Name: Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Lernen Sie die optimierte Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht die dreidimensionale Rekonstruktion von Photorezeptor-Terminals in der Mausretina mittels FIB-SEM.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung von synaptischen Strukturen der Netzhaut in 3D mit Volumenelektronenmikroskopie

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Einbettform</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technologie</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon Harz</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i Zweistrahl-REM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Bleinitrat</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Eine Komponente des Phosphatpuffers</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Ein Bestandteil des Phosphatpuffers</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Elektronenmikroskopie</td><td></td><td>Wissenschaft 157-8</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Sputterbeschichter</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazid</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

präparation von netzhautproben für die volumenelektronenmikroskopie

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Abbildung 1A zeigt das Bild von retinalen Photorezeptorenden, die mit der traditionellen chemischen Doppelfixationsmethode präpariert wurden, und Abbildung 1B zeigt das Bild von retinalen Photorezeptorterminals, die mit der OTO-Methode präpariert wurden. Beide wurden mit dem FIB-SEM beprobt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Zellmembranstruktur mit der OTO-Methode so weit wie möglich erhalten bleiben kann, und sogar der Umriss von Vesikeln ist deutlich zu erkennen. Darüber hinaus ist auch der Kontrast von Bildern, die mit der OTO-Methode erhalten wurden, klarer.
Abbildung 2 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf zur Rekonstruktion der ultrastrukturellen Eigenschaften von Photorezeptorterminals. Die Rekonstruktion konzentrierte sich auf vier Arten von Photorezeptor-Terminals, darunter M-Zapfen-Pedikel, S-Zapfen-Pedikel, Rod1-Kügelchen und Rod2-Kügelchen. Das Hauptaugenmerk lag auf essentiellen Komponenten wie Mitochondrien, synaptischen Bändern und synaptischen Vesikelpools innerhalb der Photorezeptorendigungen.
Abbildung 3 zeigt die rekonstruierten Mitochondrien und synaptischen Bänder in den Photorezeptor-Enden der Stäbchen. Bemerkenswert ist, dass die synaptischen Bänder der Stangen2-Kügelchen eine charakteristische Hufeisenform aufweisen, die typischerweise ein einzelnes Band pro Kügelchen aufweist. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2 das Vorhandensein von zwei Mitochondrien in Stäbchenkügelchen, mit einer konsistenten Position im zentralen Raum der Terminals, die sich über den synaptischen Bändern befinden. Alle Strukturen wurden von Hand nachgezeichnet, Seite für Seite.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispiele für Bilder, die mit FIB-SEM für die traditionelle chemische Doppelfixationsmethode und die OTO-Methode aufgenommen wurden. (A) Traditionelle chemische Doppelfixierungsmethode. (B) OTO-Methode. Maßstab: 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> Abbildung 2: 3D-Rekonstruktions-Workflow für Photorezeptor-Terminals mittels FIB-SEM. Nach der Ausrichtung mit Hilfe einer 3D-Datenvisualisierungssoftware wurden die Serienbilder manuell segmentiert und für die weitere Analyse gerendert. (A) Original-Serienbilder. (B) Ausgerichtete Bilder. (C) Segmentierte Bilder. (D) Rekonstruierte Bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> Abbildung 3: 3D-Rekonstruktion. Die repräsentativen 3D-Rekonstruktionsbilder zeigen die Photorezeptor-Endungen in Weiß, die Mitochondrien in Orange und die synaptischen Bänder in Blau. Maßstab: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

preparation-of-retinal-samples-for-volume-electron-microscopy

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Wir beschreiben eine Methode, um retinales Pigmentepithel (RPE) effizient von der Netzhaut im menschlichen Auge zu trennen und ganze RPE/Aderhaut-Flatmounts für histologische und morphometrische Analysen des RPE zu generieren.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll bietet ein optimiertes und aufwändiges Präparationsverfahren für retinale Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Es eignet sich für Anwendungen, die die Analyse von Synapsen in reifen retinalen Organoiden beinhalten.

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Lernen Sie die optimierte Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht die dreidimensionale Rekonstruktion von Photorezeptor-Terminals in der Mausretina mittels FIB-SEM.

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

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