Name: Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Erfahren Sie die MMqPCR-Methode zur präzisen Messung relativer Telomerlänge in humaner DNA für populationsbasierte Studien über zelluläres Altern.

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<meta charset="utf8"></head><body>Genaue Bewertung der Telomerlänge in Studien zur menschlichen Population

<ol><li>Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shortest+telomere%2C+not+average+telomere+length%2C+is+critical+for+cell+viability+and+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability.</a> Cell. 107 (1), 67-77 (2001).</li>
<li>Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+telomere+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%3A+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of telomere biology in cancer.</a> Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).</li>
<li>Lindrose, A., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+reporting+recommendations+for+pcr-based+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Telomere+Research+Network%22%5BJournal%5D)">Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement.</a> Telomere Research Network. , (2020).</li>
<li>Verhulst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+The+reliability+of+telomere+length+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Commentary: The reliability of telomere length measurements.</a> Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).</li>
<li>Mundstock, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+obesity+on+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).</li>
<li>Haycock, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocyte+telomere+length+and+risk+of+cardiovascular+disease%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 349, 4227(2014).</li>
<li>Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+of+84+studies+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis.</a> Environ Res. 158, 480-489 (2017).</li>
<li>Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+telomere+length%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Depression and telomere length: A meta-analysis.</a> J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).</li>
<li>Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+all-cause+mortality%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis.</a> Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).</li>
<li>Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+telomere+length+in+risk+and+recurrence+of+prostate+cancer%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis.</a> Andrologia. 51 (7), e13304(2019).</li>
<li>Schneider, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+telomere+length+with+risk+of+disease+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Inter+Med%22%5BJournal%5D)">Association of telomere length with risk of disease and mortality.</a> JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+the+risk+of+cardiovascular+diseases%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).</li>
<li>D'mello, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shortened+leukocyte+telomere+length+and+cardiometabolic+outcomes%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovasc+Gene%22%5BJournal%5D)">Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis.</a> Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).</li>
<li>Wilbourn, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+telomere+length+and+mortality+risk+in+non-model+vertebrate+systems%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).</li>
<li>Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Cawthon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quatitative+pcr%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quatitative pcr.</a> Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+a+novel+monochrome+multiplex+quantitative+pcr+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method.</a> Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).</li>
<li>Lindrose, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+comparison+studies+of+telomere+length+measurement+using+qpcr+approaches%3A+A+critical+appraisal+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature.</a> PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+extraction%2C+DNA+integrity%2C+and+laboratory+on+the+precision+of+qpcr-based+telomere+length+measurement+-+a+multi-lab+impartial+study%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ph+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+An+overlooked+detail+of+pcr+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting.</a> Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
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<li>Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+comparability+between+qpcr-based+telomere+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Res%22%5BJournal%5D)">Improving comparability between qpcr-based telomere studies.</a> Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).</li>
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<li>Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+qpcr-summary+of+critical+factors+and+recommendations+for+assay+design%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design.</a> Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).</li>
<li>Wolf, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-tissue+comparison+of+telomere+length+and+quality+metrics+of+DNA+among+individuals+aged+8+to+70+years%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years.</a> PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).</li>
<li>RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+long-term+storage+on+stability+of+standard+DNA+for+nucleic+acid-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods.</a> J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).</li>
<li>Dagnall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+effect+of+repeated+freeze+and+thaw+cycles+on+stability+of+genomic+DNA+using+pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis.</a> Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).</li>
<li>Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/">https://cran.r-project.org/</a> (2024).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
</ol>

Telomere sind schützende Komplexe, die sich am Ende aller eukaryotischen Chromosomen befinden und aus hochkonservierten, sich wiederholenden DNA-Sequenzen und assoziierten Proteinen bestehen. Das Telomer schützt die Integrität der DNA und bewahrt die Stabilität der Chromosomen. Eine fortschreitende Verkürzung der Telomere tritt in sich teilenden Zellen als Folge einer unvollständigen DNA-Synthese im Nachlaufstrang, DNA-Schäden und anderer Faktoren auf 1,2. Die zunehmende Evidenz für die Telomerlänge (TL) als Biomarker für das Altern und altersbedingte Krankheiten über die gesamte menschliche Lebensspanne hinweg ging einher mit einer Zunahme der Arten von TL-Messassays, die zur Bewertung der Rolle von TL in Studien zur Exposition, Krankheit und Gesundheit des Menschen verwendet wurden 3,4,5. Metaanalysen haben Assoziationen von TL mit der Gesamtmortalität, Umwelteinflüssen und gesundheitlichen Folgen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes, berichtet 6,7,8,9,10,11,12,13 . Diese Meta-Assoziationen stammen aus Studien, die eine von mehr als zwei Dutzend verschiedenen TL-Messmethoden verwenden, wobei die Stärken der Assoziationen tendenziell zwischen verschiedenen Methoden variieren 14,15,16. Die Auswahl der optimalen TL-Messmethode für eine Forschungsstudie ist ein entscheidender Schritt, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten, da jede Methode ihre eigenen Vor- und Nachteile hat 5,17.
Aufgrund der relativ niedrigen Kosten für Reagenzien, der schnellen Assay-Durchlaufzeit, der Skalierbarkeit und des geringeren anfänglichen DNA-Bedarfs werden PCR-basierte TL-Messtechniken häufig bevorzugt bei der Durchführung von Studien mit großen Probenpopulationen, Studien mit begrenztem Zugang zu Proben mit hohen DNA-Konzentrationen oder bei Studien mit hohem Durchsatz eingesetzt. Die erste PCR-basierte Methode zur TL-Messung, die ursprünglich von Richard Cawthon entwickelte quantitative Singleplex-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), nutzt das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der Telomer- (T) und Einzelkopiegen-Amplifikation (S), die auf separaten PCR-Platten durchgeführt werden18. Bei diesem Ansatz werden Primer, die zu den wiederholten Telomer-DNA-Sequenzen (T) komplementär sind, verwendet, um den Gesamttelomer-DNA-Gehalt in der Probe zu amplifizieren und durch Detektion des fluoreszierenden Reporters SYBR grün zu quantifizieren. In ähnlicher Weise werden Primer, die zu einer intergenen Region eines konservierten Einzelkopie-Gens (S) komplementär sind, verwendet, um die Anzahl der Genomkopien zu quantifizieren. Diese beiden Schätzungen werden relativ zu einer genomischen DNA-Standardkurve quantifiziert, die für alle Assays in einem Projekt verwendet wird, um die Variation von Platte zu Platte zu kontrollieren. Dividiert man die gesamte Telomer-DNA (T) durch die Kopienzahl (S) des einzelnen Genoms, erhält man das T/S-Verhältnis, eine einheitslose, relative Messung, die den durchschnittlichen Telomergehalt pro Zelle für eine einzelne DNA-Probe darstellt18,19. Das T/S-Verhältnis ist also kein spezifisches Maß für die Funktionslänge; In Übereinstimmung mit den Literaturnormen verwenden wir jedoch in diesem Protokoll den Begriff durchschnittliche TL pro Probe.
Diese Methode wurde 2009 weiterentwickelt, als Richard Cawthon den monochromen Multiplex-qPCR-Assay (MMqPCR) als einen Ansatz beschrieb, um die Variabilität des T/S-Verhältnisses im Vergleich zur ursprünglichen Singleplex-qPCR-Methode möglicherweise zu reduzieren19. Der MMqPCR-Assay besitzt die Vorteile des qPCR-Assays mit dem zusätzlichen Vorteil, dass T- und S-Signale innerhalb derselben Reaktionsvertiefung unter Verwendung eines Berichtsfluorophors gemessen werden, wodurch der Fehler im Vergleich zur Singleplex-qPCR verringert und eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit erreichtwird 19. Darüber hinaus senkt diese Multiplex-Methode potenziell die Kosten und erhöht den Durchsatz, da im Vergleich zum Singleplex-Assay19 nur halb so viele Reaktionen erforderlich sind.
Angesichts der Vorteile der MMqPCR-TL-Messung eignet sich diese Methode gut für populationsbasierte Studien zu TL-Assoziationen mit Expositionen, gesundheitlichen Ergebnissen und biologischen Prozessen. Die Einführung der Methode kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, beschreiben wir detailliert das in unserem Labor verwendete MMqPCR TL-Messprotokoll und heben die wichtigsten Schritte hervor, die implementiert wurden, um die Assay-Präzision zu erhöhen, das Kontaminationsrisiko zu verringern und die Wiederholbarkeit zu verbessern.
Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Bereinigung der Daten und zur Berechnung des Intraklassen-Korrelationskoeffizienten (ICC), einem wichtigen statistischen Maß für die Reproduzierbarkeit von TL-Messungen2. Mit unseren repräsentativen Ergebnissen demonstrieren wir, dass wir in der Lage sind, mit diesem Protokoll hohe ICCs zu generieren. Darüber hinaus identifizieren wir Schritte zur Qualitätskontrolle (QC) und Fehlerbehebung, von denen erwartet wird, dass sie die Variation in den TL-Messungen verringern und die resultierende ICC erhöhen. Aufgrund der hohen Wiederholbarkeit, Effizienz und Kosteneffizienz dieser Methode ist die MMqPCR TL-Messung ideal für die epidemiologische TL-Forschung. Abbildung 1 zeigt einen visuellen Überblick über die MMqPCR-Methode, wie sie in diesem Protokoll beschrieben wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die Methode. Ein breiter Überblick über die monochrome Multiplex-Methode der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion zur Messung der Telomerlänge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,5 ml-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0099</td><td>Seal-Rite 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, steril Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>1,5 ml-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5599</td><td>Seal-Rite 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, steril Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Im Haus</td><td>nicht anwendbar</td><td>Hergestellt aus serienmäßigem DTT, verdünntem Natriumacetat und PCR-Qualität H2O Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 & Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>15mL Röhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td>Corning 352196 Falcon 15mL Konische Zentrifugenröhrchen Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50152107</td><td>Biotang Inc 1M MgCl2 1M Magnesiumchloridlösung, hergestellt in 18,2 Megaohm Wasser und filtriert durch 0,22 Mikron Filter Lagertemperatur und Bedingungen: 4 > C&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Goldpuffer</td><td>im Haus</td><td>Nicht anwendbar</td><td>10x Goldpuffer verdünnt mit PCR2O Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 &Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>25 mM dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Desoxynukleotid-Lösungsset Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 & Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>5-ml-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>3391276</td><td>Argos Technologies Mikrozentrifugenröhrchen &ndash; 5 ml Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, weiß / klar Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Office Depot</td><td>3489072</td><td>Reynolds Wrap Stanard Aluminiumfolienrolle, 12" x 75', Silber Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold Kit &ndash; Polymerase und Puffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4311806</td><td>AmpliTaq Gold DNA Polymerase mit Goldpuffer und MgCl2 (MgCl2 in diesem Kit wird nicht verwendet), 10X Goldpuffer, 2,5U AmpliTaq Gold Polymerase Lagertemperatur und Bedingungen: minus 20 &Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Thermo Fisher AAJ77507AB</td><td></td><td>Betain, 5M Lösung, molekularbiologische Qualität, ultrarein, 10 ml Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 & Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Big Tube Rack</td><td>Thermo Fisher</td><td>344817</td><td>Fisherbrand 4-Wege-Röhrchenrack Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>CFX Maestro Software</td><td>Bio-Rad</td><td>12004110</td><td>Software für die Einrichtung von Echtzeit-PCR-Platten, Datenerfassung, Statistiken und grafische Darstellung der Ergebnisse Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Optisches Reaktionsmodul CFX96 bei Raumtemperatur für Echtzeit-PCR-Systeme mit Starterpaket</td><td>Bio-Rad</td><td>1845096</td><td>optisches 96-Well-Modul für Echtzeit-PCR Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1539706</td><td>Dithiothreitol, >99,5+ Molekularbiologische Qualität, 5 g Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 &Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-32</td><td>ELIMINase Laboratory Decontaminant Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>HEPA-Filter</td><td>USA</td><td>Scientific Ersatzfilter</td><td>Hocheffizienter Partikelfilter für AirClean Workstations Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher</td><td>06666A</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-lagig Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Beladung Trog</td><td>Thermo Fisher</td><td>14387069</td><td>Thermo Scientific Matrix Reagenzreservoirs Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Nicht anwendbar</td><td>Microsoft 365-Paket, Excel-Softwareanwendung Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Raumtemperatur Mini-Zentrifuge</td><td>Genesee Scientific</td><td>31-500B</td><td>Poseidon 31-500B Mini-Zentrifuge, blauer Deckel Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Raumtemperatur PCR Grade H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt) Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>PCR-Haube</td> bei Raumtemperatur <td>USA Scientific</td><td>4263-2588</td><td>Nukleinsäure-Workstation mit HEPA-Filterung, AirClean Systems Combination PCR Workstation Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>PCR-Streifen</td> bei Raumtemperatur <td>Thermo Fisher</td><td>AB0776</td><td>Röhrchen mit niedrigem Profil und flache Kappen, Streifen aus 8 Lagertemperatur und Bedingungen:</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchengestell</td> bei Raumtemperatur <td>Thermo Fisher</td><td>344820</td><td>Fisherbrand 96-Well-PCR-Röhrchenrack Lagertemperatur und -bedingungen: Pipettenspitzen bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>(Mehrkanal)</td><td>Ranin</td><td>17005860</td><td>Pipettenspitzen SR LTS 20&micro; L F 960A/5, 20&Mikro; L Maximum Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>USA Scientific</td><td>1181-3850</td><td>10&micro; L Graduated TipOne RPT Filterspitzen Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1850</td><td>20&micro; L Abgeschrägte SpitzeOne RPT Filterspitzen Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0880</td><td>200&micro; L Natural TipOne Pipettenspitzen in Racks Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2890</td><td>1000&micro; L TipOne Pipettenspitzen mit natürlicher Graduierung in Racks Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Mehrkanal)</td><td>Ranin</td><td>17013802</td><td>Pipet-Lite Multi-Pipette L8-10XLS, 0,5 bis 10 Mikro; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Mehrkanal)</td><td>Ranin</td><td>17013803</td><td>Pipet-Lite Multi-Pipette L8-20LS+, 2 bis 20&micro; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F144802G</td><td>Gilson Pipetman Klassische Pipetten, 1 bis 10 Mikro; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123600</td><td>Gilson Pipetman Classic Pipetts, 2 bis 20 μm; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123601</td><td>Gilson Pipetman Classic Pipetts, 20 bis 200 μm; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Pipetten bei Raumtemperatur (Einkanal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F123602</td><td>Gilson Pipetman Classic Pipetts, 200 bis 1000 μm; L Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Plattenversiegelungsfolie</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microseal bei Raumtemperatur " B&rdquo; PCR-Plattenversiegelungsfolie, Klebstoff, optisch Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Platten-Spinner</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-100-141</td><td>Fisherbrand Mini Plate Spinner Zentrifuge, 230 V Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Vorhaubenfilter</td><td>USA Scientific</td><td>4235-3724</td><td>Vorfilter für AirClean Systems Workstations Lagertemperatur und -bedingungen: Raum Temperatur</td></tr><tr><td>R Software</td><td>Das R-Projekt für statistisches Rechnen</td><td>Nicht anwendbar</td><td>R Version 4.2.2 Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Raumtemperaturwaage</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-922-329</td><td>OHAUS 30430060 Analysenwaage der PR-Serie, 62 g Kapazität Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Raumtemperatur Schere</td><td>Office Depot</td><td>458612</td><td>Office Depot Brand Schere, 8", Gerade, Schwarz, Packung mit 2 Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Sharpies</td><td>Sharpie</td><td>2151734</td><td>Brush Twin Permanent Markers, Schwarz Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Single Copy Gene Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Siehe separate Tabelle Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 °C; C bei Rehydrierung</td></tr><tr><td>Single Copy Gene Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Siehe separate Tabelle Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 & Grad; C im rehydrierten Zustand</td></tr><tr><td>Gestell für kleine Röhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-402-17</td><td>Thermo Fisher 8601 Reversible Mikroröhrchen-Racks mit Deckel Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Thermo Fisher</td><td>J63560 bei Raumtemperatur. EQE</td><td>3M NaOAc pH 5,2 Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Edelstahl-Spatel</td><td>Thermo Fisher</td><td>3990240</td><td>Bel-Art SP Scienceware Edelstahl-Probenahmelöffel und -spatel Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Fleck &ndash; 10.000-faches Konzentrat in DMSO Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 & Grad; C im rehydrierten Zustand</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-55A</td><td>GD/X 25 mm Steriler Spritzenvorsatzfilter, Celluloseacetat-Filtermedium, 0,2 &mu; m Lagertemperatur und -bedingungen:</td></tr><tr><td>Spritzen</td> bei Raumtemperatur <td>Thermo Fisher</td><td>148232A</td><td>BD Luer-Lok Einwegspritzen ohne Nadeln, 10 ml Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2474100</td><td>TE Buffer, Tris-EDTA, 1X Lösung, pH 7,6, Molekularbiologie, Fisher BioReagents Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Telomere Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Siehe separate Tabelle Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 &Grad; C bei Rehydrierung</td></tr><tr><td>Telomere Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Siehe separate Tabelle Lagertemperatur und -bedingungen: minus 20 &°; C bei rehydriertem</td></tr><tr><td>UV-Licht</td><td>USA Scientific</td><td>4288-2540</td><td>UV-Glühbirne für Workstations Lagertemperatur und Bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-151</td><td>Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Waage</td><td>Boot Thermo Fisher</td><td>01-549-752</td><td>Fisherbrand Steriles sechseckiges Waagschiffchen, 10 ml Lagertemperatur und -bedingungen: Raumtemperatur</td></tr></tbody></table>

monochrome multiplex-quantitative pcr-telomerlängenmessung 

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Die in Tabelle 4 und Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse sind ein Beispiel für hochgradig wiederholbare TL-Messungen, die durch Befolgen des Protokolls erzielt wurden. Für diese Ergebnisse wurde die DNA aus 24 Proben von mononukleären Blutzellen (PBMC) mit einem kommerziellen Kit gemäß den Herstellerrichtlinien extrahiert. Diese 24 Proben wurden über zwei 96-Well-Platten geleitet. Alle DNA-Proben wurden mit einem Spektralphotometer und einem Fluorometer auf ihre Qualität geprüft, wobei das durchschnittliche Verhältnis von 260/280, das durchschnittliche Verhältnis von 260/230 und die dsDNA-Konzentration verwendet wurden, um die Eignung des Assays und den Verdünnungsfaktor der Probe zu bestimmen (Tabelle 6). Tabelle 6 unterstreicht auch die Bedeutung der Quantifizierung der dsDNA-Konzentration, die sich von der mit einem Spektralphotometer gemessenen DNA-Konzentration unterscheiden kann. Diese Variabilität ist das Ergebnis unterschiedlicher Ansätze zur Quantifizierung. Insbesondere leitet das Spektralphotometer die DNA-Konzentration basierend auf der Absorption bei 280 nm ab und ist anfällig für Schwankungen aufgrund von Verunreinigungen (z. B. Protein, Salz usw.), die sich auf die Absorptionswerte auswirken. Im Gegensatz dazu werden dsDNA-Konzentrationen, die mit einem Fluorometer gemessen werden, durch die Fluoreszenz eines Farbstoffs bestimmt, der spezifisch an dsDNA bindet, und es wird davon ausgegangen, dass sie den DNA-Gehalt genauer widerspiegeln. Die DNA-Proben erlebten vor der MMqPCR TL-Analyse bis zu drei Gefrier-Auftau-Zyklen. Die Kontroll-DNA wurde aus gepoolten DNA-Extraktionen von PBMCs von einer Person hergestellt, die verwendet wurde, um eine siebenstufige serielle Verdünnung von 2 ng/μl auf 0,0313 ng/μl DNA zu erzeugen. Die unabhängigen Standardkurven, die für PCR-Schritt 9 (Telomer-Amplicon) und Schritt 12 (Einzelkopie-Gen Amplicon, Albumin in diesem Protokoll) erstellt wurden, sind in Abbildung 6A, B dargestellt. Die Assays wurden auf einem kommerziellen Real-Time-PCR-Nachweissystem durchgeführt, das eine Schmelzkurve erzeugte, die zeigt, wie die einzelnen Amplikonprodukte bei unterschiedlichen Temperaturen hergestellt werden, wie in Abbildung 8 zu sehen ist.
Tabelle 4: Ausgabedaten aus der MMqPCR-Messung für optimale repräsentative Ergebnisse. Mittlere T/S-Verhältnisse, SDs, CVs und Z-bewertete TL für 24 Stichproben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%204_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 5: Ausgabe von Daten zur Telomerlänge. Die Rohdaten des MMqPCR-Assays werden in der Software analysiert und dann zur weiteren Analyse und Qualitätskontrolle in die Tabellenkalkulationsvorlage eingefügt, die als ergänzende Datei 1 angehängt ist. Dieses Ausgabeblatt für TL-Vorlagen enthält eine Zusammenfassung der Daten mit Proben-IDs, durchschnittlichen TLs, SDs und CVs für jede Probe auf beiden Platten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%205_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 6: Spektralphotometer und Fluorometer DNA-Qualitätsmetriken für Probenergebnisse. QC-Daten aus der Duplikat-Spektralphotometer-Analyse und der singulären Fluorometermessung von dsDNA und etwaigen Kontaminaten pro Probe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%206_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig08.jpg"> Abbildung 8: Beispiel für eine Schmelzkurve. Schmelzekurve für Probendaten, wie sie in der Software generiert werden. Der frühere Peak ~80 °C repräsentiert das Telomer-Amplikon und der sekundäre Peak bei ~89 °C repräsentiert das Albumin-Amplicon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Bei diesem Projekt betrug der durchschnittliche Telomerwirkungsgrad 98,6 % mit einem Bereich von 90,7 bis 102,1 und der durchschnittliche Albuminwirkungsgrad 102,3 % mit einem Bereich von 93,6 bis 108,2 über alle Durchläufe. Es wurden durchschnittlich 0,97 Replikate aus den Standardkurven entfernt, was den QC-Kriterien dieses Protokolls entspricht. Die durchschnittliche Interplatten-CV betrug 1,83 % mit einer SD von 0,00616 und die durchschnittliche Intraplatten-CV 3,78 % mit einer SD von 0,00658. Die durchschnittlichen TL für diese repräsentativen Stichproben sind in Tabelle 4 und Tabelle 5 dargestellt. Der mittlere TL betrug 1,37 mit einem SD von 0,24 und einer Spanne von 0,84 bis 2,32. Das T/S-Verhältnis, SD, CV und Z-bewertete TL pro Probe sind in Tabelle 4 aufgeführt. Da es sich bei der Ausgabe des T/S-Verhältnisses des MMqPCR-Assays um ein relatives Maß für TL handelt, wurden die Verhältnisse in diesen Z-Score umgewandelt, um einen studienübergreifenden Vergleich zu ermöglichen. Die ICC für dieses Projekt wurde unter Verwendung des R-Skripts berechnet, wie es in den TRN-Richtlinien in der Ergänzungsdatei 2 beschrieben ist, unter Berücksichtigung von Batch- und Run-Effekten20. Um die projektinterne ICC zu berechnen, haben wir 10 % der durchlaufenden Proben erneut durchgeführt, wobei wir darauf geachtet haben, dass die ICC-Platten mit mindestens einer Probe aus jeder Platte der Kohorte gefüllt wurden. Die Gesamtprojekt-ICC von 0,801 [KI: 0,703; 0,86] deutet auf die hohe Reproduzierbarkeit der TL-Ergebnisse hin.
Nicht alle Ergebnisse werden optimal sein. Die Ergebnisse in Abbildung 9 und Tabelle 7 zeigen suboptimale Ergebnisse des MMqPCR-Assays. Abbildung 9 zeigt eine Standardkurve mit einem Telomerwirkungsgrad von unter 90 %, was unter den QC-Standards liegt und eine Wiederholung der gesamten Platte erfordert. Probleme mit der Primereffizienz sind in der Regel auf ein Problem mit Reagenzien zurückzuführen, daher ist es wichtig, die Daten der Aliquotierung der Reagenzien und deren Ablauf als ersten Schritt zu verfolgen, um festzustellen, welches Reagenz für die geringe Effizienz verantwortlich ist. Abgelaufene Reagenzien sollten ausgetauscht werden, bevor die Platte erneut ausgeführt wird. Tabelle 7 zeigt eine Platte, die die anfänglichen QK-Kriterien auf Probenebene erfüllte, aber ein hohes Maß an Variabilität zwischen den Platten aufweist, was zu einem Versagen der QK auf Plattenebene führte. Schwankungen zwischen den Platten sind in der Regel auf Fehler beim Pipettieren und beim Befüllen der Platten zurückzuführen. In diesem Fall sollte der Techniker alle Probleme bewerten, die beim Einrichten der Platte aufgetreten sind, und sicherstellen, dass die Pipetten kalibriert sind.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig09.jpg"> Abbildung 9: Suboptimale Ergebnisse. Diese in der Software angezeigte Standardkurve bestand die Qualitätskontrolle nicht, da die Effizienz der Amplifikation für den Telomer-Primer weniger als 90 % betrug. Das Bild stammt von P1, aber P2 hatte ähnlich niedrige Wirkungsgrade. Die Daten aus diesem Lauf konnten nicht verwendet werden, und alle Proben mussten nach dem Austausch des abgelaufenen ursächlichen Reagenzes erneut durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 7: Suboptimale Ergebnisse. In der Tabelle wird die Telomer-Datenvorlage für einen Lauf angezeigt, bei dem viele der Stichproben die QC-Standards nicht erfüllten. Samples, die erneut ausgeführt werden mussten, wurden auf der Grundlage von CV-Werten bestimmt, dann wurde der Samplename zur leichteren Identifizierung in eine rote Schrift geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%207_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Vorlage für eine Telomer-Datentabelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%201.%20MMqPCR%20Template_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: ICC-Berechnung. Dieses Protokoll wurde vom Telomere Research Network (TRN) entwickelt. Diese Datei wurde von20 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%202.%20ICC%20Calculation_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: TRN-Melderichtlinien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%203.%20TRN%20Reporting%20Guidelines_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

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Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung verschiedener Leistungsparameter des TAGGG-Telomerlängen-Assay-Kits liegt, wie z.B. Puffermengen und Sondenkonzentrationen.

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