Name: In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Lernen Sie die in-situ-Nukleosomenassemblierung für Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht effiziente Chromatin-Studien mit reduziertem Reagenzienverbrauch und kürzerer Präparationszeit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>In situ Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekülstudien

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x HR Puffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; tris&nbsp; Acetat pH 7,5, 20 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumchlorid, 0,1 mg/mL BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 10 mM Natriumphosphat zweibasisch, 1,8 mM Kaliumphophat monobasisch&nbsp;</td></tr><tr><td>Essigsäure, Eissäure</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Zur Herstellung von Trisacetat</td></tr><tr><td>verwenden Biotin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Auflösen in H2O und laufen durch 0,22 μm Filter</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimid funktionalisiert Cy3 Fluorophor</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>Tischzentrifuge mit kühlendem</td></tr><tr><td>Ethylalkohol, Pure</td><td>Millipore Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>Lösen in H2O bis 0,5 M</td></tr><tr><td>Humanes Histon-Oktamer (H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Rekombinante Histonproteine und Proteine mit Markierungsmutationen wurden wie zuvor beschrieben im eigenen Haus gereinigt (siehe Ref. 33, 34, 35, 36). Kurz gesagt, rekombinante Histone wurden in BL21 (De3) pLySS-Zellen (Promega) exprimiert. Die Einschlusskörper wurden nach der Beschallung isoliert und die Histone unter denaturierenden Bedingungen extrahiert. Histone wurden in Puffer A dialysiert (7 M Harnstoff, 10 mM Trishydrochlorid pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol) und die Lösung wurde in eine Schwerkraftsäule gegeben, die mit Q Sepharose Fast Flow (Cytiva) beladen war. Der Durchfluss wurde dann in eine mit SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) beladene Schwerkraftsäule gegeben, und die Histone wurden durch Zugabe von Puffer A, der mit 600 mM Natriumchlorid ergänzt wurde, aus der Säule eluiert. Histone, die Markierungsmutationen beherbergen (H4, L50C; H2A, K119C) wurden gereinigt und dann über Maleimid-funktionalisierte Farbstoffe (Cytiva, Lumidyne) unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von 20:1 an das gewünschte Fluorophor konjugiert (siehe Ref. 33, 34). Histon-Oktamere wurden zusammengesetzt, indem ein gleiches molares Verhältnis jedes Wildtyp- oder Fluorophor-markierten Histons unter denaturierenden Bedingungen hinzugefügt wurde, in einen Puffer mit hohem Salzgehalt dialysiert wurde, der 2 M Natriumchlorid enthielt, und dann durch Größenausschlusschromatographie gereinigt wurden, wie zuvor beschrieben (siehe Ref. 36, 37). Alternativ können einzelne Histonproteine und fertige Histon-Oktamere kommerziell erworben werden (z.B. Epicypher).&nbsp;</td></tr><tr><td>Bildpuffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM Trishydrochlorid pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3' bis 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (Mutter-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Methylierungsfrei &lambda; DNA</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Maleimid-funktionalisiertes LD655 Fluorophor</td></tr><tr><td>Linker Histon H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aufgereinigtes rekombinantes Protein aus eigener Herstellung (siehe Ref. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap</td><td>Dymo LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Dual-Trap-Konfiguration; Standardmaterialien für das Instrument vom Hersteller zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>Zur Herstellung von HR-Puffer</td></tr><tr><td>verwenden NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Im Lieferumfang enthalten Klenow Fragment Kit</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>In H2O auflösen und durch 0,22 μm Filter laufen</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Zur Herstellung von PBS und HR-Puffer</td></tr><tr><td>verwenden Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>Zur Herstellung von PBS</td></tr><tr><td>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1 wurde wie zuvor beschrieben hausintern gereinigt (siehe Ref. 33, 34). Alternativ kann Nap1 im Handel erworben werden (z. B. Active Motif).</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>Lösen in H2O bis 3 M</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore</td><td>Sigma S9888</td><td>Zur Herstellung von PBS und Bildpuffer verwenden</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>Zur Herstellung von PBS</td></tr><tr><td>verwenden SPHERO Biotin beschichtete Partikel (3,0-3,4 & Mikro; m)</td><td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>In H2O auflösen und auf den entsprechenden pH-Wert einstellen; zur Herstellung von Bildpuffer und Trisacetat verwenden</td></tr></tbody></table>

in-situ-nukleosomenassemblierung für die einzelmolekül-korrelativkraft- und fluoreszenzmikroskopie

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Unter Verwendung des in Schritt 3 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 1A) wurde die Nukleosomenbildung entlang des DNA-Tethers als das Auftreten von rot fluoreszierenden Herden auf einem 2D-Scan (Abbildung 1B, links) oder die Trajektorien im Zeitverlauf auf einem Kymographen (Abbildung 1B, rechts) visualisiert. Richtig verpackte Nukleosomen ergaben Fluoreszenztrajektorien, die über die Zeit innerhalb der Beugungsgrenze der konfokalen Detektion (~300 nm) stationär waren. Bemerkenswert ist, dass mehrere Nukleosomen, die nahe beieinander unter der Beugungsgrenze gebildet werden, nicht räumlich aufgelöst werden können und als hellere Herde oder Trajektorien erscheinen. Nichtsdestotrotz wurden die Photobleichschritte einzelner nukleosomaler Trajektorien analysiert und zeigten häufig 1-stufige (Abbildung 1C) oder 2-stufige (Abbildung 1D) Photobleichereignisse, was darauf hindeutet, dass die Herde angesichts der etwa 70%igen Markierungsrate des H4-Proteins in dieser Probe hauptsächlich Mononukleosomen enthielten. Darüber hinaus wurde basierend auf der durchschnittlichen Photonenzahl für ein einzelnes LD655-Fluorophor in dieser experimentellen Bedingung die Anzahl der markierten H4-Kopien in jeder Nukleosomentrajektorie geschätzt und zeigte, dass die Nukleosomenloci überwiegend (&gt;75%) 1 oder 2 markierte H2A-Kopien enthielten (Abbildung 1E), was wiederum mit der Vorstellung übereinstimmt, dass sie hauptsächlich als räumlich getrennte Mononukleosomen geladen wurden. Die anderen helleren Herde enthielten mehr als 3 Kopien von markiertem H4, was wahrscheinlich mehrere Nukleosomen innerhalb der Beugungsgrenze darstellt.
Die Nukleosomenbildung wurde auch durch eine Erhöhung der Spannung entlang des Tethers überwacht, wenn die Positionen der OTs konstant blieben, da mehr DNA um Histon-Oktamere gewickelt wurde (Abbildung 1B, unten). In Abwesenheit von Nap1 können Histon-Oktamere immer noch DNA binden, bleiben aber größtenteils unverpackt, da die damit verbundene Spannung beim Halten der OT-Positionen konstant blieb (Abbildung 1F). Es ist möglich, dass eine unspezifische Bindung von Histon-Oktameren an die DNA auch in Gegenwart von Nap1 auftritt. In einem anderen Experiment wurde das gleiche Protokoll zur Bildung von Nukleosomen durchgeführt, die Cy3-markiertes H2A enthielten, das ähnliche Ergebnisse lieferte wie die mit LD655-markiertem H4 (Abbildung 1G), was auf die Assemblierung von intakten Oktameren zu Nukleosomen hinweist.
Unter Verwendung des in Schritt 4 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 2A) wurde das Auspacken von Nukleosomen im Laufe der Zeit auf einem Kymographen visualisiert, wenn der Tether-Abstand zunahm (Abbildung 2B). Es wurde bereits berichtet, dass Histon-Oktamere nach dem Auspacken oft an die DNA gebunden bleiben30,31, und daher bleiben fluoreszierende Trajektorien oft auch bei hohen Spannungen bestehen. Das Auspacken der Nukleosomen wurde auch auf der zugehörigen FD-Kurve überwacht (Abbildung 2C). Zu den quantifizierbaren Merkmalen der FD-Kurve gehören die Kraft, bei der sich Nukleosomen abwickeln (siehe "Übergang F" in Abbildung 2C) sowie die Länge der DNA, die aus dem Histon-Oktamer freigesetzt wurde (siehe "ΔL" in Abbildung 2C-Einschub), die in Vielfachen von ~24 nm vorliegt, was mit einer unabhängigen Enthüllung der inneren Windungen der DNA einzelner Nukleosomenübereinstimmt 27, 30. Urheberrecht Diese Parameter können verwendet werden, um die Anzahl der Nukleosomen zu schätzen, die an jedem Tether gebildet werden, oder für zusätzliche nachgelagerte Analysen der Nukleosomenmechanik. Daher wurde die Anzahl der Innenwindungsbrüche, die aus mechanischen Zugexperimenten gewonnen wurden, mit der geschätzten Anzahl markierter H4-Kopien an jeder Nukleosomenbahn auf der Grundlage der Monomerintensität verglichen, was zeigte, dass die Zahlen weitgehend konsistent sind (Beispiele in den Abbildungen 2D-G). Es wurde jedoch festgestellt, dass sie aufgrund der ~70%igen markierten Effizienz des H4-Proteins in der Probe und der verbleibenden Nap1-unabhängigen Histonbindung an die DNA, wie in Abbildung 1F gezeigt, nicht perfekt übereinstimmen. Schließlich führt das Dehnen von Nap1-gebundenen nackten DNA-Fesseln (ohne Histone) erwartungsgemäß nicht zu kraftinduzierten Übergängen (Abbildung 2H), was darauf hindeutet, dass Nap1 allein die DNA nicht signifikant verzerrt.
Unter Verwendung des in Schritt 5 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 3A) wurde die Bindung des Linker-Histons H1 an das Chromatin als das Auftreten von grün fluoreszierenden Herden entlang des Chromatin-Tethers sichtbar gemacht (Abbildung 3B). Bemerkenswert ist, dass H1-gebundene Nukleosomen zweifarbige Trajektorien erzeugten (siehe weiße Pfeile in Abbildung 3B), die im Laufe der Zeit stationär erschienen. Darüber hinaus wurde eine Diffusion von H1-Trajektorien über nukleosomenfreie DNA-Regionen beobachtet (siehe grüne Sterne in Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Abbildung 1: Nap1-vermittelte in situ Nukleosomenbildung. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Nap1-vermittelten in situ Nukleosomenbildungsprotokoll beschrieben ist (Schritt 3). Ein Paar Kügelchen wurde in Kapitel 1 optisch gefangen, und ein einzelnes λ-DNA-Molekül wurde durch die Biotin-Streptavidin-Bindung in Kapitel 2 zwischen den Kügelchen angebunden. Der Tether wurde dann in Kanal 4 verschoben, der LD655-markierte Histon-Oktamere (rot) und Nap1 für die Echtzeitbildung von Nukleosomen in der DNA enthält. (B) Repräsentativer 2D-Scan (links) und Kymograph (rechts) eines LD655-H4-markierten Nukleosomen-haltigen DNA-Bindeglieds. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) zeigt einen sofortigen Kraftanstieg, wenn das Leine auf Kanal 4 bewegt wird, wenn die OT-Positionen konstant gehalten werden, was auf eine Nukleosomenumhüllung hinweist. Hellere Trajektorien bedeuten mehrere benachbarte Nukleosomen, die sich innerhalb der Beugungsgrenze von ~300 nm befinden. (C) Beispiel-Kymograph, der ein 1-stufiges Photobleichereignis (weißer Pfeil) eines Nukleosoms zeigt, das LD655-H4 enthält. (D) Beispiel-Kymograph, der ein 2-stufiges Photobleichereignis (weiße Pfeile) eines Nukleosoms zeigt, das LD655-H4 enthält. (E) Relative Häufigkeit der Anzahl von LD655-markiertem H4 pro Trajektorie, geschätzt aus ihrer Fluoreszenzintensität. (F) Repräsentativer Kymograph eines mit Histon-Oktameren gebundenen Seils in Abwesenheit von Nap1. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) bleibt unverändert, auch wenn Histon-Oktamere an die DNA binden. (G) Repräsentativer Kymograph eines Cy3-H2A-markierten Nukleosomen-haltigen DNA-Bindeglieds. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) zeigt einen sofortigen Kraftanstieg, wenn der Tether zu Kanal 4 (mit Oktameren und Nap1) bewegt wird, da Nukleosomen gebildet werden, wenn die OT-Positionen konstant gehalten werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Abbildung 2: Nukleosomen-Unwrapping-Assay. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Unwrapping-Nukleosomen-Protokoll (Schritt 4) beschrieben ist. Der DNA-Tether, der die Nukleosomen enthält, wurde in Kanal 3 mit einem proteinfreien Bildpuffer verschoben, wo der Abstand zwischen den Kügelchen vergrößert und die Nukleosomen ausgewickelt wurden. (B) Repräsentativer Kymograph eines nukleosomenhaltigen DNA-Seils, das durch allmähliche Erhöhung des Abstands zwischen den Kügelchen zu hohen Kräften gezogen wird. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität in Richtung der unteren Perle war wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die DNA leicht aus dem Zeilenfokus kippte. (C) Die zugehörige FD-Kurve, die kraftinduzierte Übergänge der inneren Windungsenthüllung zwischen 8 und 37 pN zeigt. Der Einschub zeigt eine Zoom-Ansicht eines Beispielübergangs, für den die entpackte Distanz (ΔL = ~24 nm für die innere Drehung der DNA einzelner Nukleosomen) und die Übergangskraft (Transition F) aufgezeichnet und weiter analysiert werden können. Für diese Leine wurden 26 Nukleosomen ausgewickelt und die Leine riss bei ~65 pN, wie durch die weiße gestrichelte Linie im Kymographen gekennzeichnet. (D,E) Beispiel für ein LD655-H4-Nukleosomen-haltiges Seil, das zu hohen Kräften gezogen wird, wobei die Anzahl von H4 pro Trajektorie über die Fluoreszenzintensität geschätzt wird (im Kymographen angezeigt, D) und die Anzahl der umhüllten Nukleosomen über die Größe der kraftinduzierten Abstandsänderung geschätzt wird (angezeigt in der zugehörigen Kraft-Weg-Kurve, E). (F,G) Ein weiteres Beispiel wie in (D,E). (H) DNA-Fesseln (n = 5), die nach der Inkubation in einem Kanal, der nur Nap1 enthält, mit hohen Kräften gezogen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Abbildung 3: Visualisierung der Protein-Chromatin-Interaktion. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Protokoll zur Visualisierung der Proteinbindung an das Chromatin (Schritt 5) beschrieben ist. Der DNA-Tether, der die Nukleosomen enthält, wurde nach Ch. 5 verschoben, der 10 nM Cy3-markiertes Linker-Histon H1 (grün) enthält. (B) Repräsentativer zweifarbiger Kymograph der Bindung von H1 an einen Nukleosomen-haltigen DNA-Gurt. H1-Nukleosomen-Kolokalisationsereignisse sind mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. Die ungebundene Nukleosomenbahn ist mit dem magentafarbenen Pfeil gekennzeichnet. H1-Moleküle, die auf nackter DNA diffundieren, sind mit grünen Sternen gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

in-situ-nucleosome-assembly-for-single-molecule-correlative-force

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

In diesem Video demonstrieren wir statische Rasterkraftmikroskopie, um zusammengesetzte Nukleosomen zu visualisieren. Dieses hochauflösende bildgebende Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Nukleosomenstruktur.

Statische Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung und Charakterisierung von zusammengesetzten Nukleosomen

In diesem Video demonstrieren wir Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie, AFM und bildgebende Techniken, um die Dynamik von Nukleosomenkomplexen zu untersuchen. Während die AFM-Spitze über die Oberfläche des Nukleosoms scannt, erkennt sie Veränderungen in der Nukleosomenhöhe und zeichnet die DNA-Enthüllung im Laufe der Zeit auf.

Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung absoluter DNA-Dichten innerhalb adhärenter Zellkerne unter Verwendung der Voronoi-Tessellation von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiedaten, des bekannten Volumens, der Genomgröße und des Zellzyklusstadiums.

Kartierung der absoluten DNA-Dichte in Zellkernen mit Hilfe der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Dieses Protokoll bietet detaillierte Operationen zur Probenvorbereitung, Datenerhebung und Analyse von DNA-intrinsischen Fluoreszenzspektren.

Spektroskopische Superauflösungsbildgebung von DNA-Molekülen unter Verwendung von intrinsischem Kontrast

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.

Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Lernen Sie die in-situ-Nukleosomenassemblierung für Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht effiziente Chromatin-Studien mit reduziertem Reagenzienverbrauch und kürzerer Präparationszeit.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Weitere Videos entdecken