Name: Synthese von Aminosäuren, die mit reaktiven Carbonylen in Silico modifiziert wurden, um strukturelle Effekte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen zu bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Erfahren Sie die in silico-Synthese carbonylierter Aminosäuren und deren Einbau in Proteine mittels Molekulardynamik-Simulationen. Diese Methode eröffnet neue Wege zur Untersuchung post-translationaler Modifikationen.

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Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfördercode 1107-844-67943 des Ministerio de Ciencia, der Tecnología e Innovación (Minciencias) und der Universität Cartagena (Kolumbien) zur Unterstützung der Forschungsgruppen 2021 und Acta 017-2022 unterstützt.

In silico: Strukturanalyse der Proteincarbonylierung durch Lipidderivate

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<li>Pineda-Alemán, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+carbonylation+with+reactive+carbonyl+species+from+lipid+peroxidation+induce+local+structural+changes+on+thioredoxin+active+site%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Graph+Model%22%5BJournal%5D)">Cysteine carbonylation with reactive carbonyl species from lipid peroxidation induce local structural changes on thioredoxin active site.</a> J Mol Graph Model. 124, 108533(2023).</li>
<li>Alviz-Amador, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+4-HNE+modification+on+ZU5-ANK+domain+and+the+formation+of+their+complex+with+%CE%B2-Spectrin%3A+A+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Info+Model%22%5BJournal%5D)">Effect of 4-HNE modification on ZU5-ANK domain and the formation of their complex with β-Spectrin: A molecular dynamics simulation study.</a> J Chem Info Model. 60 (2), 805-820 (2020).</li>
<li>Zhou, A., Schauperl, M., Nerenberg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+electronic+structure+methods+for+accurate+fixed-charge+electrostatic+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Info+Model%22%5BJournal%5D)">Benchmarking electronic structure methods for accurate fixed-charge electrostatic models.</a> J Chem Info Model. 60 (1), 249-258 (2020).</li>
<li>Gęgotek, A., Skrzydlewska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+effect+of+protein+modifications+by+lipid+peroxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Che+Phys+Lipids%22%5BJournal%5D)">Biological effect of protein modifications by lipid peroxidation products.</a> Che Phys Lipids. 221, 46-52 (2019).</li>
<li>Moldogazieva, N. T., Zavadskiy, S. P., Astakhov, D. V., Terentiev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation%3A+Reactive+carbonyl+species%2C+protein%2FDNA+adducts%2C+and+signaling+switches+in+oxidative+stress+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation: Reactive carbonyl species, protein/DNA adducts, and signaling switches in oxidative stress and cancer.</a> Biochem Biophys Res Comm. 687, 149167(2023).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Einer der kritischen Schritte bei der Entwicklung des AMBER-Parametrisierungsprotokolls war die Quantenoptimierung der neuen Aminosäurereste, die mit den Lipidperoxidationsderivaten modifiziert wurden, aufgrund der energetischen Variabilität, die mit der Minimierung und der Art und Weise der Zuweisung von RESP-Ladungen in der AMBER-Vorkammer zusammenhängt. Hierfür werden ab initiio Optimierungsmethoden mit Hartree-Fock (HF/6-31G) und semiempirischer Dichtefunktionaltheorie (DFT; B3LYP/6-31G und M062X/6-31G) etabliert, um das Ansprechverhalten auf die Lastzuordnung zu evaluieren. Infolgedessen bot die HF-Funktion ein besseres Verhältnis von Leistung zu Rechenkosten, wobei dies als vorheriger Schritt des Protokolls berücksichtigt wurde. Dies konnte auch in der Studie von Zhou et al.12 gezeigt werden.
Bei der Anwendung des Protokolls kann es zu mehreren Fehlerquellen kommen. Die möglichen sterischen Hindernisse, die durch die zusätzlichen Strukturen der Modifikation erzeugt werden, führen oft zu Fehlern, die oft durch die Minimierungsschritte des molekularen Systems gelöst werden. Auf der anderen Seite werden die Parameter der Flächenwinkel in der Regel am Ende des Parametrisierungsprozesses angepasst und neigen daher manchmal dazu, sich als möglicher Fehler zu zeigen, in diesem speziellen Fall wird empfohlen, die Parameter nach Homologie anzupassen, wie von Alviz-Amador9 berichtet, und sie im neuen Format hinzuzufügen, um den Fehler zu beseitigen.
Eine der Einschränkungen der Methode ist der Aufwand, der für die schrittweise Entwicklung der Parametrisierungen erforderlich ist. Die Generierung neuer Parameter aus den neuen elektronischen Strukturen und die anschließende Anpassung dieser Parameter an Proteinsysteme erfordert viel Hingabe für eine gute Ausführung. Daher ist es eine gute Strategie bei der Implementierung unseres Protokolls, die Schritt-für-Schritt-Anleitung zu befolgen und den Leitfaden sorgfältig zu lesen.
In der Landschaft der Molekulardynamik-Simulationen wird die Bedeutung des AMBER-Protokolls deutlich. Seine Anpassungsfähigkeit und Vielseitigkeit machen es zu einem wertvollen Werkzeug für Forscher, die verschiedene Forschungsbereiche erforschen. Über die Anwendung in Proteinsystemen hinaus öffnet seine Erweiterung auf makromolekulare Strukturen Türen zu neuen Möglichkeiten. Diese Anpassungsfähigkeit schließt nicht nur die bestehenden Lücken in den Standard-Parametrisierungsmethoden, sondern bietet auch einen Weg zur Schaffung neuartiger Strukturen, wodurch der Horizont der Molekulardynamikforschung erweitert wird. Im Gegenteil, andere Untersuchungen zeigen, dass die konventionelle Parametrisierung posttranslationaler Modifikationen auf einen bestimmten Modifikationstyp beschränkt ist und ausschließlich aus öffentlich zugänglichen Repositorien8 abgeleitet wird, die nicht in der Lage sind, neue Strukturen zu generieren.
Modifikationen, die sich aus dem Vorhandensein reaktiver Carbonylspezies ergeben, sind häufig mit einer Reihe von Pathologien verbunden, darunter Krebs, Stoffwechselstörungen und degenerative Erkrankungen, die unterschiedlichen Mechanismen folgen13,14 . Die Unterstützung durch dieses Protokoll ist nützlich, um verschiedene entscheidende Eigenschaften zu bewerten, wie z. B. Konformationsstabilität, atomare Flexibilität, Verlust von Sekundärstrukturen, Lösungsmittelzugänglichkeit und Protein-Protein-Interaktionsenergie. Folglich könnte sich die Messung dieser Eigenschaften in Situationen als vorteilhaft erweisen, in denen carbonylierte Proteine irreversible Veränderungen in biologischen Systemen hervorrufen können, die zu Konformationsinstabilität, erhöhter oder verminderter atomarer Flexibilität und Verlust der Sekundärstruktur führen10,11.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das AMBER-Parametrisierungsprotokoll mit seinen kritischen Schritten, seiner Anpassungsfähigkeit und Vielseitigkeit eine bahnbrechende Methode im Bereich der Molekulardynamik-Simulationen darstellt. Obwohl ihre Grenzen anerkannt sind, wird ihre Bedeutung durch ihre Fähigkeit unterstrichen, die Unzulänglichkeiten bestehender Methoden zu beheben und Forschern ein leistungsstarkes Werkzeug an die Hand zu geben, um die Feinheiten molekularer Strukturen und Verhaltensweisen in einem Spektrum biologischer und chemischer Systeme zu erforschen.

In dem ständigen Bestreben, das molekulare Verhalten von Proteinen mit oxidativen Modifikationen zu verstehen, ist die Computerchemie zu einer grundlegenden Säule im weiten Feld der wissenschaftlichen Forschung geworden. Dies beruht auf der Verwendung theoretischer Modelle, die in der Lage sind, physikalische Phänomene in elektronischen Systemen zu interpretieren und mathematische Gleichungen zu verwenden, um das atomare Verhalten von Molekülen zu beschreiben. In dieser Landschaft stechen computergestützte Simulationen von Proteinen als entscheidende Werkzeuge zur Analyse des atomaren Verhaltens molekularer Systeme hervor. Basierend auf der Bewertung des strukturellen Verhaltens, energetischen Berechnungen und Konformationszuständen1 werden diese Methoden zu strategischen Verbündeten, um das Verhalten biomolekularer Systeme vorherzusagen.
Diese Simulationen sind darauf spezialisiert, strukturelle Veränderungen zu untersuchen und den Verlust oder Gewinn biologischer Funktionen in Proteinsystemen zu bewerten. Computergestützte Ansätze haben jedoch erhebliche Einschränkungen gezeigt, wenn sie auf Proteinsysteme angewendet werden, die modifizierte Reste enthalten, die durch kovalente posttranslationale Modifikationen in der Sequenz gebildet werden. Dies liegt daran, dass vielen verfügbaren Methoden Ressourcen mit Parametern fehlen, die an Kraftfelder angepasst werden können und mit den gängigsten Programmpaketen für Molekulardynamik-Simulationen von Proteinen kompatibel sind: 2,3,4,5,6. Daher ist die Standardisierung von computergestützten, softwarekompatiblen Kraftfeldadaptivparametern unerlässlich, um die präzise Kopplung von Topologien und atomaren Koordinaten mit der Gleichung zu erleichtern, die die potentielle Energie des Systemsbestimmt 7.
Als Reaktion auf diese Herausforderungen wurde ein Protokoll entwickelt, das an neue modifizierte Aminosäurereste mit Aldehyden aus der Lipidperoxidation angepasst werden kann. In diesem Sinne ermöglicht die Optimierung der strukturellen Geometrie der neuen Reste die Zuordnung adaptiver Ladungen zu neuen Bindungs-, Winkel- und Flächenparametern, die in allgemeinen Kraftfeldern wie AMBER ausgeführt werden können. Die anschließende Validierung dieser Parameter ermöglicht die Bestimmung der Konsistenz und Robustheit der Methode, die auf Molekulardynamik-Simulationen anwendbar ist.
Eine der bemerkenswerten Stärken dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, sich an verschiedene posttranslationale Modifikationen anzupassen, von der Carbonylierung über die Phosphorylierung bis hin zur Acetylierung und Methylierung. Diese Vielseitigkeit ist nicht nur auf Proteinsysteme beschränkt, sondern erstreckt sich auch auf makromolekulare Strukturen, die eine Kopplung mit atomaren Topologien und Koordinaten ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigen frühere Studien, dass die Standardparametrisierung posttranslationaler Modifikationen nur für eine bestimmte Art von Modifikation geeignet ist und nur aus veröffentlichten Repositorien bezogen werden kann, da sie nicht in der Lage sind, neue Strukturen zu erstellen8.
Derzeit werden Herausforderungen bei der Vorhersage und dem Design von Proteinstrukturen bei der Modellierung von Strukturen mit posttranslationalen Modifikationen immer deutlicher. Der Mangel an Parametern, die Veränderungen an bestimmten Aminosäurestellen beschreiben, unterstreicht die dringende Notwendigkeit, Berechnungsmethoden zu entwickeln und anzuwenden, die an Standardparametrisierungen angepasst werden können. Ziel dieses Protokolls ist es, einen Weg für die In-silico-Konstruktion neuer Parameter für Aminosäuren zu ebnen, die kovalent mit reaktiven Carbonylspezies modifiziert wurden, die aus der Fettsäureoxidation stammen. Diese modifizierten Aminosäuren werden vom General Amber Force Field (GAFF) erkannt und können daher verwendet werden, um in silico die strukturellen und funktionellen Auswirkungen dieser Art der Carbonylierung auf ihre Zielproteine zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>AmberTools16 oder Upper</td><td>Das Amber Project</td><td></td><td>Amber ist eine Suite von biomolekularen Simulationsprogrammen</td></tr><tr><td>Gaussian 09 oder Upper</td><td>Gaussian Inc</td><td></td><td>Zeichnen und Optimieren von Strukturen</td></tr><tr><td>Linux Ubuntu</td><td>GNU/Linux</td><td></td><td>Plattform für AmberTools</td></tr><tr><td>NVIDIA GPUs GTX 1080 oder Upper</td><td>Nvidia</td><td></td><td>Kompatibel mit PMEMD</td></tr></tbody></table>

synthese von aminosäuren, die mit reaktiven carbonylen in silico modifiziert wurden, um strukturelle effekte mit hilfe von molekulardynamik-simulationen zu bewerten 

Synthesizing Amino Acids Modified with Reactive Carbonyls in Silico to Assess Structural Effects Using Molecular Dynamics Simulations

Die Proteincarbonylierung durch reaktive Aldehyde, die aus der Lipidperoxidation gewonnen werden, führt zur Vernetzung, Oligomerisierung und Aggregation von Proteinen, was zu intrazellulären Schäden, Beeinträchtigungen der Zellfunktionen und schließlich zum Zelltod führt. Es wurde beim Altern und bei mehreren altersbedingten chronischen Erkrankungen beschrieben. Die Grundlagen der strukturellen Veränderungen, die mit dem Funktionsverlust in Proteinzielen zusammenhängen, sind jedoch noch nicht gut verstanden. Daher wird ein Weg zur in silico-Konstruktion neuer Parameter für Aminosäuren beschrieben, die mit reaktiven Carbonylspezies aus der Fettsäureoxidation carbonyliert sind. Die Michael-Addukte für Cys, His und Lys mit 4-Hydroxy-2-nonenal (HNE), 4-Hydroxy-2-hexenal (HHE) und eine Furanringform für 4-Oxo-2-nonenal (ONE) wurden aufgebaut, während Malondialdehyd (MDA) direkt an jeden Rest gebunden war. Das Protokoll beschreibt Details für die Konstruktion, die Optimierung der Geometrie, die Zuweisung von Ladungen, fehlende Bindungen, Winkel, Parameter für die Flächenwinkel und deren Validierung für jede modifizierte Reststruktur. Als Ergebnis wurden die strukturellen Effekte, die durch die Carbonylierung mit diesen Lipidderivaten induziert werden, durch Molekulardynamik-Simulationen an verschiedenen Proteinsystemen wie dem Thioredoxin-Enzym, dem Rinderserumalbumin und der Membran-Zu-5-Ankyrin-Domäne unter Verwendung der Root-Mean-Square-Deviation (RMSD), der Root-Mean-Square-Fluktuation (RMSF), der strukturellen Sekundärvorhersage (DSSP) und der lösungsmittelzugänglichen Oberflächenanalyse (SASA) gemessen. unter anderem.

Um die Umsetzung des Protokolls zu veranschaulichen und die Ergebnisse zu bewerten, werden die folgenden Analysen berücksichtigt. Der Datensatz, der durch die Zuweisung neuer Parameter zu modifizierten Aminosäureresten generiert wurde, wurde auf der Grundlage der Optimierung der elektronischen Strukturen erstellt, die für partielle RESP-Beladungen unterstützt wurden. Abbildung 9 zeigt die strukturelle Konformation eines der Aminosäurereste, die mit der Parameterzuweisung optimiert wurde.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66605/66605fig09.jpg"> Abbildung 9: Cys-HHE-Rest, synthetisiert in silico. Darstellung einer HHE-modifizierten Cystein-Aminosäure mit zugeordneter Topologie und Koordinatenparametern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66605/66605fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Strukturen, die aus theoretischen DFT-Niveaus mit M062X/6-31G gewonnen wurden, wurden mit den klassischen mechanischen Strukturen durch Molekulardynamik-Simulationen in AMBER verglichen. Jeder der aus den Simulationen gewonnenen Parameter zeigte eine gute Korrelation mit den theoretischen Daten aus der Quantenmechanik. Die durchschnittlichen Bindungsabstandsfehler zeigten Werte von ca. 0,001 - 0,002 Å, während die Winkel ~ 8,2° betrugen. Die Typologie, die Abstände und Konstanten der Bindungen und Winkel sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Daten ähnelten denen, die im Datenartikel von Alviz-Amador et al.9 berichtet wurden. Parameterdateien sind unter http://research.bmh.manchester.ac.uk/bryce/amber/ verfügbar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7">Cys-HHE</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Methodik</td>
			<td colspan="3">Bindung</td>
			<td colspan="3">Winkel</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(Å, ± Stdev)</td>
			<td colspan="3">(°, ± Stdev)</td>
		</tr><tr><td>QM</td>
			<td>S1 – C4</td>
			<td>C6-C8</td>
			<td>C8-C9</td>
			<td>S1-C4-C5</td>
			<td>O2-C6-C8</td>
			<td>C6-C8-C9</td>
		</tr><tr><td>(M062X/631G(D)</td>
			<td>1.82</td>
			<td>1.52</td>
			<td>1.53</td>
			<td>115.9</td>
			<td>109.25</td>
			<td>112.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MM (AMBER) aa allein</td>
			<td>1,85 ±</td>
			<td>1,55 ±</td>
			<td>1,54 ±</td>
			<td>111,66 ±</td>
			<td>109,77 ±</td>
			<td>113.16±</td>
		</tr><tr><td>0.002</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.152</td>
			<td>0.14</td>
			<td>0.148</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Vergleich der Bindungsabstands- und Winkelparameter. Die Werte der Bindungsabstände und des Bindungswinkels, die mit Quanten (QM) und klassischen Methoden ermittelt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede.
Nachdem jeder der Parameter für die modifizierten Aminosäurereste generiert und validiert worden war, wurde das dynamische Verhalten durch Molekulardynamik-Simulationen mit Trajektorien von 1 μs untersucht, um die Auswirkungen auf die Stabilität jedes Rests im Vergleich zu seinem nativen Gegenstück zu bewerten (Abbildung 10). Die RMSD-Werte, die für jede der modifizierten Aminosäuren erhalten wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede zu ihrem nativen Gegenstück und behielten ihre Konformationsstabilität über den gesamten Verlauf bei.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66605/66605fig10.jpg"> Abbildung 10: RMSD-Diagramm der synthetisierten Reste in silico. Repräsentativer RMSD von unmodifizierten und modifizierten Cysteinresten mit HHE, HNE, MDA und ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66605/66605fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Dateien, die sich aus der Parametrisierung modifizierter Aminosäurereste ergeben, wurden verwendet, um natürliche strukturelle Aminosäuren in Proteinen zu substituieren, die experimentelle Hinweise auf eine Carbonylierung aufweisen. Diese Substitution wurde durchgeführt, um die strukturellen und funktionellen Auswirkungen zu bewerten, die im Protein als Folge dieser Modifikationen auftreten können. Es wurde in silico-Studien über die Carbonylierung durch reaktive Carbonylspezies an Proteinsystemen wie Ankyrin und Thioredoxin berichtet10,11.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Optimierung und Parametrisierung von Aminosäureresten, die mit reaktiven Carbonylspezies modifiziert wurden und an Proteinsysteme angepasst werden können. Zu den Protokollschritten gehören das Strukturdesign und die Optimierung, die Ladungszuweisung, die Parameterkonstruktion und die Vorbereitung von Proteinsystemen.

Synthese von Aminosäuren, die mit reaktiven Carbonylen in Silico modifiziert wurden, um strukturelle Effekte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen zu bewerten 

Protein carbonylation by reactive aldehydes derived from lipid peroxidation leads to cross-linking, oligomerization, and aggregation of proteins, causing ...

Unsere Arbeit zeigt einen Weg für die in silico Herstellung von carbonylierten Aminosäuren mit Lipidperoxidationsendprodukten und wie diese in ein Protein eingebaut werden können. Dies kann uns helfen zu verstehen, wie diese posttranslationale Modifikation die strukturelle Funktion von carbonylierten Proteinen verändern kann. Programme, die auf Algorithmen der künstlichen Intelligenz basieren, sind heute die leistungsfähigsten Rechenwerkzeuge für die Vorhersage der Tertiärstruktur von Proteinen.Sie erkennen carbonylierte Aminosäuren jedoch noch nicht und können daher ihre Auswirkungen auf die Proteinstruktur nicht vorhersagen. Um den Einfluss posttranslationaler Modifikation auf die Struktur und Funktion eines Proteins zu untersuchen, steht eine breite Palette von Parametermethoden zur Verfügung, die mit computergestützten Ansätzen kombiniert werden, um das gewünschte Ergebnis zu beschleunigen und zu vertiefen. Bei der Erforschung der posttranslationalen Modifikation von Proteinen, sowohl in vivo, in vitro als auch in silico, gibt es wichtige Herausforderungen, denen man sich stellen muss.Auf der In-silico-Ebene ist noch die Verbesserung der Kraftfelder und der Datenanalyseprogramme sowie die Schaffung neuer Parameter erforderlich. Aufgrund der Zunahme von carbonylierten Proteinen unter anderem bei Stoffwechselinfektionen und altersbedingten Krankheiten können unsere Ergebnisse dazu beitragen, die strukturellen Veränderungen zu verstehen, die dabei auftreten und wie sich dies auf die Funktion in silico auswirken kann

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