Echtzeit-Auswertung der absoluten, zytosolischen, freien ca2+ und der entsprechenden Kontraktilität in isolierten, druckbeaufschlagten Lymphgefäßen
22. März 2024
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Messung von zytosolischem, freiem Calcium [Ca2+]i und Gefäßdurchmesser in kontrahierenden Lymphgefäßen in Echtzeit und zur Berechnung der absoluten Ca2+ -Konzentrationen sowie der Kontraktilitäts-/Rhythmizitätsparameter. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Ca2+ und kontraktile Dynamik unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu untersuchen.
Wir untersuchen die Mechanismen der Kontraktion von Lymphgefäßen und des Lymphflusses, um die zugrunde liegende Pathologie des krebsbedingten Lymphödems sowie den Zusammenhang zwischen dem Lymphsystem und Bluthochdruck besser zu verstehen. Unser Ziel ist es, therapeutische Angriffspunkte innerhalb des lymphatischen Gefäßsystems zu identifizieren, um neuartige Therapien für lymphatische Erkrankungen zu entwickeln. Jüngste Entdeckungen verschiedener Ang-Kanäle in lymphatischen Muskel- und Endothelzellen, die zur zugrunde liegenden Kalziumdynamik beitragen, haben sich als entscheidend erwiesen, um das Feld voranzubringen.
Isolierte Gefäße und Intravitalmikroskope sind wichtige Techniken für die Untersuchung der Lymphgefäßfunktionen. In jüngster Zeit gab es einen Aufwärtstrend bei der Verwendung von Organ-on-a-Chip und mikrofabrizierten Gefäßen, um viele Aspekte der Lymphbiologie zu untersuchen. Die sehr kleine Gewebegröße, die Erforschung des lymphatischen Gefäßsystems, erfordert viel Zeit, Geduld und die Entwicklung neuer Technologien.
Die Nichtverfügbarkeit von lymphatischen Muskelzell-spezifischen Markern ist eine weitere Hürde für die gesamte wissenschaftliche Gemeinschaft. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, lymphatische Kontraktionen und absolute Kalziumkonzentrationen innerhalb desselben Gefäßes zu messen. Dies bietet zusätzliche Einblicke in die Kalziumsignalisierung, die Kontraktionsmechanismen sowie die Möglichkeit, Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen zu messen.
Im Vergleich zu anderen Techniken, die möglicherweise auf relativen Veränderungen des Kalziums oder gelähmter Gefäße beruhen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeitmessung der zytosolischen Kalziumkonzentrationen und des Gefäßdurchmessers in kontrahierenden Lymphgefäßen. Es ermöglicht die Untersuchung der Kalzium- und Kontraktionsdynamik unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Wissenschaft der Gefäßbiologie
- Calcium-Signaltransduktion
Hintergrund
- Das Verständnis der Kontraktionen von Lymphgefäßen ist entscheidend für die Behandlung von lymphödembedingten Krebserkrankungen.
- Neuere Erkenntnisse über Ionenkanäle haben das Fachgebiet der lymphatischen Biologie vorangebracht.
- Methoden wie die Verwendung isolierter Gefäße und die intravitale Mikroskopie sind unerlässlich, um die Funktionen des Lymphsystems zu untersuchen.
- Zu den Herausforderungen gehören die geringe Gewebegröße und das Fehlen spezifischer Marker für lymphatische Muskelzellen.
Zweck der Studie
- Identifizierung therapeutischer Zielstrukturen im lymphatischen Gefäßsystem.
- Entwicklung neuartiger Therapien für lymphatische Erkrankungen.
- Gewinnung von Erkenntnissen über Kalziumsignalisierung und Kontraktionsmechanismen.
Verwendete Methoden
- Isolierung und Kanülierung mesenterischer Lymphgefäße von euthanasierten Ratten.
- Messung des Gefäßdurchmessers und der Kalziumkonzentrationen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Verwendung spezifischer Reagenzien zur Visualisierung der Kalziumdynamik.
- Anlegen von Druck zur Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen während der Experimente.
Hauptergebnisse
- Die gleichzeitige Messung von Calciumkonzentrationen und Gefäßdurchmesser wurde erreicht.
- Das Protokoll ermöglicht Basisvergleiche zwischen Behandlungsgruppen.
- Erkenntnisse über die Kontraktionsmechanismen wurden gewonnen.
- Ein verbessertes Verständnis der Calciumsignalgebung in lymphatischen Gefäßen wurde nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung der Funktion lymphatischer Gefäße.
- Sie weist Vorteile gegenüber Techniken auf, die auf relativen Änderungen des Calciums beruhen.
- Das Protokoll kann zukünftige Forschungsarbeiten in der Lymphgefäßbiologie und bei verwandten Erkrankungen erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Echtzeit-Quantifizierung von freiem zytoplasmatischem Ca2+ und der Kontraktilität in isolierten Lymphgefäßen ermöglicht eine mechanistische Entlastung von Studien zur lymphatischen Funktion. Dieser Ansatz mit zwei Parametern unterstützt die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung für Portfolios im Bereich lymphatischer Erkrankungen und vaskulärer Biologie. Die Methode bietet eine solide Grundlage zur Bewertung der pharmakologischen Modulation der lymphatischen Kontraktilität und des Calcium-Signalwegs in präklinischen Modellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung kalziumabhängiger kontraktiler Mechanismen in lymphatischen Gefäßen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Korrelation der Ionenkanalaktivität mit der Kontraktilität des Gefäßes.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung für Kandidaten-Targetstrukturen, die den lymphatischen Tonus und Fluss beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte, quantitative Messgrößen sowohl für die Ca2+-Dynamik als auch für kontraktile Parameter zur Assay-Entwicklung.
- Ermöglicht reproduzierbare Vergleiche zwischen Basislinie und Behandlungsgruppen anhand absoluter Messwerte.
- Ermöglicht das Screening pharmakologischer Wirkstoffe hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die kontraktile Funktion und Calciumsignalgebung der Lymphgefäße.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft präklinische Modelle mit krankheitsrelevanten Endpunkten der lymphatischen Funktion.
- Ermöglicht die translationale Entwicklung von Biomarkern, indem Ca2+-Signalgebung mit kontraktilen Phänotypen verknüpft wird.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung lymphatisch gezielter Therapeutika.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase für die Entwicklung von Arzneimitteln zur Behandlung lymphatischer und vaskulärer Erkrankungen integriert und unterstützt sowohl mechanistische Untersuchungen als auch die pharmakologische Profilierung.
- Entdeckungsbiologie: Quantifiziert die Beziehung zwischen Ca2+-Signalgebung und lymphatischer Kontraktilität zur Hypothesenprüfung.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse zur Bewertung von Substanzen und Reproduzierbarkeit von Assays.
- Analytik: Ermöglicht Echtzeit-Messungen absoluter Werte abhängiger Variablen für robuste statistische Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Mechanismuserkenntnisse mit in-vivo-Krankheitsmodellen über funktionelle Endpunkte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung unterschiedlicher Modulatoren der lymphatischen Funktion.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Target-Validierung und das mechanistische Verständnis der lymphatischen Kontraktilität.
- Operativer Wert: Standardisiert die Messung zentraler physiologischer Parameter für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch bereitgestellte quantitative, mechanistisch fundierte Daten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung lymphatischer und vaskulärer Targetstrukturen in frühen Entwicklungsstadien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Gefäßen, der Fluoreszenzbildgebung und der quantitativen Analyse.
- Benötigt spezialisierte Geräte, einschließlich Fluoreszenzmikroskope und Software zur Kantenerkennung.
- Erfordert eine standardisierte Kalibrierung und Messprotokolle über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an andere Gefäßtypen oder Arten kann eine Optimierung der Protokolle erfordern.
- Kleine Gewebegröße und das Fehlen spezifischer Marker stellen praktische Herausforderungen für eine breitere Anwendung dar.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Setting Up the Perfusion Chamber to Measure Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
2:34
Isolation and Cannulation of Mesenteric Lymph Vessels to Measure Cytosolic, Free Calcium and Vessel Diameter in Contracting Lymph Vessels
4:29
Measurement of the Absolute Concentrations of [Ca2+i2+]i in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
