Name: Zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnüssen (Arachis spp.) Samen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie die zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen. Diese Methode ermöglicht die Analyse wilder Arachis-Spezies und die Identifizierung resistenter Keimlinge gegen Aspergillus.

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Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6044-42000-011-00D und des CRIS-Projekts 6044-21000-005-000-D. Wir danken Dan Todd für die Herstellung des Minisäulen-Haltegestells Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich dem Zweck, spezifische Informationen bereitzustellen, und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.

1. Vorbereitung der Samen für die Pilzbefall
<ol><li>Inkubieren Sie den aflatoxigenen Aspergillus flavus NRRL 3357 auf einer Schräge aus Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) in einem Reagenzglas für 6 Tage bei 30 °C. Entnehmen Sie Pilzsporen aus dem Reagenzglas mit 10 ml Wasser mit Tween 20 (100 μl Tween in 1 l destilliertem sterilem Wasser), filtrieren Sie durch Glaswolle, die in einen Trichter gegeben wird, und zählen Sie die Sporen mit einem Hämozytometer, das sich auf die Bedienungsanleitung bezieht.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Sporensuspension mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 1.000 Sporen/μl. Bestätigen Sie die Konzentration mit einem Hämozytometer. HINWEIS: Bereiten Sie die Sporensuspension frühestens 2 Stunden vor den anspruchsvollen Experimenten vor.</li>
	<li>Die Erdnussschoten vorsichtig aufbrechen und die Schalen entfernen. Legen Sie die Samen so in ein steriles Becherglas, dass das Volumen der Samen 1/5 des Bechervolumens nicht überschreitet, fügen Sie 0,05 % Wasserstoffperoxidlösung zu etwa 70 % des Bechervolumens hinzu und lassen Sie die Samen 3 Stunden lang Wasser aufnehmen.</li>
	<li>Dezitieren Sie die Wasserstoffperoxidlösung von den Samen und geben Sie etwa die 3-fache Menge an 80% Ethanol-Wasser-Gemisch (v/v) in das Becherglas, um die Samen zu bedecken. 1 Minute ziehen lassen und dann die Samen 2x mit der gleichen Menge sterilem destilliertem Wasser abspülen.</li>
	<li>Geben Sie das 5-fache Volumen von 3 % Wasserstoffperoxid in das Becherglas mit den ethanolsterilisierten Samen und lassen Sie es 5 Minuten stehen, dann dekantieren Sie die Flüssigkeit und spülen Sie die Samen zweimal mit gleichen Mengen sterilem Wasser ab (Abbildung 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung von Erdnusssamen für die Inokulation, Inkubation und Extraktion von Aflatoxin- und Phytoalexinfraktionen. (A) Sterilisieren von getränkten Samen mit 3 % Wasserstoffperoxid; (B) Entfernen der Testa (Haut) von Samen; (C) Abschneiden des embryonalen Achsenteils; (D,E) Bohren eines Hohlraums in einem halben Keimblatt mit einem Bohrer; (F) Platzieren von gedrillten Teilen von Samen auf Agar; (G) Auftragen von Pilzsporen in den gebohrten Hohlraum. (H) Petrischale mit Samen nach der Inkubation; I) Einbringen von inkubierten Einzelsamen (Foto von Kontrollproben) in verstärkte Perlröhrchen; (J) Zugabe eines abgemessenen Volumens des Extraktionslösungsmittels; (K) Pulverisieren von Proben in einem Bead-Ruptor; (L) Zentrifugation der pulverisierten Gülle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="6"><li>Legen Sie die Samen auf ein steriles Papiertuch, entfernen Sie die Samentesta mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einem Skalpell etwa 1/3 des Samens mit der Embryonalachse ab (Abbildung 2B,C).</li>
	<li>Entsorgen Sie diesen Teil des Samens oder verwenden Sie ihn, um eine Pflanze in einem Reagenzglas mit Wachstumsmedium zu züchten (Abbildung 1B,E).</li>
	<li>Teilen Sie den restlichen Teil des Samens in zwei Keimblätter, legen Sie sie in eine Petrischale, decken Sie die Samenteile mit feuchtem sterilem Filterpapier ab, setzen Sie den Deckel wieder auf, um eine Austrocknung zu vermeiden, und fahren Sie sofort mit dem Impfschritt fort.</li>
	<li>Bereiten Sie vor der Durchführung der anspruchsvollen Experimente eine ausreichende Anzahl von Petrischalen mit Keiminkubationsmedium vor, indem Sie 26 mL 1,5% sterilen Agar in Wasser in die 100 x 15 mm großen Schalen gießen und über Nacht erstarren lassen.</li>
	<li>In der Mitte der Außenseite jedes verbleibenden Keimblattes einen 1,5 bis 2 mm tiefen Hohlraum bohren, indem Sie das Saatgut manuell mit einem sterilen, scharfen Bohrer mit einem Durchmesser von 1,6 bis 2,34 mm bohren. Es dauert ~2-5 s, um einen Hohlraum herzustellen (Abbildung 2D,E).</li>
	<li>Legen Sie 4 bis 6 "gebohrte" Stücke der Samen in eine Petrischale mit Agar und geben Sie 2 μL der 1.000 Sporen/μl Suspension mit einer 10 μl Pipette in den gebohrten Hohlraum jedes halben Keimblattstücks. Anstelle der Sporensuspension steriles Wasser auf die Kontrollsamen auftragen (Abbildung 2F,G).</li>
	<li>Alle Petrischalen mit Deckeln abdecken und bei 30 °C ohne Licht 72 h inkubieren.</li>
</ol>2. Probenahme und Vorbereitung der inkubierten Samenstücke für die Aflatoxin- und Phytoalexin-Analyse
<ol><li>Sammeln Sie Samenstücke nach 72 Stunden, indem Sie sie mit einer Pinzette aus dem Agar entfernen und in beschriftete 7-ml-Kügelchen mit 13 Zirkoniumkeramikkügelchen (12 mit einem Durchmesser von 2,8 mm und 1 mit einem Durchmesser von 6,5 mm) legen (Abbildung 2H,I). HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Fläschchen, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden, in einen -80 °C-Gefrierschrank gestellt und bis zu 2 Monate aufbewahrt werden, bevor sie weiterverarbeitet werden.</li>
	<li>Phytoalexine und Aflatoxine werden im selben Samenextrakt bestimmt. Für die Extraktion werden je nach sichtbarer Samengröße (klein, mittel oder groß) 2 oder 4 mL eines genau abgemessenen Methanol-Wasser-Gemisches (90:10, v/v) in die Bead-Vials gegeben und 45 s lang mit 5,5 m/sec pulverisiert. Die Fläschchen mit den pulverisierten Samen in eine Zentrifuge geben und 3 Minuten lang bei 1.860 × g zentrifugieren (Abbildung 2J - L). HINWEIS: Die folgendenwichtigen 17,22 Stilbenoidderivate werden bestimmt (alle in trans-Konfiguration): Resveratrol, Arachidin-1, Arachidin-2, Arachidin-3, 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben (IPD) und SB-1.</li>
	<li>Für Aflatoxinanalysen ist vor der Durchführung der anspruchsvollen Experimente eine ausreichende Anzahl von Aufreinigungssäulen wie folgt vorzubereiten. Legen Sie eine passende poröse (20 μL) Polyethylenfritte mit Hilfe einesim 90 °-Winkel geschnittenen Glasstabes in eine 1,5 mL Polypropylen-Säule. Geben Sie 50 mg des Magnesium-Kieselgels (100-200 mesh) mit einer speziell angefertigten Schaufel in die Säule und verschließen Sie die Säule mit einer identischen Fritte, indem Sie sie mit einem Glasstab nach unten drücken (Abbildung 3A - E). HINWEIS: Diese Menge an Magnesium-Kieselgel nimmt ein Volumen von 75 μl ein und die Höhe der Adsorptionsschicht beträgt 3 mm.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg"> Abbildung 3: Vorbereitung der Reinigungskolonnen und Filter. (A,B) Einbringen einer porösen Fritte in das Fass; (C,D) Füllzylinder mit Magnesium-Kieselgel; (E) Verpacken des Adsorptionsmittels und Einbringen einer oberen porösen Fritte in das Fass. (F) Platzieren eines Glasfaserkreises mit einem Durchmesser von 11,5 mm auf einer Pasteur-Pipette. (G,H) Schieben Sie die Mitte des Kreises mit einem Kunststoff- oder Holzstab auf den Boden des Pasteur-Pipettenzylinders und verdichten Sie die Glasfaser fest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="4"><li>Bereiten Sie an dieser Stelle eine entsprechende Anzahl von benutzerdefinierten Filtern vor, wie in Abbildung 3F - H gezeigt.</li>
	<li>Für Aflatoxinanalysen messen Sie genau bis zu 0,5 ml Aliquot des Überstands (erhalten wie in Schritt 2.2 beschrieben), überführen Sie es in die speziell verpackte Minisäule und lassen Sie den Extrakt durch Schwerkraft in ein 4-ml-Glasfläschchen abtropfen. Übertragen Sie 1,0 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10, v/v) in die Säule, um Verunreinigungen durch Schwerkraft in dasselbe 4-ml-Fläschchen auszuwaschen (Abbildung 4A).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg"> Abbildung 4: Reinigung von Samenextrakten und Vorbereitung für die UPLC-Analysen. (A) Gestell mit gepackten Säulen. (B) Verdampfen des Lösungsmittels mit N2 -Gas aus sechs 4-ml-Fläschchen mit gereinigtem Extrakt, der aus Reinigungssäulen eluiert wird. (C) Fläschchen und Filter in Schaumstoffbehältern (1 und 2) mit Eis vor und nach Zugabe des Injektionslösungsmittels (MeOH-H2O 9:1, v/v) zu den 4-ml-Fläschchen auf eine Temperatur unter Null bringen. (D) Filtrieren von gekühltem Extrakt aus einem 4-ml-Fläschchen in ein 400-μl-Autosampler-Fläschchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="6"><li>Verwerfe die kombinierten Eluate. Die Aflatoxinfraktion durch Schwerkraft aus der Säule in ein sauberes 4-ml-Glasfläschchen mit einem Gemisch aus 1,2 ml Aceton-Acetonitril-Wasser-88 % Ameisensäure (65:31:3,5:0,5, v/v) eluieren (Abbildung 4A).</li>
	<li>Alternativ können Sie Aflatoxine aus der Säule mit 2,0 ml Acetonitril-Wasser-88%iger Ameisensäure (96:3,5:0,5, v/v) eluieren und ein Aliquot des Eluats, bis zu 2 μl, direkt in das Ultra-Performance-Flüssigchromatographie-System (UPLC) injizieren (ohne Verdampfung des Lösungsmittels mit N2). HINWEIS: In diesem Fall ist mit einer bis zu 10-fach niedrigeren Quantifizierungsgrenze für Aflatoxine zu rechnen; In den meisten Fällen ist ein solcher Abfall der Empfindlichkeit akzeptabel, da die Aflatoxinkonzentrationen im beanstandeten Saatgut oft hoch sind.</li>
	<li>Das Lösungsmittel wird in einem Strahl von N2 in einem erhitzten Block bei 45 °C aus den Durchstechflaschen entfernt. Verschließen Sie das Fläschchen und stellen Sie es für 30-45 s in einen Behälter mit zerstoßenem Eis, um die Verdunstung des Lösungsmittels, das im folgenden Schritt hinzugefügt wird, zu minimieren. Legen Sie speziell angefertigte Filter in Einweg-Reagenzgläser und setzen Sie die Röhrchen in Eis in einem anderen Behälter ein, um die Verdunstung des Lösungsmittels während der Filtration zu minimieren (Abbildung 4B, C).</li>
	<li>Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels den trockenen Rückstand in genau dosierten 0,25-1,0 mL Methanol-Wasser-Gemisch (90:10, v/v) auflösen und 1-2 s lang vortexen. Legen Sie die Fläschchen mit den gereinigten Extrakten in den UPLC-Autosampler und injizieren Sie 0,1 bis 3,0 μl in das UPLC-System (Abbildung 5A,B). HINWEIS: Wenn der Verdacht besteht, dass die Lösung nach dem Vortexen Schwebstoffe enthält, filtrieren Sie die Lösung durch den gekühlten Filter (Abbildung 4D).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg"> Abbildung 5: Der Prozess und die Ergebnisse der UPLC-Analysen von gereinigten Extrakten. (A) Platzieren eines Racks mit gereinigten Probenextrakten in den UPLC-Autosampler. (B) Durchführung der instrumentellen Analysen, Datenbeschaffung und Interpretation der Ergebnisse. (C) UPLC von vier wichtigen Aflatoxinen; die wichtigsten Peaks von Interesse, die Aflatoxine B1 und B2 , repräsentieren 0,04 bzw. 0,004 ng. d) UPLC der Aflatoxine B1 und B2, Peak 2 repräsentiert Aflatoxin B1 auf einem 2 pg-Niveau (mit einer 8 μL Durchflusszelle). (E) UPLC von gereinigtem Extrakt aus einem Samen, der von einem lokalen Erdnussfeld mit einer wilden Arachis-Art geerntet wurde. (F) UPLC des Extrakts eines angegriffenen Erdnusssamens, der mit einer basischen Aluminiumoxid-Minisäule gereinigt wurde. (G) UPLC des Extrakts aus befallenen Erdnusskernen, der mit einer Florisil-Säule gereinigt wurde; Das blaue Chromatogramm zeigt Verunreinigungen, die mit 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10 V/V) aus der Säule gewaschen werden. Das schwarze Chromatogramm zeigt die Peaks der Aflatoxine M1 und B1. Der Gehalt an Aflatoxin B1 beträgt 48 ng/g. (H) Ein typisches Chromatogramm von Erdnuss-Stilbenoiden aus einem angegriffenen Samen; Abkürzung: IPD = 3′-Isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben. Hinweis: Alle Stilbenoide in Samenextrakten sind in trans-Konfiguration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> 
<ol start="10"><li>Für Phytoalexin-Analysen werden aus jedem Kügelchenfläschchen 200 μl Überstand in den oben genannten Pasteur-Pipettenfilter übertragen. Verwenden Sie N2 -Gas aus einem komprimierten Stickstofftank, um die Filtration in ein 400 μl UPLC-Autosampler-Fläschchen zu beschleunigen, und verschließen Sie das Fläschchen mit einer passenden Kappe mit einem PTFE-Septum (Abbildung 4D).</li>
</ol>3. Aflatoxin-Analysen
<ol><li>Für die Trennung von Aflatoxinen in Samenextrakten verwenden Sie ein UPLC-System, das mit einem Autosampler, einer quaternären Pumpe, einem Fluoreszenzdetektor, einer UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, 1,7 μm Säule mit passender Vorsäule und einem photochemischen Nachsäulenreaktor (PHRED) mit einer gestrickten Standard-PTFE-Spule mit 0,25 Innendurchmesser ausgestattet ist, die auf 25 % ihrer ursprünglichen Länge geschnitten ist. HINWEIS: Das UPLC-Gerät und die zugehörigen Geräte, die von den Autoren verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie Wasser (A), Methanol (B) und Acetonitril (C) in folgendem Gradienten: Anfangsbedingungen, 62,7 % A, 24 % B, 13,3 % C, linear geändert auf 30 % A, 45 % B, 25 % C in 3,75 min, geändert auf 0 % A, 64,4 % B, 35,6 % C in 3,751 min, isokratisch gehalten für 3,249 min, dann in 0,01 min auf Anfangsbedingungen geändert und vor der nächsten Injektion 2,499 min isokratisch gehalten. Stellen Sie die Flussrate auf 0,45 mL/min und die Laufzeit auf 9,5 min ein. Halten Sie die Säule auf 40 °C in der Säulenheizung des Systems. Verwenden Sie 362 nm bzw. 440 nm als Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen für die Quantifizierung der Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1 . Die Strukturen der wichtigsten Aflatoxine sind in Abbildung 6A dargestellt. HINWEIS: Unter den Versuchsbedingungen ist davon auszugehen, dass nur die Aflatoxine B1 und B2 von A. flavus NRRL 3357 produziert werden. Wenn ein A. parasiticus-Stamm für die Saatgutherausforderung verwendet wird, ist die Produktion der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 zu erwarten.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentrationen von Aflatoxinen unter Bezugnahme auf die Peakbereiche entsprechender authentischer Standards (Kalibrierkurve), wie in der Bedienungsanleitung der Software beschrieben. HINWEIS: Da das UPLC-Verfahren bei den hohen Empfindlichkeitseinstellungen für den Fluoreszenzdetektor ein Basisrauschen aufweist, werden die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für Aflatoxine unter Verwendung des weithin akzeptierten Signal-Rausch-Verhältnisses von 3:1 für LOD und 10:1 für LOQ bewertet. In dem in den Abschnitten 2 und 3 beschriebenen routinemäßigen Versuchsaufbau für die Analyse von Erdnusskernen wird erwartet, dass die Bestimmungsgrenzen für die Aflatoxine G1 und B1 kleiner oder gleich 0,8 ng/g für die Aflatoxine G2 und B2 sind.</li>
</ol>4. Stilbenoid-Phytoalexin-Analysen
<ol><li>Zur Trennung von Stilbenoiden verwenden Sie Wasser (A), Methanol (B) und 88 % Ameisensäure (C) in folgendem Gradienten: Anfangsbedingungen, 53 % A, 42 % B, 5 % C, linear geändert zu 35 % A, 60 % B, 5 % C in 2,0 min, isokratisch gehalten für 4 min, geändert zu 0 % A, 95 % B, 5 % C in 0,5 min, isokratisch gehalten für 2,5 min, wechselte dann in 0,1 min zu den Anfangsbedingungen und hielt isokratisch für 2,9 min vor der nächsten Injektion. Stellen Sie die Flussrate auf 0,5 mL/min und die Laufzeit auf 12,0 min ein.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentrationen von Stilbenoiden unter Bezugnahme auf Peakbereiche entsprechender authentischer Standards (Kalibrierkurve) und/oder auf veröffentlichte Koeffizienten der molaren Extinktion, wie im Benutzerhandbuch der Software beschrieben. Die Strukturen der wichtigsten aus Stilben gewonnenen Phytoalexine sind in Abbildung 6B dargestellt. HINWEIS: Die Trennung von Phytoalexinen erfolgt mit dem gleichen System, jedoch ohne Fluoreszenzdetektor und PHRED-Reaktor. Stattdessen wird ein Diodenarray-Detektor für den Nachweis und die Quantifizierung von Erdnuss-Stilbenoiden verwendet. Die Bestimmungsgrenze (LOQ) für die wichtigsten Stilbenoid-Phytoalexine hat keine praktische Bedeutung, da die Stilbenoidkonzentrationen die Konzentrationen von Aflatoxinen im selben Extrakt um einige Größenordnungen übersteigen; Nach 3 Tagen Inkubation sind die Stilbenoide zuverlässig quantifiziert.</li>
</ol>

Bewertung der Resistenz von wilden Erdnussarten gegen Aflatoxinakkumulation

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<li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aflatoxicosis+in+developing+countries%3A+a+review+of+toxicology%2C+exposure%2C+potential+health+consequences%2C+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen28 haben wir ein einfaches, kostengünstiges, umweltfreundliches, chemisches Verfahren entwickelt, das sich für die Erforschung von wilden Arachis-Keimplasmasammlungen eignet, um gegen Aspergillus resistente Arten zu identifizieren und neue Quellen genetischer Resistenz gegen diesen opportunistischen Pilz zu bestimmen und zu charakterisieren. Diese Methode basiert auf der Aufreinigung von Samenextrakten durch eine Festphasenextraktionstechnik (SPE) und der Aflatoxinquantifizierung durch Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) und zeichnet sich durch eine ausreichend hohe Wiederfindung, Präzision und Genauigkeit aus. Die vorgeschlagene "Florisil"-Methode ist eine Modifikation des Ein-Minisäulen-Reinigungsverfahrens, das auf der einzigartigen Eigenschaft von Florisil (Magnesium-Kieselgel) basiert, Aflatoxine stark und selektiv zurückzuhalten28. Wie bei der ursprünglichen Methode wurden die Samenproben mit einem MeOH-H2O-Gemisch extrahiert, jedoch in einem anderen Verhältnis von 90:10 (v/v) als das veröffentlichte 80:20 (v/v). Diese Änderung hat die Durchflussrate von Lösungsmitteln durch die Reinigungssäule um das 2,5-fache bei gleicher Aflatoxin-Rückgewinnungsrate erhöht. Dieses Methanol-Wasser-Gemisch von 90:10 (v/v) lieferte eine nahezu 100%ige Rückgewinnung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2, die der Extraktion von Lösungsmitteln in Spike-Konzentrationen zugesetzt wurden, die 5-50 ng Aflatoxinkonzentrationen in 1 g eines Substrats entsprachen, und lieferte eine ausreichend hohe Wiederfindung aus den mit Stacheln versetzten Erdnusssamenproben (Tabelle 1).
Es wurde gezeigt, dass Aflatoxine aus dem Florisil-Adsorptionsmittel nur mit großen Mengen an Aceton30, Aceton-Methanol 31,32 und Aceton-Wasser-Gemischen 33,34,35,36 eluiert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Forschung haben wir entdeckt, dass sich angesäuertes Acetonitril in seiner Fähigkeit, Aflatoxine aus Florisil zu eluieren, ähnlich wie Aceton verhält. Unseres Wissens ist diese Eigenschaft von Acetonitril in der Literatur nicht bekannt. Die Entdeckung dieser Eigenschaft ermöglicht es, gereinigten Extrakt direkt in das UPLC-System zu injizieren, ohne den Lösungsmittelverdampfungsschritt zu unterbrechen, was die Vorbereitungszeit erheblich verkürzt. Selbst wenn Acetonitril mit Aceton (Aceton-Acetonitril-Wasser-88% Ameisensäure (65:31:3,5:0,5, v/v)) gemischt wurde, ermöglichte es eine reibungslose, vollständige und schnelle Entfernung von Wasser aus den gereinigten Eluaten, wodurch die Verdampfungszeit des Lösungsmittels erheblich verkürzt wurde. Das Vorhandensein von Acetonitril ermöglichte die Verwendung eines einzigen Lösungsmittel-Methanol-Wasser-Gemisches (90:10, v/v), um Verunreinigungen effektiv aus der Florisil-Säule zu entfernen, verglichen mit einer veröffentlichten Methode, bei der zwei zusätzliche Waschlösungsmittel, Methanol und Chloroform-Methanol-Gemisch, erforderlich waren. 28
Im Durchschnitt betrug die Standard-Wiederfindung von Aflatoxin B1 ~98%, wenn 1,2 ml für die Elution von Aflatoxinen verwendet wurden. Die Menge von 50 mg Florisil wurde so gewählt, dass 1,2 ml des Elutionslösungsmittels die Minisäule bis zum oberen Rand des Zylinders füllten und gleichzeitig eine zufriedenstellende Wiederfindung ergaben (Tabelle 1). Dieser Ansatz beschleunigt das Reinigungsverfahren, da das Säulenfass nur einmal gefüllt werden muss. In der Anfangsphase dieses Projekts war nicht klar, ob eine kommerzielle Florisilfraktion mit einer relativ großen Partikelgröße von 100-200 mesh für eine kleine Säule geeignet wäre, die nur eine 3 mm dicke Schicht des Adsorptionsmittels enthält. Aus diesem Grund untersuchten wir verschiedene Florisil-Fraktionen, die aus einem kommerziellen Produkt mit 100-200 Mesh unter Verwendung der US-amerikanischen Standard-Reagenziensiebe 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 und >400 Mesh gewonnen wurden. Alle diese Fraktionen lieferten reproduzierbare, nahezu übereinstimmende Ergebnisse mit zufriedenstellender Wiederfindung. Obwohl kleinere Fraktionen mit Partikelgröße unter UV-Licht schmalere Aflatoxinbanden in der Säule aufwiesen, waren diese Fraktionen in keiner Weise dem kommerziellen Produkt mit 100-200 Mesh überlegen. Darüber hinaus zeigte die 100-200-Mesh-Fraktion die kürzesten Elutionszeiten (8-12 min) für das gesamte Verfahren.
Die Gradienten-UPLC-Lösungsmittelzufuhr ermöglichte eine zufriedenstellende Trennung von Aflatoxinen sowie die vollständige Entfernung unpolarer Verunreinigungen aus der Säule (Abbildung 5G). Dieser Ansatz führte zu einem einwandfreien Betrieb der Säule und reproduzierbaren Ergebnissen der Analysen von Hunderten von Proben. Die Identität der aus der Florisil-Säule eluierten Aflatoxine wurde wie zuvor beschrieben bestätigt. 28 Die hier verwendete analytische UPLC-Säule mit einem Durchmesser von 3 mm zeigte eine höhere Selektivität und eine zuverlässigere Trennung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 bei höheren Konzentrationen im Vergleich zur Säule mit einem Durchmesser von 2,1 mm derselben Chemie. Darüber hinaus war die Langlebigkeit der 3-mm-Säule (über 1.200 Injektionen) wesentlich höher als die der 2,1-mm-Säule (bis zu 800 Injektionen). Obwohl die 3-mm-Säule eine höhere Rate der mobilen Phase erforderte (40% mehr), wurde dieser Nachteil durch die oben genannten Vorteile der Säule übertroffen.
Die Florisil-Minisäule erwies sich als wirksam für die Reinigung von Extrakten aus Erdnusssamen, die stark mit Aspergillus-Metaboliten kontaminiert waren (Abbildung 5G); Solche Samen enthielten auch einen hohen Gehalt an Stilbenoid-Phytoalexinen, die von den Samen als Reaktion auf die Pilzinvasion produziert wurden. Alle diese Verunreinigungen können die Aflatoxinkonzentration in den Samen um das 10-bis 6-fache22 überschreiten, was diese Samen zu schwierigen Objekten für Aflatoxinanalysen macht. Abbildung 5G zeigt das Fehlen von störenden Peaks im Chromatogramm innerhalb der Aflatoxin-Retentionszeiten, was den Aflatoxinnachweis und die Quantifizierung auf allen getesteten Ebenen kompromisslos machte (Tabelle 1). Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, waren die Genauigkeit und Präzision der Methode innerhalb des getesteten Bereichs von 1,0-50,0 ng/g, der auch der kritischste Bereich für den Aflatoxin-Nachweis ist, ausreichend hoch. Die Wiederfindungsraten auf verschiedenen Ebenen für verschiedene Wilderdnuss-Genotypen waren einheitlich und die Standardabweichungen für fünf verschiedene Extraktionen waren im Wesentlichen gering.
Die Methode wurde auch an Erdnuss-, Baumwoll-, Mais- und Reissamen getestet, die auf natürliche Weise von null bis zu extrem hohen Konzentrationen von über 10.000 ng/g Gesamtaflatoxinen kontaminiert waren. Die Wiederfindung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 aus Mais, Baumwollsamen und Reis im Bereich von 5 ng/g schwankte zwischen 76,1 % und 93,7 %, 77,1 % bis 86,6 % bzw. 90,5 % bis 96,2 %. Die höchste Rückgewinnung von Aflatoxinen aus Reis ging einher mit der "Reinheit" des Eluenten, d.h. praktisch dem Fehlen jeglicher Verunreinigungen. Darüber hinaus stellte Reis mit durchschnittlich 19 mg/Saatgut das kleinste getestete Einzelobjekt dar.
Die Gesamtvorbereitungszeit für einen einzelnen Erdnusskern (einschließlich Schälen, Wiegen, Extraktion, Zentrifugation und Reinigung) mit einer Florisil-Säule betrug nicht mehr als 20 Minuten. Die Kosten für die Florisil Minisäule sind >10x niedriger als die für kommerzielle Reinigungssäulen. Zusätzliche Einsparungen ergeben sich aus der Verwendung geringerer Volumina an Adsorbentien, Lösungsmitteln und Stickstoffgas im Vergleich zum veröffentlichten Verfahren28. Die Minisäule benötigt keine Pump- oder Vakuumvorrichtungen, um zu funktionieren, und hat eine unbegrenzte Haltbarkeit.
Die Untersuchung von pflanzlichem Keimplasma auf Resistenz gegen Aflatoxine ist außerordentlich schwierig, da die Mykotoxinakkumulation nicht einer Normalverteilung folgt37,38; Um dieses Phänomen zu überwinden, ist eine große Anzahl von Aflatoxin-Analysen in einzelnen Samen erforderlich. Neben dem Aflatoxingehalt sind Informationen über die quantitative Phytoalexinzusammensetzung sehr wertvoll, da eine große Menge an Informationen aus einem einzigen Samen gewonnen und auf eine bestimmte Pflanze (Abbildung 1E) zurückgeführt werden kann. Die Methode wurde erfolgreich für das Screening von Hunderten von Akzessionen eingesetzt, darunter Landrassen, fortschrittliche Zuchtlinien und Elite-Erdnusssorten. Die Methode wird für den Einsatz in Erdnussvorzucht- und -züchtungsforschungsprogrammen empfohlen und kann bei der Charakterisierung von Erdnussgenen für Pilzresistenz helfen.

Erdnuss (Arachis hypogaea L.) ist eine der wichtigsten Nahrungspflanzen der Welt. Er wird in mehr als 100 Ländern angebaut und hat eine Gesamtproduktion von mehr als 45 Millionen Tonnen1. Landwirtschaftliche Rohstoffe wie Erdnüsse, Mais und Baumwollsamen werden oft von Aspergillus-Arten befallen, bodenbürtigen Pilzen, die Aflatoxine produzieren2. Diese Rohstoffe sind besonders anfällig für eine Aflatoxinkontamination vor der Ernte, wenn die Umweltbedingungen durch hohe Temperaturen und Trockenheit gekennzeichnet sind. Aflatoxine gehören zu den stärksten bekannten Karzinogenen3. Sie kontaminieren ein Viertel der landwirtschaftlichen Rohstoffe der Welt4 , so dass etwa die Hälfte der Weltbevölkerung chronisch Aflatoxinen ausgesetzt ist5. Aufgrund ihrer hohen Karzinogenität und Toxizität wird das Vorhandensein von Aflatoxinen in Lebensmitteln in den meisten Ländern der Welt auf die niedrigsten praktisch akzeptablen Grenzwerte reguliert6.
Die Europäische Union (EU) hat einen Höchstgehalt von 2 ng/g für Aflatoxin B1 und 4 ng/g für Gesamtaflatoxine (B1, B2, G1 und G2) in Lebensmitteln festgelegt7. Diese niedrigen Grenzwerte setzen die Landwirtschaft und die Lebensmittelindustrie, die mit Aflatoxinen kontaminierte Rohstoffe verarbeitet, unter erheblichen Druck. Die Aflatoxinüberwachung und die Wiederaufbereitung kontaminierter Erdnüsse kann als passive und kostspielige Strategie angesehen werden, um zu verhindern, dass Aflatoxine in die Nahrungskette gelangen. Aus diesem Grund erleiden alle wichtigen Segmente der Erdnussindustrie enorme Gewinnverluste aufgrund der Aflatoxinkontamination der aktuellen Erdnusssorten, die oft eine begrenzte Resistenz gegen Pilzkrankheiten aufweisen. Ein prospektiver Ansatz zur Lösung des Aflatoxinproblems besteht darin, pilzresistente Erdnusssorten durch Genintrogression zu erhalten, d.h. die Übertragung genetischer Informationen von resistenten wilden Erdnussarten auf Elitesorten. In den letzten Jahren 8,9 wurden wilde Erdnussarten als Quellen für genetische Krankheitsresistenz in erheblichem Umfang in Betracht gezogen, da die schmale genetische Basis der kultivierten Erdnüsse der Erdnusspflanze nicht mehr das erforderliche Maß an Resistenzmerkmalen bieten kann10,11. Eine erfolgreiche Introgression von wilden Erdnussarten erfordert die Analyse von Tausenden von einzelnen kleinen und seltenen Samen (Abbildung 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm der Einzelsamenanalyse. (A) Vergleichende Größe verschiedener markttypischer Erdnusssorten im Vergleich zu wilden Arachis spp. (1) Virginia; (2) Läufer; (3) Spanisch; (4) wilde Arachis spp. (B) wilde Arachis spp. (Tafel A, Samen 4) in drei Abschnitte geschnitten, (5) halber Samen mit embryonaler Achse; dieser Teil des Samens wird verwendet, um eine Pflanze zu züchten (E). (C) Die Teile (6) und (7) werden mit einem Bohrer gebohrt und (D) mit Pilzsporen beimpft. Nach einer Inkubation von 72 Stunden bei 30 °C wird einer der Samenteile (6) oder (7) für Aflatoxin- und Phytoalexinanalysen und ein anderer für die RNA/Transkriptom-Sequenzierung verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Resistenz von Erdnüssen gegen pilzliche Krankheitserreger ist stark mit Phytoalexinenassoziiert 13,14,15,16,17. Erdnuss-Phytoalexine werden durch antimikrobielle Stilbenoide repräsentiert, die biosynthetisiert und in Pflanzengeweben akkumuliert werden, nachdem sie exogenen Reizen, insbesondere der Pilzinvasion, ausgesetzt sind 16,17,18. Die schnelle Akkumulation ausreichender Konzentrationen von Phytoalexinen am Ort der Pilzinvasion hemmt das Pilzwachstum und ist entscheidend für die Pflanzenabwehr 19,20,21. Der Erreger hört auf zu wachsen, wenn sich Phytoalexine zu hemmenden Konzentrationen anreichern16,22. Die Rolle von Stilbenoiden als Abwehrstoffe gegen aflatoxinische Pilze in Erdnüssen wurde vor über 30 Jahren in Feldversuchen untersucht13. Diese Experimente stützten eindeutig die Hypothese, dass Erdnuss-Stilbenoide ein entscheidender Resistenzfaktor für die Aflatoxinkontamination vor der Ernte sind. Diese Beweise beruhen auf der Tatsache, dass Stilbene auf natürliche Weise in feldgeschädigten Erdnüssen produziert werden; Stilbene zeigen eine bemerkenswerte biologische Aktivität gegen aflatoxinische Pilze; Und eine Aflatoxinkontamination in Samen wurde erst nachgewiesen, als Erdnüsse aufgrund dürrebedingter Samendehydrierung die Fähigkeit zur Phytoalexinsynthese verloren. Eine weitere Reihe von Feldexperimenten bestätigte den Zusammenhang zwischen der Phytoalexinproduktion und der Resistenz des Erdnussgenotyps gegenüber landwirtschaftlich wichtigen Erdnusskrankheiten17.
Ein besseres Verständnis des natürlichen Phytoalexin-basierten Mechanismus der Erdnussresistenz gegen Pilzinvasion ist eine vielversprechende Strategie zur Kontrolle der Aflatoxinkontamination15,17.Daher ist es wichtig, zusätzlich zu den Aflatoxin-Analysen die gleichen Samen quantitativ auf Phytoalexine zu analysieren. Dieser Mechanismus der Resistenz ist zwar noch nicht vollständig erforscht und verstanden, aber dennoch entscheidend für die Züchtung und genetische Veränderung von Erdnusspflanzen für neue pilzresistente Sorten23. Trotz der Existenz verschiedener analytischer Verfahren zur Aflatoxinbestimmung in verschiedenen Rohstoffen besteht nach wie vor ein Bedarf an einfachen Methoden für die spezifische Forschung, insbesondere wenn die traditionellen Methoden den analytischen und kostengünstigen Anforderungen nicht genügen. Die modernsten Reinigungsmethoden, die von der Erdnussindustrie, der Landwirtschaft und privaten Labors verwendet werden, sind Antikörper-basierte24- und Immunoassay-25-, 26- und 27-Geräte. Sie sind selektiv und empfindlich, aber wesentlich teurer als Minisäulen, die mit herkömmlichen Adsorbentien gefüllt sind. Außerdem sei keine dieser Methoden für die Analyse von Proben mit einem Gewicht von wenigen Milligrammen konzipiert worden. Basierend auf unseren früheren Forschungen zur analytischen Verwendung von mit Magnesium-Kieselgel (Florisil) gefüllten Minisäulen28 haben wir dieses Verfahren modifiziert, um den Anforderungen laufender und zukünftiger Vorzucht- und Zuchtprogramme gerecht zu werden.
Ziel dieser Arbeit war es, eine zerstörungsfreie, umweltfreundliche Methode mit mittlerem Durchsatz zur quantitativen Bestimmung von Aflatoxinen und Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen zu entwickeln. Eine solche Methode wurde entwickelt. Die Vorteile gegenüber veröffentlichten Methoden sind eine höhere Sensitivität, die Möglichkeit, Aflatoxine und Phytoalexine in einem einzigen Samenextrakt zu analysieren, das Fehlen des Wiegens von Proben und niedrigere Kosten dank kleinerer Mengen an Verbrauchsmaterialien. Das Flussdiagramm der integrierten Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die genetischen Analysen und andere Schritte werden in diesem Text erwähnt und in der Abbildung gezeigt, um die Bedeutung der vorgeschlagenen Methode und ihre Integration in das gesamte Verfahren zu verdeutlichen.

<table><tbody><tr><td>Aceton, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2,1 x 5 mm Van-Guard Vorsäule</td><td>Waters Corporation</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 3 x 100 mm Säule</td><td>Waters Corporation</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2,1 x 100 mm Säule</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td>186002352</tr><tr><td>Aflatoxine B1, B2, G1 und G2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9441-1VL</td><td>Lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Fläschchens in 5 ml Methanol auf, um 5 &; Mikro zu erhalten; g/mL für Aflatoxine B1 und G1 und 1,5 &micro; g/ml für B2 und G2</td></tr><tr><td>Aflatoxin B1 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6636-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin B2 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9887-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin G1 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin G2 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin M1 (10 & Mikro; g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>Agar, granuliert (2kg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumoxid basisch (60-325 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>Basalmedium</td><td>Murashige und Skoog</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24&nbsp;</td><td>Omni International</td><td>19-042E</td><td></td></tr><tr><td>Becher (1000mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>10001L</td><td></td></tr><tr><td>Becher (250mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000250</td><td></td></tr><tr><td>Becher (400mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>Becher (600mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>Klinge, Skalpell</td><td>Feder</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (LSE Compact)</td><td>Corning</td><td>Modell: 6755</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, Mikro</td><td>Corning</td><td>Modell: 6770</td><td></td></tr><tr><td>Keramikperlen (2,8 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>Keramikkugeln (6,5 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 7 series Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Kyocera</td><td>07896</td><td>1,6 mm</td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Kyocera</td><td>07357</td><td>2,0 mm</td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Kyocera</td><td>07985</td><td>2,34 mm</td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof)</td><td>Decon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Verdampfer, Stickstoff</td><td>organimation</td><td>11106</td><td>6-Positionen</td></tr><tr><td>Excel, Microsoft</td><td></td><td>Microsoft Office 365</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier (#4)</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapierschneider, Edelstahl (ID 11,5mm)</td><td>Unbekannt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier, Glasfaser</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>Flasche (2800mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>Florisil (100-200 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Integra Lifescience ( Miltex)</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure (88%, ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank (-80oC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>Trichter (15 x 80mm)</td><td>DWK Life Sciences (Kimax)</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan (mittel)</td><td>Caisson Labs&nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>Glasstab (maßgefertigt)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaswolle</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Griff, Skalpell&nbsp;</td><td>Feder</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>30%, zertifiziert ACS</td></tr><tr><td>Eiskübel, rund mit</td><td>Deckel Corning</td><td>432122</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Marke Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2" x 4,39 "</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Marke Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16,4" x 14,43</td></tr>" <tr><td>Laborkittel</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Säulengestell (maßgefertigt)</td><td>Maßgeschneiderter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer, Touch (Maxi-Mix II)</td><td>Thermolyne</td><td>37600 (Modell 231)</td><td></td></tr><tr><td>Nitril-Handschuhe&nbsp;</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffgas, komprimiert (ultra hochrein)</td><td>Jones Welding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papiertuch</td><td>Georgia-Pacific</td><td>20023 (D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>pH/ATC-Elektrode</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>PhCR Photochemischer Reaktor</td><td>Wasser (Vicam)</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>Pipette, Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9"</td></tr> <tr><td>Pipette (1 mL) (Referenz 2)</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer (10 &mu; L) (Referenz)</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen: 10 &mu; L, 200 &mu; L, 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer (200 & Mikro; L)(Ergofit)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-679</td><td></td></tr><tr><td>Teller, Petri (100x15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar (500g)</td><td>Becton Dickinson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>BD213400</tr><tr><td>Verstärktes Bead-Röhrchen (2 mL)</td><td>Omni International</td><td>19-660</td><td></td></tr><tr><td>Verstärktes Bead-Röhrchen (7 mL)</td><td>Omni International</td><td>19-651</td><td></td></tr><tr><td>Repipettor, Dispensette III (10 mL)</td><td>Brandtech</td><td>4701141</td><td></td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5010-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Scoop (custom)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlussdose (250 mL) &nbsp;</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1395250</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel, kugelförmig (200-400 mesh) &nbsp;</td><td>Supelco</td><td>97727-U</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SPE-Extrakt reinigt 1,5 ml Polypropylen-Säule</td><td>American Chromotography Supplies</td><td>SP-5122382</td><td></td></tr><tr><td>SPE-Extrakt saubere PP-Fritten (für 1,5 mL Minisäule)</td><td>American Chromotography Supplies</td><td>SP-3119414</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer, UV-sichtbar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-385-351 (Genesys 50)</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>982516X</td><td>16x125mm</td></tr><tr><td>Reagenzglas (Einweg)(16x125mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas (Einweg)(150x250mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-34</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish DAD-Detektor (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D11-A-01</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Fluoureszenz-Detektor (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D51-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish quaternäre Pumpe F (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-P20-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-A10-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (Polysorbat 20) (Enzymqualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchenkappen (4 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-75A</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchenkappen (Autosampler)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-60A</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen & Verschlüsse (16 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7800-4</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen, Glas (4 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-1</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen, Polypropylen (Autosampler) (400 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-11</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, Optima&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

zerstörungsfreie spe-uplc-basierte quantifizierung von aflatoxinen und stilbenoid-phytoalexinen in einzelnen erdnüssen (arachis spp.) samen

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

Aflatoxine sind stark krebserregende Sekundärmetaboliten einiger Pilzarten, insbesondere von Aspergillus flavus. Aflatoxine kontaminieren häufig wirtschaftlich wichtige landwirtschaftliche Rohstoffe, einschließlich Erdnüsse, und stellen ein hohes Risiko für die Gesundheit von Mensch und Tier dar. Aufgrund der schmalen genetischen Basis zeigen Erdnusssorten eine begrenzte Resistenz gegen pilzliche Krankheitserreger. Daher wurden zahlreiche wilde Erdnussarten mit Toleranz gegenüber Aspergillus von Wissenschaftlern als Quellen für Krankheitsresistenz in Betracht gezogen.
Die Untersuchung des pflanzlichen Keimplasmas auf Resistenz gegen Aflatoxine ist schwierig, da die Aflatoxinakkumulation keiner Normalverteilung folgt, was die Analyse von Tausenden von einzelnen Erdnusssamen erforderlich macht. Ausreichend hydratisierte Erdnusssamen (Arachis spp.) sind, wenn sie von Aspergillus-Arten befallen sind, in der Lage, biologisch aktive Stilbene (Stilbenoide) zu produzieren, die als defensive Phytoalexine gelten. Erdnussstilbene hemmen die Pilzentwicklung und die Aflatoxinproduktion. Daher ist es wichtig, die gleichen Samen auf Erdnuss-Stilbenoide zu analysieren, um die Art der Samenresistenz/-anfälligkeit für die Aspergillus-Invasion zu erklären. Keine der veröffentlichten Methoden bietet Einzelsamenanalysen für Aflatoxine und/oder Stilben-Phytoalexine.
Wir haben versucht, die Nachfrage nach einer solchen Methode zu erfüllen, die umweltfreundlich ist, kostengünstige Verbrauchsmaterialien verwendet und sensibel und selektiv ist. Darüber hinaus ist die Methode zerstörungsfrei, da nur die Hälfte des Samens verwendet wird und die andere Hälfte, die die Embryonalachse enthält, intakt bleibt. Eine solche Technik ermöglicht die Keimung und das Wachstum der Erdnusspflanze bis zur vollen Reife aus demselben Samen, der für die Aflatoxin- und Stilbenoidanalyse verwendet wird. Der integrierte Teil dieser Methode, das manuelle Anfechten der Samen mit Aspergillus, ist ein limitierender Schritt, der im Vergleich zu anderen Schritten der Methode mehr Zeit und Arbeit erfordert. Die Methode wurde für die Erforschung von wildem Arachis-Keimplasma verwendet, um Spezies zu identifizieren, die gegen Aspergillus resistent sind, und um neue Quellen für genetische Resistenz gegen diesen Pilzerreger zu bestimmen und zu charakterisieren.

Die entwickelte Methode zur Aflatoxin-Quantifizierung in Saatgut ist der Kern des gesamten Verfahrens zur Bewertung von wilden Erdnussarten auf Resistenz gegen Aflatoxinakkumulation. Speziell verpackte Minisäulen und Filter bieten erhebliche Einsparungen und vereinfachen das Gesamtverfahren aufgrund des Fehlens großer Mengen an Lösungsmitteln, teurer und unnötiger kommerzieller 0,22- oder 0,45-μm-Filter und Pumpvorrichtungen. Die Methode zur Aflatoxinanalyse bietet eine hohe Wiederfindung, Genauigkeit und Präzision innerhalb des getesteten Bereichs von 1,0-50,0 ng/g Aflatoxine aus gemahlenem Saatgut, wie in Tabelle 1 zu sehen ist. Stark kontaminierte Proben wurden auf den linearen Testwert verdünnt. Abbildung 5C zeigt eine Ausgangstrennung der vier wichtigsten Aflatoxine, B1, B2, G1 und G2 , innerhalb einer Elutionszeit von 5 Minuten, was akzeptabel ist, da die pilzliche Herausforderung von Erdnusssamen die begrenzende Phase des Verfahrens ist und nicht UPLC-Analysen.
Die vorgeschlagene Methode ist mit einer Bestimmungsgrenze von 2 pg für Aflatoxin B1 ausreichend sensitiv (Abbildung 5D). Die hohe Reinheit der Extrakte ermöglicht eine eindeutige Quantifizierung von Aflatoxinen, wie sie aus einem UPLC (Abbildung 5E) von gereinigtem Extrakt von Samen hervorgeht, die von einem Feld mit einer wilden Arachis-Art geerntet wurden. Eine früher veröffentlichte Minisäulenmethode29 ist nicht in der Lage, eine zufriedenstellende Reinheit für pilzgefährdete Erdnusssamen (Abbildung 5F) im Vergleich zu der vorgeschlagenen Methode (Abbildung 5G) zu erreichen. Aus Abbildung 5F ist ersichtlich, dass die AflatoxineB2, G1 und G2 aufgrund des Vorhandenseins hoher Konzentrationen von störenden Verunreinigungen, von denen viele, nach Aflatoxinen eluiert, Stilbenoid-Phytoalexine und Pilzmetaboliten sind, nicht zuverlässig nachgewiesen und quantifiziert werden können. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 5G die hohe Effizienz der Magnesium-Kieselgel-Säule bei der Entfernung von Verunreinigungen aus der Aflatoxinfraktion. Das blaue Chromatogramm zeigt störende Verunreinigungen, die mit 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10) aus der Säule gewaschen werden; Das schwarze Chromatogramm zeigt unverdeckte Peaks der Aflatoxine M1 und B1. Dieses Chromatogramm stellt den Extrakt aus dem Samen einer beanstandeten Wildart dar. Der Gehalt an Aflatoxin B1 beträgt 48 ng/g.
Die Quantifizierung von Erdnuss-Phytoalexinen ist eine wertvolle Ergänzung zur Analyse von Aflatoxinen im selben Samen, bei dem es sich um ein natürliches Saatgut von einem Feld oder ein pilzbefallenes Saatgut handeln kann. Abbildung 5H zeigt ein typisches Chromatogramm von Erdnuss-Abwehrstilbenoiden aus einem angegriffenen Samen. Die Trennung der Verbindungen erfolgt mit der gleichen analytischen Säule, die auch für Aflatoxinanalysen verwendet wird. Die Säule und die gewählten chromatographischen Bedingungen sorgen für eine zufriedenstellende Trennung der Peaks, was eine zuverlässige Quantifizierung der Stilbenoide ermöglicht. Die Bewertung der Aflatoxin-Phytoalexin-Beziehung in beanstandeten Samen würde den Rahmen dieser Präsentation sprengen und die Methode wird hier als potenzielles Forschungsinstrument vorgeschlagen, das seit mehreren Jahren im Labor der Autoren eingesetzt wird und sich als nützlich erwiesen hat.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> Abbildung 6: Strukturen der wichtigsten Aflatoxine und der von Stilben abgeleiteten Erdnuss-Phytoalexine. (A) Strukturen der wichtigsten Aflatoxine: 1, B1; 2, B2; 3, G1; 4, G2. (B) Strukturen der wichtigsten aus Stilben gewonnenen Erdnuss-Phytoalexine: 6, Resveratrol; 7, Arachidin-1; 8, Arachidin-2; 9, Arachidin-3; 10, IPD (3′-Isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">StachelStufe a (ng/g)</td>
			<td colspan="4">Aflatoxine</td>
		</tr><tr><td>B1</td>
			<td>B2</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Rückgewinnung von Aflatoxinen aus Erdnusssamen unter Verwendung der Florisil-Säule und 1,2 ml des Aflatoxin-Fraktionselutionsgemisches. [Mittelwert (SD), %; n = 5]. Aflatoxinfreie gemahlene Proben (50 g) der Erdnusssorte Georgia 06G wurden mit Hilfe einer Mikrospritze mit Aflatoxin-Stammlösung in einem Gehalt von 50, 5 oder 1 ng/g gleichmäßig versetzt und 16 h lang bei Raumtemperatur belassen. Für die AflatoxineB2 undG2 sollte der Multiplikationsfaktor von 0,33 verwendet werden.

Wir demonstrieren eine Methode mit mittlerem Durchsatz zur Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Diese Methode wurde speziell für die Analyse von wilden Arachis-Arten entwickelt, die von der aflaoxigenen Aspergillus-Art befallen sind.

Zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnüssen (Arachis spp.) Samen

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

Ziel der Forschung war es, eine Methode zur Quantifizierung von Aflatoxinen und defensiven Phytoalexinen in Tausenden von Erdnusssamen für die Erforschung von wildem Arachis-Keimplasma zu entwickeln, gegen Aspergillus resistente Arten zu identifizieren und neue Quellen genetischer Resistenz gegen diesen Pilzerreger zu bestimmen und zu charakterisieren. Unsere Forschungsgruppe hat herausgefunden, dass der vielversprechendste Ansatz zur Identifizierung von Erdnuss-Keimplasma, das kein Aflatoxin akkumuliert, darin besteht, eine ganzheitliche Analyse jedes einzelnen Samens durchzuführen, einschließlich seiner Transkriptomik, Genomik, Phytoalexine und Mykotoxinprofile. Wir haben Protokolle für die Analyse von wilden und kultivierten Erdnusssamen entwickelt, d. h. die Verwendung von 1/4 eines einzelnen Samens für die chemische Profilerstellung. Entwicklung von Hochdurchsatzmethoden für eine effektive Saatgutherausforderung, Extraktion und genaue Quantifizierung von Phytoalexinen in Erdnusssamenproben.Wir haben zahlreiche Erdnuss-Phytoalexine entdeckt und effiziente und kostengünstige Methoden zur Aflatoxinanalytik sowie zum Screening von Erdnusskeimplasma mit reduzierter oder keiner Aflatoxinakkumulation entwickelt. Zu den Methoden gehören die Genotypisierung und die Bestimmung der Lebensfähigkeit des Saatguts.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Wir zeigen, ein Verfahren zur Analyse von Aflatoxinen und die Transgen-Expression in Erdnusskerne, die die RNA-Interferenz-Signale zum Dämpfen Aflatoxin-Synthesegene in dem Pilz Aspergillus flavus enthalten. RNAi-vermittelte Kontrolle von Mykotoxinen in Pflanzen ist bisher nicht berichtet worden.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Wir haben es geschafft, eine Methode zur RNA-Isolierung aus Pflanzensamen zu etablieren, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen enthalten, die eine hemmende Wirkung auf die hochreine RNA-Isolierung haben. Unsere Methode eignet sich zur Überwachung der Expression von Genen mit niedrigen Transkripten in Saatgut.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Messung direkt Transfer-RNA laden Ebenen aus gereinigtem Escherichia coli RNA sowie eine Möglichkeit zum relativen Pegel der Transfer-RNA oder jede andere kurze RNA über verschiedene Proben, die basierend auf den Zusatz von Spike-im Vergleich Zellen mit dem Ausdruck eines Referenz-Gens.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Erfahren Sie die zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen. Diese Methode ermöglicht die Analyse wilder Arachis-Spezies und die Identifizierung resistenter Keimlinge gegen Aspergillus.

Zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnüssen (Arachis spp.) Samen (Video) | JoVE Journal

Zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnüssen (Arachis spp.) Samen

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