Name: Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie molekulares Docking mit thermischer Shift-Assay (TSA) kombiniert wird, um Protein-Wechselwirkungen mit niedermolekularen Verbindungen vorherzusagen und zu validieren. Diese Methode reduziert Zeitaufwand und Kosten erheblich.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82004031) und dem Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303) unterstützt. Wir danken Jiayi Sun vom Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für die Unterstützung bei Western Blot.

Validierung der Xanthatin-Keap1-Interaktion mit Docking und CETSA

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Identifizierung von Krankheitszielen sowie die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten sind eng miteinander verknüpft27. Durch die präzise Ausrichtung auf spezifische Ziele können Wirkstoffkandidaten entwickelt werden, um bestimmte Krankheiten effektiver zu behandeln und gleichzeitig die mit den Medikamenten verbundenen Nebenwirkungen zu minimieren 28,29. Die am häufigsten verwendeten Ziele sind Proteinziele30. Die Identifizierung spezieller Proteinziele stellt jedoch aufgrund der großen Vielfalt an Proteinen innerhalb der Zellen eine immense Herausforderung dar30,31. In dieser Arbeit haben wir einen Ansatz gewählt, der molekulares Docking mit CETSA kombiniert, um Proteinziele zu identifizieren und zu validieren. Die Ergebnisse zeigten eine direkte Wechselwirkung zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein. Die Integration von Computertechnologie und biologischen Experimenten kann auch bei der Untersuchung anderer Wirkstoffe und Proteinziele eingesetzt werden, um das Vorhandensein einer direkten Wechselwirkung zwischen dem Medikament und dem Ziel festzustellen. Dieser Ansatz, der Vorhersage und Verifizierung kombiniert, reduziert effektiv sowohl den Zeitaufwand als auch die wirtschaftlichen Kosten. Darüber hinaus sind die experimentellen Instrumente und Materialien leicht zu beschaffen, und der Betriebsprozess ist nicht kompliziert. Schließlich sind die CETSA-Proben einfach vorzubereiten und mit der Western-Blot-Methode zu testen, die die Reproduzierbarkeit der Proben gewährleistet.
Unserer Erfahrung nach gibt es mehrere kritische Aspekte, die bei experimentellen Verfahren besondere Aufmerksamkeit erfordern. Erstens ist es wichtig, die Kristallstruktur des Proteins auszuwählen, die durch Röntgenanalyse aufgelöst wird, wenn die Proteinstruktur vor dem molekularen Andocken ausgewählt wird. Zweitens sind die Zelldichte und die Einfrier-/Auftauzeit entscheidende Faktoren bei CETSA-Experimenten. Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase sollten für CETSA-Experimente ausgewählt werden, da ihr Wachstumszustand stabil ist und nur minimale Auswirkungen auf die experimentellen Ergebnisse hat. Während des wiederholten Einfrierens und Auftauens von Zellen sollte der Zeitpunkt gut kontrolliert werden, wobei flüssiger Stickstoff zum Einfrieren verwendet wird, bis er eine weiße feste Form hat, gefolgt von einem sofortigen Auftauen bei Raumtemperatur vor nachfolgenden Gefrierzyklen. Schließlich müssen Western-Blot-Experimente unmittelbar nach der Vorbereitung von CETSA-Proben abgeschlossen werden, um einen Proteinabbau zu verhindern.
Molekulares Docking und CETSA sind beides etablierte Techniken, die im Bereich der Arzneimittelentwicklung eine entscheidende Rolle spielen. Molekulares Docking ist maßgeblich an der Vorhersage von Wechselwirkungen auf molekularer Ebene zwischen Verbindungen und ihren Zielen beteiligt und bietet wertvolle Einblicke in potenzielle Bindungsmodi10,11. Im Gegensatz dazu konzentriert sich CETSA auf die Bewertung der Auswirkungen von Arzneimitteln auf die thermische Stabilität von Proteinen und dient als Instrument zur Validierung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen17. Obwohl CETSA eine relativ einfache Methode zur Verifizierung ist, ist es auch eine Methode mit geringem Durchsatz, da Western Blot für die Untersuchung der thermischen Verschiebung des Wirkstoff-Protein-Komplexes verwendet wird, und es sollte nicht die einzige Technik sein, auf die man sich verlässt. Darüber hinaus sind die Schritte von CETSA kompliziert, und alle Schrittfehler während der Operation können einen großen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Darüber hinaus kann die CETSA-Methode die spezifische Bindungsstelle und den Bindungsmodus der Verbindung an das Proteinziel nicht bestimmen und nicht angeben, ob die Bindung kovalent oder nicht-kovalent ist 17,18,23. Neben dem thermischen Shift-Assay können auch andere Arten von energetischen Assays, wie z. B. die pH-abhängige Proteinfällung (pHDPP), für die Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden32. Darüber hinaus ist das thermische Proteom-Profiling eine energiebasierte Methode zur Aufdeckung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen, die durch die Kombination von Proteomik mit CETSA33 eine groß angelegte Analyse von Protein-Wirkstoff-Wechselwirkungen mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Darüber hinaus kann die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) weitere qualitative und quantitative Analysen liefern34,35. Es bestimmt nicht nur das Vorhandensein von Wechselwirkungen zwischen einem Medikament und seinem Ziel, sondern misst auch die Affinitätsparameter und kinetischen Parameter dieser intermolekularen Wechselwirkungen und bietet so ein umfassenderes Verständnis.
Neben dem thermischen Shift-Assay kann die pH-abhängige Proteinfällung (pHDPP) auch zur Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden32. Molekulares Docking ist eine physikomechanisch basierte Simulationsmethode zur Vorhersage von Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und Biomolekülen. Diese Methode zielt darauf ab, eine Bindung zu erreichen, indem die Konformation und Orientierung kleiner Moleküle optimiert wird, um die beste Komplementarität zwischen ihnen und Biomolekülen zu erzielen. Bei der Zielvorhersage werden Techniken der künstlichen Intelligenz eingesetzt, um die Bindungsstellen zwischen kleinen Molekülen und Biomolekülen vorherzusagen. Die beiden Ansätze weisen wesentliche Unterschiede in der Methodenanwendung und der Vorhersagegenauigkeit auf. Anwendung der Methode: Molekulares Docking wird hauptsächlich für das Design und die Optimierung von Wirkstoffen eingesetzt und bietet eine theoretische Grundlage für die Entdeckung neuer Wirkstoffe. Die Zielvorhersage mit Hilfe fortschrittlicherer künstlicher Intelligenz wird immer häufiger auf das Hochdurchsatz-Screening und die schnelle Entdeckung von Leitsubstanzen angewendet, um die Effizienz der Wirkstoffforschung zu verbessern. Vorhersagegenauigkeit: Da das molekulare Docking auf physikalischen Simulationen basiert, ist die Vorhersagegenauigkeit höher, aber auch der Rechenaufwand ist relativ hoch. Während die Zielvorhersage einen geringeren Rechenaufwand hat, hängt die Vorhersagegenauigkeit von der Fülle der Trainingsdaten und der Modellauswahl ab.

Proteine sind äußerst wichtige Makromoleküle in lebenden Organismen und besitzen eine Vielzahl einzigartiger Funktionen innerhalb von Zellen, wie z. B. die Membranzusammensetzung, die Bildung des Zytoskeletts, die Enzymaktivität, den Transport, die Zellsignalisierung und die Beteiligung an intrazellulären und extrazellulären Mechanismen 1,2,3. Proteine manifestieren ihre biologischen Funktionen in erster Linie durch spezifische Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Molekülen, einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, niedermolekularer Liganden und Metallionen 1,4. Liganden sind kleine molekulare Verbindungen, die spezifisch an Proteine in einem Organismus binden. Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Liganden findet an bestimmten Stellen des Proteins statt, den sogenannten Bindungsstellen, die auch als Bindungstaschen bekannt sind5. In der medizinisch-chemischen Forschung liegt der Fokus auf der Identifizierung von Schlüsselproteinen, die eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden und als Angriffspunkte für Medikamente dienen6. Daher ist ein tiefes Verständnis der Bindungsstellen zwischen Proteinen und Liganden von größter Bedeutung, um die Entdeckung, das Design und die Forschung von Arzneimitteln zu fördern 7,8.
Molekulares Docking ist ein weit verbreitetes Computerwerkzeug zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung, das die dreidimensionalen Strukturen von Proteinen und Liganden nutzt, um ihre primären Bindungsmodi und Affinitäten bei der Bildung stabiler Komplexe zu untersuchen 9,10,11. Die Anwendung der molekularen Docking-Technologie hat ihren Ursprung in den 1970er Jahren. Basierend auf dem Prinzip der Schloss-Schlüssel-Paarung und unter Verwendung der Algorithmen der molekularen Docking-Software kann die Wechselwirkung zwischen Verbindungen und molekularen Zielen durch die Analyse der Docking-Ergebnisse bestimmt werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Vorhersage aktiver Bindungsstellen sowohl für die Verbindung als auch für das Zielmolekül. Folglich erleichtert es die Identifizierung einer optimalen Bindungskonformation (hier als Bindungsmodell bezeichnet) für Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen, was für das Verständnis der Mechanik dieser molekularen Bindungen entscheidend ist 12,13,14,15. Während das molekulare Docking wertvolle computergestützte Vorhersagen von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen liefert, ist es wichtig zu beachten, dass es sich hierbei um vorläufige Ergebnisse handelt. Daher ist eine weitere experimentelle Überprüfung unerlässlich, um diese Wechselwirkungen zu bestätigen.
Der Cellular Thermal Shift Assay (CETSA), der ursprünglich 2013 vom Forschungsteam um Pär Nordlund vorgeschlagen wurde, dient als Methode zur Validierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Zielproteinen. Diese Technik testet speziell die thermische Stabilität von Zielproteinen, die durch Wirkstoffbindung induziert werden, und bietet einen praktischen Ansatz zur Bestätigung molekularer Wechselwirkungen 16,17,18. Dieser Ansatz basiert auf dem Grundprinzip, dass die Ligandenbindung eine thermische Verschiebung innerhalb der Zielproteine auslöst, und ist auf ein breites Spektrum biologischer Proben anwendbar, einschließlich Zelllysaten, intakter lebender Zellen und Gewebe19,20. CETSA unterstützt die direkte Zielaktivierung kleiner Moleküle in intakten Zellen, indem es die thermodynamische Stabilisierung von Proteinen aufgrund der Ligandenbindung nachweist und die beobachtete phänotypische Reaktion mit der Zielsubstanz verknüpft21,22. Unter den verschiedenen Methoden, die sich aus CETSA ableiten, gilt Western Blot-CETSA (WB-CETSA) als klassischer Ansatz. Nach der Probenvorbereitung mit der CETSA-Methode wird die Western-Blot-Analyse eingesetzt, um Veränderungen in der thermischen Stabilität des Zielproteins nachzuweisen. Dies ermöglicht die präzise Bestimmung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen innerhalb zellulärer Systeme17,23.
Xanthatin ist eine bioaktive Verbindung, die aus der Pflanze Xanthium L. mit Eigenschaften wie entzündungshemmend isoliert wird und in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Krankheiten wie Nasennebenhöhlenentzündung und Arthritis eingesetzt wird24,25. Das Kelch-like ECH-assoziierte Protein 1 (Keap1) ist Bestandteil des Cullin3-basierten Cullin-RING E3-Ubiquitin-Ligase-Multi-Subunit-Proteinkomplexes und ein wichtiger Regulator der intrazellulären Redox-Homöostase, der die Intensität und Dauer der Entzündungsreaktion beeinflusst, indem er den intrazellulären Redoxzustandmoduliert 26. In dieser Studie haben wir zunächst molekulares Docking verwendet, um die Interaktion zwischen Xanthatin (kleines Molekül) und dem Keap1-Protein zu untersuchen, um ihren Bindungsmodus vorherzusagen. Anschließend verwendeten wir die CETSA-Methode, um diese Interaktion zu validieren, indem wir den Einfluss von Xanthatin auf die thermische Stabilität des Keap1-Proteins untersuchten.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Polyvinylidenfluorid-Membran</td><td>Millipore</td><td>PR05509</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies Ethanol</td><td>Chron Chemikalien</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>Breitspektrum-Proteaseinhibitor-Mischungen</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Verbessertes Chemilumineszenz-Reagenz</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH-Antikörper</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Imaging-Instrument</td><td>E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>Gradienten-PCR-Instrument</td><td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase-konjugiertes AffiniReiner Ziegenantikörper</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Chron chemicals</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Keap1 Antikörper</td><td>Zen BioScience Co., Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>Metallbad</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Chron chemicals</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot Rapid Transfer Puffer (20&fach;)</td><td>NCM Biotech Co., Ltd</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE Gel schnelle Vorbereitung für</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefärbter Farbproteinmarker</td><td>Biosharp&nbsp;</td><td>BL741A</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Blotting-Elektrophorese-System</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&Ograve; Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 Zellen</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 zellspezifisches Medium</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Protein-Ladepuffer</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Laufpuffer Pulver</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepuffertes Kochsalzpulver</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Memmert</td><td>WNE10</td><td></td></tr><tr><td>Wasserreiniger</td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>Xanthatin</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

vorhersage und validierung von proteinzielen für niedermolekulare verbindungen

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

Proteine sind für die menschliche Physiologie von grundlegender Bedeutung, wobei ihre Ziele für die Forschung und Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung sind. Die Identifizierung und Validierung wichtiger Proteinziele ist zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung geworden. Molekulares Docking ist ein computergestütztes Werkzeug, das häufig zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung eingesetzt wird, insbesondere im Zusammenhang mit Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Proteinzielen. Für die experimentelle Verifizierung der Bindung und um direkt auf die Bindung des Wirkstoffs und seines Ziels zuzugreifen, wird die Methode des Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) verwendet. Diese Studie zielte darauf ab, molekulares Docking mit CETSA zu integrieren, um Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und lebenswichtigen Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren. Konkret haben wir die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein sowie dessen Bindungsmodus durch molekulare Docking-Analyse vorhergesagt, gefolgt von der Verifizierung der Interaktion mit dem CETSA-Assay. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Xanthatin Wasserstoffbrückenbindungen mit spezifischen Aminosäureresten des Keap1-Proteins aufbauen und die Thermostabilität des Keap1-Proteins verringern kann, was darauf hindeutet, dass Xanthatin direkt mit dem Keap1-Protein interagieren kann.

Die molekulare Docking-Analyse sagte die Wechselwirkung zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein voraus. Abbildung 2 zeigt die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Xanthatin und den Aminosäureresten Gly-367 und Val-606 des Keap1-Proteins mit einer Wasserstoffbrückenlänge von 2,17 Å für Gly-367 und 2,13 Å für Val-606. Darüber hinaus deutet der berechnete Docking-Score von -5,69 kcal/mol auf eine gute Bindungsaffinität zwischen Xanthatin und Keap1-Protein hin.
Die CETSA-Methode zeigte, dass die Xanthatinbindung die thermische Stabilität des Keap1-Proteins veränderte, was die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein21 bestätigte. Abbildung 3 zeigt, dass Xanthatin die thermische Stabilität des Keap1-Proteins im Temperaturbereich von 48 °C bis 57 °C im Vergleich zur DMSO-Gruppe bemerkenswert verschiebt. Um eine gleichmäßige Probenbelastung zu gewährleisten, war erstens die Dichte der Zellinokulation, bei der wir die Experimente durchführten, konsistent; zweitens wurden die Zellproben aus der DMSO-Gruppe und der Xanthatin-Gruppe in den Zellkulturschalen gut gemischt und dann gleichmäßig auf zwei Mikrozentrifugenröhrchen verteilt, wodurch die gleichbleibende Menge an Zellproben sichergestellt wurde, und das Volumen des Überstands, das jedem PCR-Röhrchen zugesetzt wurde, betrug 60 μl, und schließlich betrug das Volumen jeder Probe, die in den Western Blot hochgeladen wurde, 20 μl. Dies gewährleistete eine gleichmäßige Beladung der erhitzten Proben. Der Proteinabbau in Proben ab etwa 51 °C ist hauptsächlich auf Veränderungen der Proteinstruktur und beschleunigte chemische Reaktionen zurückzuführen, die durch hohe Temperaturen verursacht werden. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Xanthatin direkt an das Keap1-Protein binden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg"> Abbildung 1: Ladereihenfolge des Western Blots. Die Temperatur in der Reihenfolge von links nach rechts betrug 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C und 63 °C.  Die erste Spur wurde mit einer Markierung versehen; Für jede Temperatur wurden zwei Fahrspuren verwendet; Die erste Lane war die DMSO-Gruppe und die zweite Lane die Xanthatin-Gruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg"> Abbildung 2: Interaktion zwischen Xanthatin und dem Protein Keap1 (PDB: 2FLU). (A) Die 2D-Darstellung von Xanthatin, das an Keap1 bindet. (B) Die 3D-Visualisierung von Xanthatin und Keap1 Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg"> Abbildung 3: Einfluss von Xanthatin auf die thermische Stabilität des Keap1-Proteins. (A) Die Auswirkungen von Xanthatin auf die thermische Stabilität von Keap1 wurden mittels CETSA nachgewiesen. (B) Die optischen Dichten von Keap1 wurden auf die bei 45 °C erreichten Dichten normiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Analyse wurde durch eine unidirektionale Varianzanalyse (unidirektionale ANOVA) durchgeführt. n = 3. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, p &lt; 0,001, p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem zellulären thermischen Shift-Assay, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf Proteintargets, Vorhersage und Validierung von kleinmolekularen Verbindungen. Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem ähnlichen thermischen Shift-Assay, um die Wechselwirkung zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren. Diese Schritte von CETSA sind kompliziert und Fehler während der Operation können einen großen Einfluss auf die Ergebnisse haben.Unser Protokoll kombiniert Vorhersage mit Verifizierung und reduziert so effektiv sowohl den Zeitaufwand als auch die wirtschaftlichen Kosten. Darüber hinaus sind die experimentellen Instrumente und Materialien einfach zu aktivieren. Schließlich sind die CETSA-Proben im Test leicht vorzubereiten, was die Herstellbarkeit der Proben sicherstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Richtlinien für die computergestützte strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Proteinen unter Verwendung der I-Tasser Pipeline beschrieben. Ab Abfrage Proteinsequenz sind 3D-Modelle generiert mit mehreren Threading Ausrichtungen und iterative strukturellen Aufbau-Simulationen. Funktionelle Konsequenzen werden anschließend auf der Grundlage Übereinstimmungen mit Proteinen mit bekannter Struktur und Funktionen gezeichnet.

Ein Protokoll für die Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine integrierte Strategie zur Erforschung der wichtigsten Ziele und Mechanismen von Fructus Phyllanthi gegen Hyperlipidämie, basierend auf der Vorhersage der Netzwerkpharmakologie und der Verifizierung der Metabolomik.

Netzwerk Pharmakologische Vorhersage und metabolomische Validierung des Mechanismus von Fructus phyllanthi gegen Hyperlipidämie

Wir beschreiben eine auf Sequenzdiversifikation basierende Methodik zur Abschätzung der Aminosäurepräferenzen multispezifischer Bindungsstellen in Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs). Bei dieser Strategie werden Tausende von potentiellen Peptidliganden erzeugt und in silico gescreent, wodurch einige Einschränkungen der verfügbaren experimentellen Methoden überwunden werden.

Computergestützte Vorhersage der Aminosäurepräferenzen potenziell multispezifischer Peptidbindungsdomänen, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind

Dieses zweisprachige Protokoll bietet einen computergestützten Workflow zur Wirkstoffentdeckung, der die Protein-Ligand-Interaktionen von Polo-ähnlichen Kinasen 1 bis 3 (PLK1–3) sowie die Eigenschaften Absorption, Distribution, Metabolism, Exkretion, Toxicity and Stability (ADMET-S) von datenbankbezogenen natürlichen Molekülen bewertet.

Ein zweisprachiger computergestützter Workflow zur Identifizierung potenzieller PLK1-Inhibitoren in der amerikanischen Gebärdensprache und im Englischen

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll zum Ausführen des Pathway2Targets-Algorithmus, eines R-Skripts, das therapeutische Ziele auf der Grundlage des Profils intrazellulärer Signalwege vorhersagt und priorisiert, das durch den Vergleich von Fall- und Kontrollproben aus einem Massen-RNA-Sequenzierungsexperiment generiert wurde.

Verwendung von differentiell exprimierten Genlisten des Menschen zur Durchführung einer Downstream-Analyse der Signalweganreicherung und Zielpriorisierung

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Konstruktion eines Konsensus-Pharmakophor-Modells vorgestellt, indem molekulare Merkmale aus mehreren Liganden integriert werden. Diese Methode ist anwendbar für die Wirkstoffforschung, die auf jedes biologische Ziel mit bekannten ligandengebundenen Konformationen abzielt, und ermöglicht die Identifizierung wichtiger Interaktionsmerkmale für das virtuelle Screening und das rationale Wirkstoffdesign.

Pharmakophormodellierung für Targets mit umfangreichen Ligandenbibliotheken: Eine Fallstudie zu SARS-CoV-2 Mpro

Diffuse schädliche inhibitorischen Kontrolle, zeitliche Summation und Wunde Hyperalgesie Tests sind in der geburtshilflichen Patienten demonstriert. Diese Tests auswerten hemmenden und erregenden Mechanismen der Schmerzverarbeitung und werden hier genutzt, um endogene Analgesie bei verschiedenen Zeitpunkten bewerten während der Schwangerschaft und der Peripartalperiode zu helfen, zeigen einzelne s Risiko für anhaltende Schmerzen.

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Wir beschreiben ein Rattenmodell der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD), die die anhaltenden Veränderungen im neuroendokrinen Funktion und die verzögerte langfristige, übertriebene Angstreaktion, die charakteristisch für PTBS-Patienten zeigt. Das Tiermodell und hier beschriebenen Methoden sind nützlich zum Korrelieren Biomarkern in Gehirnkernen, die mechanistische sind, aber nicht bei Patienten gemessen werden, wobei Biomarkern in peripheren weißen Blutzellen, welches kann.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Erfahren Sie, wie molekulares Docking mit thermischer Shift-Assay (TSA) kombiniert wird, um Protein-Wechselwirkungen mit niedermolekularen Verbindungen vorherzusagen und zu validieren. Diese Methode reduziert Zeitaufwand und Kosten erheblich.

Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen

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