mikroglia-Bewegungen über ein (B) 3,5 h Zeitfenster. Einzelne Zellen folgen komplexen Bahnen. (C) Ausschnitt aus dem Zeitraffer, der eine vergrößerte Ansicht des Bereichs in B zeigt, der von dem gestrichelten Quadrat umschlossen ist. Sechs Bilder aus dem Film (im Abstand von 45 Minuten) werden gezeigt, die dokumentieren, wie Mikroglia vorübergehende Kontakte mit Endothelzellen in ihrer Mikroumgebung herstellen. (D) Trajektorien der Migration einzelner Mikrogliazellen innerhalb des optischen Tectums, wobei die X-, Y- und Z-Achsen die räumlichen Dimensionen darstellen. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzung: dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg"> Abbildung 5: Visualisierung der gewonnenen Daten. Beispiel für die Geodaten, die mit dem beschriebenen Protokoll erhalten werden können. Die Diagramme zeigen (A) die durchschnittliche Geschwindigkeit von Mikrogliazellen, (B) die durchschnittliche Entfernung, die sie in 1 h zurücklegen, (C) ihre mittlere quadratische Verschiebung und (D) ihre Verteilung im Raum zu verschiedenen Zeiten. Das Oberflächen-Rendering des Gefäßes ermöglichte auch die Messung des kürzesten Abstands zwischen Mikroglia und Endothelzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt, sowohl auf (E) Einzelzellebene als auch als (F) globaler Durchschnitt. Bei A, B und D stellt jeder Punkt eine einzelne Zelle dar. N = ein Embryo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

live-imaging-characterization-microglia-dynamics-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Quelle: Niu, L., et al. Visualisierung des Makrophagen-lytischen Zelltodes während einer mykobakteriellen Infektion in Zebrafisch-Embryonen mittels intravitaler Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert den Einsatz der intravitalen konfokalen Mikroskopie, um den Makrophagen-lytischen Zelltod in Zebrafischembryonen nach einer Mycobacterium marinum-Infektion zu visualisieren.

Live-Bildgebung des Makrophagenzelltods während einer mykobakteriellen Infektion in Zebrafisch-Embryonen

Dieses Video zeigt einen Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung der Notch/DeltaD-Signalgebung in radialen Glia-Vorläufern von Zebrafischen. Dazu gehören die Montage von in Agarose eingebetteten dechorionierten Zebrafischembryonen, die Injektion einer Farbstofflösung, die auf DeltaD-Liganden abzielt, auf RGPs und die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop für die asymmetrische Zellteilung, die die Aktivierung des Notch/DeltaD-Signalwegs bestätigt.

Ein Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung des Notch/DeltaD-Signalwegs in radialen Glia-Vorläuferzellen von Zebrafischen

Quelle: Lahne, M., et.al. Kultur von adulten transgenen Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten für die Bildgebung lebender Zellen mittels Multiphotonenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Live-Zell-Bildgebung der Kernmigration von Müller-Gliazellen in Agarose-eingebetteten Zebrafisch-Netzhautexplantaten nach lichtinduzierter Photorezeptorschädigung. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), der von geschädigten Photorezeptoren freigesetzt wird, aktiviert Müller-Gliazellen und löst die...

Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

Hier wird ein Protokoll für die in vivo Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Das experimentelle Verfahren umfasst die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Visualisierung.

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie die Live-Bildgebung von Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung zellulärer Bewegungsmuster und morphologischer Veränderungen während der embryonalen Entwicklung.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

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