Name: Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen Pankreaskrebs-Sphäroiden aus Co-Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Co-Kultur-Methode zur Erzeugung desmoplastischer 3D-Sphäroide aus Pankreaskrebszellen. Dieses Modell ermöglicht mechanistische Studien zum Tumorwachstum und Hochdurchsatz-Screenings therapeutischer Substanzen.

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1. 2D-Zellkultur
<ol><li>Züchten Sie PANC-1-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) unter sterilen Bedingungen. Wachsen Sie bis zu 70%-80% Konfluenz vor Passagen und verwenden Sie sie nicht über die 20. Passage hinaus. Beziehen Sie sich auf den in Schritt 4.2.1 beschriebenen Prozess. HINWEIS: Als Anhaltspunkt benötigen 1 x 106 Zellen in 20 mL Medium etwa 2-3 Tage, um eine Konfluenz von 70-80 % zu erreichen.</li>
	<li>Züchten Sie HPaSteC-Zellen in Sternzellmedien, die mit 2 % FBS, 1 % PenStrep und 1 % Stellate Cell Growth Supplement (SteCGS) ergänzt sind, unter Verwendung des vom Hersteller bereitgestellten Kits unter sterilen Bedingungen. Wachsen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers (mit einigen Modifikationen), wie in Schritt 4.2.2 gezeigt, in einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Kolben.<ol><li>Überspringen Sie den FBS-Neutralisationsschritt während der Trypsinisierung aus dem Protokoll des Herstellers, da die Trypsin-Neutralisationslösung (TNS) verwendet wird. Die Zellsuspension wird mit einem Gesamtvolumen von 10 ml TNS neutralisiert, wie in Schritt 4.2.2.2 beschrieben. HINWEIS: Als Referenzpunkt benötigen 0,5 x 106 Zellen und 1 x 106 Zellen in 20 ml Medium 3 Tage bzw. 2 Tage, um eine Konfluenz von 90 % zu erreichen.</li>
		<li>Ernten Sie Zellen mit einer Konfluenz von 90 %. Verwenden Sie keine Zellen nach Passage 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Halten Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 in sterilen Inkubatoren mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 90 % bis 95 %. Führen Sie alle Zellkulturstudien in einem T-75-Kolben durch.</li>
</ol>2. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA)-Lösungsbeschichtung für 96-Well-Platten
<ol><li>Bereiten Sie eine Poly-HEMA-Lösung mit 5 mg/ml unter Verwendung von 95 % Ethanol vor, indem Sie sie über Nacht mit einem erhitzten Rührer bei 37 °C mischen lassen (z. B. 500 ml Lösung benötigen 2,5 g Poly-HEMA)<ol><li>Markieren Sie die Position des Startvolumens, bevor Sie den Rührer hinzufügen. Verwenden Sie 95%iges Ethanol, um den Verlust der Lösung am nächsten Tag auszugleichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Die wird in einer sterilen Haube mit einem 0,22-μm-Filter filtriert und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. HINWEIS: Poly-HEMA wird verwendet, um die Hydrophobie einer Oberfläche zu erhöhen, was als Abschreckungsmittel für die Anheftung von Zellen dient. Da diese Studie erfordert, dass sich die Zellen nicht an die Vertiefungen anheften und als Monoschicht wachsen, wird Poly-HEMA als zusätzliche Abschreckung gegen die natürliche geringe Bindung der Platten verwendet, wodurch sie zu Platten mit extrem geringer Bindung werden.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl der kalten Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Polystyrolboden in einer Zellkulturhaube, um die Platte zu beschichten.</li>
	<li>Lassen Sie die Vertiefungen mit geschlossenem Deckel 3 Tage lang bei 37 °C Heißluftofen stehen, damit die Platten vollständig trocken sind.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Platten vor der Zellaussaat 30 Minuten lang in der Zellkulturhaube mit UV-Sterilität. Für die Langzeitlagerung in einem fest verschlossenen Reißverschluss aufbewahren und vor Gebrauch sterilisieren.</li>
</ol>3. Planung von 2D-Zellkulturen
<ol><li>Planen Sie das Experiment so, dass PANC-1-Zellen mit einer Konfluenz von 70 % bis 80 % am selben Tag verfügbar sind, an dem die HPaSteC-Zellen 90 % erreichen. HINWEIS: Durchstechflaschen mit etwa 1 Million Zellen PANC-1 oder HPaSteC, die am selben Tag aus flüssigem Stickstoff gezüchtet werden, erfordern mit einigen Abweichungen 8 Tage PANC-1-Kultur und 6-7 Tage HPaSteC-Kultur, um beide Zelllinien am selben Tag fertig zu haben.</li>
</ol>4. 3D kulturelles Wachstum
<ol><li>Sehen Sie sich die Übersicht über den gesamten Prozess in Abbildung 1 an, bevor Sie den Prozess starten. ACHTUNG: Sowohl PANC-1 als auch HPaSteC sind biologischen Ursprungs. Gehen Sie vorsichtig mit PANC-1 (krebsartige Zelllinie) um.</li>
	<li>Trypsinzierung und Zellzählung<ol><li>Trypsinze und Zählung PANC-1 Zellen:<ol><li>Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die PANC-1-Zellen mit 9 ml HBSS (jeweils 3 ml). Entsorgen Sie gebrauchte Reagenzien in der Haube in einer 20-25%igen V/V-Bleichlösung, um den vollständigen Tod des lebenden/lebensfähigen Materials sicherzustellen.</li>
			<li>Trypsinisieren Sie die Zellen mit 2 ml Trypsin. Nach fast 10 Minuten (es kann mehr Zeit dauern), wenn alle Zellen abgelöst sind, neutralisieren Sie die Suspension mit 10 ml DMEM + 10% FBS. Beginnen Sie mit 3 mL und folgen Sie mit nachfolgenden Waschschritten mit 1 mL pro Waschgang (7 Waschgänge verbleibend), um eine maximale Sammlung trypsinisierter Zellen zu gewährleisten.</li>
			<li>Sammeln Sie jedes neutralisierte Aliquot in dasselbe 15-ml-Röhrchen. Das endgültige Volumen im Röhrchen liegt bei 12 mL (~2 mL Trypsin, das mit 10 mL Medium neutralisiert wurde).</li>
			<li>Die neutralisierte Zellsuspension bei 700 x g für 2 min und 30 s zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das in 1 ml DMEM +10 % FBS erhaltene Pellet resuspendieren. Nehmen Sie daraus ein Aliquot für die Zellzählung und beschriften Sie den aus diesem Abschnitt erhaltenen Wert als "Zählung A".</li>
		</ol></li>
		<li>Trypsinze und zählen HPaSteC-Zellen.<ol><li>Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die HPaSteC-Zellen mit 9 ml HBSS (jeweils 3 mL).</li>
			<li>Trypsinisieren Sie die Zellen mit 2 ml Trypsin. Nach fast 10 Minuten, wenn alle Zellen abgelöst sind, neutralisieren Sie die Suspension mit 10 ml Trypsin-Neutralisationslösung. Beginnen Sie mit 3 mL und folgen Sie mit nachfolgenden Waschschritten mit 1 mL pro Waschgang (7 Waschgänge verbleibend), um eine maximale Sammlung trypsinisierter Zellen zu gewährleisten.</li>
			<li>Sammeln Sie jedes neutralisierte Aliquot in dasselbe 15-ml-Röhrchen. Das endgültige Volumen im Röhrchen liegt bei 12 mL (~2 mL Trypsin, das mit 10 mL Neutralisationslösung neutralisiert wurde).</li>
			<li>Die neutralisierte Zellsuspension bei 700 x g für 2 min und 30 s zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und das in 1 ml des supplementierten Sternzellmediums erhaltene Pellet resuspendiert. Nehmen Sie ein Aliquot daraus für die Zellzählung und beschriften Sie den aus diesem Abschnitt erhaltenen Wert als "Zählung B".</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Verdünnung der anfänglichen Zellsuspensionen<ol><li>Pausieren Sie bei Bedarf (nicht länger als 0,5 h) bei diesem Schritt für eine kurze Zeit, nachdem Sie entweder beide Zählungen A und B erhalten haben oder nachdem Sie sowohl PANC-1 als auch HPaSteC trypsinisiert und neutralisiert haben. Unbenutzte Nährmedien werden bei 37 °C und Zellsuspensionen bei Raumtemperatur (RT; 25 ± 2 °C) aufbewahrt.</li>
		<li>Verwenden Sie Count A und Count B, die Sie zuvor erhalten haben, um Aliquote zu entnehmen und entsprechende Verdünnungen (in separaten Röhrchen) vorzunehmen, so dass das endgültige Volumen 1 ml beträgt (Verdünnungsmittel: DMEM + 10 % FBS für beide Fläschchen) und die endgültige Zählung zwischen 110.000 und 140.000 Zellen für jeden Zelltyp liegt. Sobald diese Verdünnung erfolgt ist, überprüfen Sie die Zellzahlen für jede Verdünnung, um Count C (PANC-1) und Count D (HPaSteC) zu erhalten.</li>
		<li>Halten Sie bei Bedarf (nicht länger als 15-30 Minuten) bei diesem Schritt an, nachdem Sie Count C und Count D erhalten haben. Hören Sie nicht auf, sobald die endgültigen Verdünnungen in Schritt 4.3.3.2 vorgenommen wurden. Experimentieren Sie, um Zellablagerungen zu vermeiden. Nicht verwendete Nährmedien bei 37 °C und Zellsuspensionen bei RT (25 ± 2 °C) aufbewahren.<ol><li>Die endgültige Anzahl der pro Well benötigten Zellen bei HPaSteC wird beibehalten: PANC-1: 60:120. Verwenden Sie 110 Wells für die Berechnung, um den Überschuss zu berücksichtigen. Rechnen Sie mit einem Basiswert von 100 μl Zellsuspension pro Well (das Gesamtsuspensionsvolumen beträgt 11 mL für 110 Wells mit HPaSteC: PANC-1: 60:120). Stellen Sie diese Suspension in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen her, um das Mischen zu erleichtern.</li>
			<li>Verwenden Sie Count C und Count D und geben Sie genügend Zellsuspension in eine DMEM + 10%ige FBS-Lösung, um HPaSteC: PANC-1: 60:120 in einem Endvolumen von 11 mL (6.600 HPaSteC-Zellen und 13.200 PANC-1-Zellen in 11 mL) zu erhalten. Mischen Sie die Lösung gründlich mit einer 1-ml-Pipette, indem Sie umrühren und auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie Schaumbildung.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bekeimung<ol><li>Verwenden Sie eine 200 μl oder 100 μl Pipette, um die endgültige Suspension bei jedem Schritt zu mischen (rühren Sie um, indem Sie die Pipettenspitze in Kombination mit dem Auf- und Abpipettieren bewegen), bevor Sie 100 μl der Suspension pro Vertiefung hinzufügen. Geben Sie die 100 μl vorsichtig an der Ecke der Vertiefung entlang.<ol><li>Verwenden Sie dieselbe Spitze für mehrere Vertiefungen, es sei denn, sie fällt ab. Mischen Sie hin und her und zählen Sie bis 10 oder 15 (nicht Sekunden) zwischen den Zugaben zu jeder Vertiefung für die erste Hälfte (ungefähr die ersten 43 Vertiefungen) der Platte. Verringern Sie die Mischzahl zwischen den einzelnen Vertiefungen für die zweite Hälfte (verbleibende 43 Vertiefungen) auf 5-10, da das Suspensionsvolumen geringer ist und eine kürzere Mischdauer erforderlich ist.</li>
			<li>Verwenden Sie keine Repeating-Pipette, da die hydrophobe Poly-HEMA-Beschichtung dazu führt, dass die Suspension von der Platte abprallt, was zu einer ungleichmäßigen Verteilung führt.</li>
		</ol></li>
		<li>Entsorgen Sie überschüssige Suspension, nachdem alle Vertiefungen gefüllt sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifugation<ol><li>Zentrifugieren Sie die letzte Platte mit der Zellsuspension, um alle Zellen zu einem Pellet zusammenzuführen. Wickeln Sie die Platte vorsichtig mit Parafilm um den Rand der Platte, um eine Kontamination während dieses Schritts zu vermeiden. Nach dem Einwickeln die Platte mit einem Gegengewicht bei 1000 x g 2 min zentrifugieren.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platte wieder in die Zellkulturhaube (verwenden Sie mit Ethanol besprühte Handschuhe zur Handhabung), entfernen Sie den Parafilm und lagern Sie die Platten im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Besprühen Sie die Platte an keiner Stelle mit einem Ethanol-Wasser-Gemisch.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulturpflege<ol><li>Beobachten Sie, wie sich Zellen unter einem Lichtmikroskop bei 4- bis 5-facher Vergrößerung an Tag 3 zu Sphäroiden zusammenschließen. Befolgen Sie das Kulturwartungsprotokoll wie unten beschrieben.<ol><li>Messen Sie an Tag 3 5-6 mL DMEM + 10 % FBS ab und geben Sie 50 μl davon in jede Vertiefung an der Seite der Vertiefung.<ol><li>Mischen oder rühren Sie das Medium während der Zugabe in keiner Weise, da dies das Sphäroid beschädigt oder zu einer versehentlichen Entfernung des Sphäroids führt. Das endgültige Volumen pro Vertiefung beträgt ~150 μL.</li>
			</ol></li>
			<li>Nach Tag 3 können Sie sich in Abbildung 2 mit der Struktur des Bohrlochs und der Position der Lichtreflexion (zwischen dem zylindrischen und dem gekrümmten Teil des Bohrlochs) vertraut machen, die auf dem als Halo bezeichneten Medium zu sehen ist. Führen Sie Vorgänge in der Nähe des Halos mit Vorsicht durch, um sicherzustellen, dass die Sphäroide unbeschädigt bleiben.</li>
			<li>Messen Sie an Tag 6 10-11 ml DMEM + 10% FBS. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um Medien in großen Mengen aus mehreren Vertiefungen zu ziehen, indem Sie das Medium bis zum Halo herausziehen. Tun Sie dies für die gesamte Platte, gefolgt von einem Medienwechsel. Überstand in großen Mengen sammeln und entsorgen oder entsorgen, wenn er herausgezogen wird.</li>
			<li>Ersetzen Sie die ausrangierten Medien durch frische Medien, indem Sie 100 μl Medium an der Seite jeder Vertiefung hinzufügen. Das endgültige Volumen in der Vertiefung beträgt fast 200 μl.<ol><li>Ziehen Sie das Medium nicht über den Halo hinaus, da dies das Risiko eines versehentlichen Herausziehens des Sphäroids erhöht.</li>
			</ol></li>
			<li>Messen Sie am Tag 10/11 10-11 ml DMEM + 10% FBS. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um Medien in großen Mengen aus mehreren Vertiefungen zu ziehen, indem Sie das Medium bis zum Halo herausziehen. Tun Sie dies für die gesamte Platte, gefolgt von einem Medienwechsel. Überstand in großen Mengen sammeln und entsorgen oder entsorgen, wenn er herausgezogen wird.</li>
			<li>Ersetzen Sie die ausrangierten Medien durch frische Medien, indem Sie 100 μl Medium an der Seite jeder Vertiefung hinzufügen. Das endgültige Volumen in der Vertiefung beträgt fast 200 μl.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bewertung am Abschlusstag<ol><li>Führen Sie an Tag 14 eine medikamentöse Behandlung der Sphäroide durch. Bilden Sie die Sphäroide vor der Verwendung mit einem inversen Hellfeldmikroskop unter einem 4-fach-Objektiv ab, um das Startvolumen des Sphäroids zu bestimmen. Berechnen Sie das Volumen (V) mit der folgenden Formel: V = 0,5 × L × W2</li>
		<li>Befolgen Sie die oben beschriebene Gleichung zur Berechnung des Sphäroidvolumens. Dabei ist L die Länge der Hauptachse und W die Breite (längste Linie senkrecht zur Hauptachse). Rechnen Sie alle ursprünglichen Einheiten von Mikrometern in Millimeter um, um ein Volumen in Kubikmillimetern zu erhalten.</li>
		<li>Das Startvolumen in jeder Vertiefung an Tag 14 liegt aufgrund der Verdunstung zwischen 150 und 200 μl. Entfernen Sie bei medikamentösen Behandlungen das Medium, bis der Halo aus jeder Vertiefung erreicht ist, und ersetzen Sie es durch 100 μl der Arzneimittellösung mit 2-facher Stärke, gekoppelt mit etwas sanftem Mischen (mischen Sie das Medium vorsichtig hin und her, während Sie zwischen den einzelnen Vertiefungen bis 2 zählen).<ol><li>Verwenden Sie Lösungen mit einer Stärke von 2x, damit die endgültige Arzneimittellösung bei 1x liegt und um zu vermeiden, dass alte Medien vollständig aus den Vertiefungen entfernt werden, da andernfalls die Sphäroide gestört werden können. Verwenden Sie die Sphäroide innerhalb von 3 Tagen nach diesem Zeitraum.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sammlung von Sphäroiden<ol><li>Messen Sie die Sphäroidvolumina vor der Entnahme, wie in Schritt 4.7.2 beschrieben.</li>
		<li>Sammeln Sie die Sphäroide an Tag 14 oder 17, je nach Bedarf des Experiments, indem Sie das Medium aus jeder Vertiefung entfernen, bis der Halo erreicht ist.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um das Medium zu entfernen, und sammeln Sie den Überstand in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus mehreren Vertiefungen.</li>
		<li>Sobald sich alle Vertiefungen mit Medien auf Halo-Ebene befinden, reduzieren Sie die Einstellung an der 1-ml-Pipette auf 200 bis 300 μl.</li>
		<li>Richten Sie die Platte gegen den Hintergrund der Haube oder einen dunklen Hintergrund (z. B. ein Rohrgestell) aus, um zu sehen, wie sich die Sphäroide am Boden absetzen.</li>
		<li>Führen Sie die Spitze vorsichtig in der Nähe des Sphäroids ein (gehen Sie unter den Halo) und pipettieren Sie eine kleine Menge des Mediums (z. B. eine visuelle Schätzung von fast 50 μl) hin und her, um das Sphäroid zu stören. Setzen Sie die Spitze nicht direkt über das Sphäroid, da dies dessen Struktur beschädigen kann.<ol><li>Ziehen Sie bei diesem Schritt nicht alle Medien aus dem Schacht. Kontrollieren Sie die Daumenbewegung fest am Kolben der Pipette.</li>
		</ol></li>
		<li>Verschieben Sie das Medium, bis das Sphäroid nicht mehr in der Mitte verbleibt und sich im Hintergrund bewegt. Ziehen Sie genügend Medium heraus, um das Sphäroid abzusaugen, und bringen Sie es an die gewünschte Stelle (z. B. poolen Sie es mit anderen Sphäroiden in einer Vertiefung, die Teil desselben Behandlungssets ist).</li>
	</ol></li>
	<li>Entsorgung von Abfällen<ol><li>Entsorgen Sie alle flüssigen Proben, sobald sie mit Bleichmittel neutralisiert wurden, gemäß den Protokollen der Abteilung für Umwelt- und Gesundheitssicherheit des jeweiligen Labors. Autoklavieren und entsorgen Sie alle gebrauchten Pipetten und Kolben mit biologisch gefährlichen Abfällen.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den Prozess zur Züchtung von desmoplastischen Pankreaskrebs-Sphäroiden in 3D (Generiert mit BioRender). Die Abbildung gibt einen Überblick über die grundlegenden Prozesse; Nämlich das Trypsinzieren von Zellen, die Verwendung der anfänglichen Zellzahl zur Herstellung verdünnter Zellsuspensionen, das Vorbereiten einer Co-Kultur unter Verwendung der verdünnten Zellsuspensionen, das Hinzufügen von Zellsuspensionen zu jeder Vertiefung, das Inkubieren der Kulturen, das Durchführen der Medienwartung und die abschließende Sphäroidbildung, wie am Tag 14 erwartet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig02.jpg"> Abbildung 2: Aufbau des U-Bodenschachts. Das rechte Bild ist eine übertriebene Form, um den "Halo"-Teil des Bohrlochs zu demonstrieren. Die Abbildung zielt darauf ab, zu definieren, wo sich der "Halo"-Teil des Bohrlochs befindet, da die Arbeit oberhalb des Halos entscheidend ist, um die Sphäroide wachsen zu lassen und versehentliche Verluste zu vermeiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
5. Evaluierung von ECM-Komponenten und konfokaler Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie Immunfärbung, um das Ansprechen der EZM auf die medikamentöse Therapie gemäß dem von Durymanov et al. beschriebenen Protokoll zu bewerten38.<ol><li>Bündeln Sie die Sphäroide zusammen und waschen Sie sie zweimal mit 100 μl PBS. In das Gewebeeinbettungsmedium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) einbetten, einfrieren und bei -80 °C aufbewahren.</li>
		<li>Schneiden Sie die gefrorenen Tumorblöcke in 10 μm große Abschnitte, fixieren Sie die Schnitte 15 min lang in einem Aceton-Methanol-Gemisch (1:1) und lassen Sie sie bei RT an der Luft trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die EZM-Komponenten zu bestimmen, färben Sie die Kryosektionen mit monoklonalen Kaninchen-Anti-Fibronektin-Primärantikörpern, polyklonalen Kaninchen-Anti-Typ-I-Kollagen-Antikörpern, polyklonalen Kaninchen-Anti-Laminin-Antikörpern und polyklonalen Anti-Hyaluronsäure-Antikörpern von Schafen.</li>
	<li>Als Sekundärantikörper verwenden Sie Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, markiert mit Alexa Fluor 488, oder Esel-Anti-Schafe, die mit Alexa Fluor 568 konjugiert sind. HINWEIS: Primär- und Sekundärantikörper wurden bei 1:200 bzw. 1:300 verdünnt.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder aller Sphäroidschnitte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einer 20x/0,45-Objektivlinse ausgestattet ist.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>3D-PDAC-Modell zur Erfassung der Desmoplasie für die therapeutische Bewertung

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<li>Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+models+as+tools+for+radiotherapy+screening+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer.</a> Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Axio Observer inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>0450-354</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Auto-T4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Pulver, hoher Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Schaf konjugiert mit Alexa Fluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175712</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>SH3091003HI</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Antikaninchen IgG markiert mit Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Humane Pankreas-Sternzellen (HPaSteC)</td><td>ScienCell</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ts 100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten mit rundem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview FV1200 konfokaler Laser</td><td>Olympus N</td><td>/A</td><td>Eingestelltes Produkt</td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Polyklonale Anti-Laminin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonale Kaninchen-Anti-Typ-I-Kollagen-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonale Anti-Hyaluronsäure-Antikörper für Schafe</td><td>Abcam</td><td>ab53842</td><td></td></tr><tr><td>Stellate Zellmedien Komplettset&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>5301</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>153571</td><td>Trypsin-Lösung, die gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt und bei 0,25 % w/v&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-Neutralisationslösung (TNS)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen pankreaskrebs-sphäroiden aus co-kultur

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Drei der wichtigsten Schritte bei der Züchtung der Sphäroide sind die anfängliche Zellzahl, die Mischschritte während der Aussaat der Sphäroide und die rechtzeitige Durchführung von Medienwechseln, damit die Sphäroide wachsen können (Abbildung 1). Darüber hinaus ist es wichtig, mit Abbildung 2 zu Medienänderungen nach Tag 3 vertraut zu sein, um aufgrund des erhöhten Medienvolumens pro Vertiefung effektive Medienänderungen zu ermöglichen. Wenn alle diese Schritte gemäß den angegebenen Anweisungen durchgeführt werden, wachsen die Sphäroide (Abbildung 3) auf ein durchschnittliches Volumen von 0,048 ± 0,012 mm3 (451 μm x 462,84 μm) an (Abbildung 4). Es wurden Fälle gefunden, in denen Zellen besser wachsen konnten, was zu größeren anfänglichen durchschnittlichen Volumina von 0,096 ± 0,014 mm3 (611 μm x 560 μm) an Tag 14 führte. Eine Vielzahl von Gründen kann dazu führen, dass die Sphäroide ein größeres Anfangsvolumen haben, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators oder die Verwendung früherer Zellpassagen, die im Vergleich zu späteren Passagen eine leicht verbesserte Vitalität aufweisen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig03.jpg"> Abbildung 3: Ein repräsentatives Sphäroid, wie es am Tag 14 zu sehen ist (Größe: 451,59 μm x 462,84 μm). Maßstabsleiste = 200 μm. Jedes Sphäroid wird entlang seiner längsten bzw. kürzesten Achse gemessen und verwendet die im Abschnitt Methoden beschriebene Gleichung zur Berechnung des Volumens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig04.jpg"> Abbildung 4: Fortschritt des Sphäroidwachstums über 17 Tage. Die Tafeln 1 und 2 sind Nachbildungen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Die Abbildung kann als ungefähre Schätzung des Sphäroidvolumens verwendet werden, das an den Tagen 6, 10, 14 und 17 zu sehen sein kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
In Fällen, in denen die Zellen nicht korrekt gezählt werden oder die Zellsuspension nicht gründlich gemischt wird, die endgültige Kultur nicht regelmäßig gepflegt wird oder eine Kombination dieser Fehler auftritt, kann dies zur Entwicklung kleinerer Sphäroide oder unvollständig gewachsener Sphäroide führen. Sphäroide mit ähnlichem Erscheinungsbild wurden auch beobachtet, wenn erste Optimierungsstudien Medien nur in Vertiefungen an der Peripherie der Platte an Tag 3 und nicht auf der gesamten Platte ergänzten (Abbildung 5). Alternativ können in Fällen, in denen die Zellen nicht gut gemischt werden oder anfängliche Zähl-/Verdünnungsfehler dazu führen, dass mehr Zellen pro Vertiefung ausgesät werden, als empfohlen, mehrere Sphäroide pro Vertiefung zu sehen sein. Ein ähnlicher Befund wurde beobachtet, wenn PANC-1:HPaSteC-Zellen in einem Verhältnis von 240:120 verwendet wurden (Abbildung 6). Dies kann auch gelegentlich beobachtet werden, wenn Sphäroide pro Richtung gezüchtet werden, aber solche Sphäroide sind weniger zahlreich (z. B. können 4/96 Wells zwei Sphäroide pro Well anstelle von einem enthalten). In Fällen, in denen mehrere Sphäroide angetroffen werden, vermeiden Sie entweder die Verwendung der Vertiefungen mit mehreren Sphäroiden oder notieren Sie sich Volumenänderungen, wenn diese Sphäroide behandelt werden. Unsachgemäße Medienwechsel, bei denen die Pipettenspitze unter den Halo eintaucht (Abbildung 1), können ebenfalls zu einem versehentlichen Verlust der Sphäroide führen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig05.jpg"> Abbildung 5: Ein repräsentatives Bild eines schlecht gewachsenen Sphäroidea am Tag 14. Maßstabsleiste = 200 μm. Hier haben sich die Zellen nicht gut aggregiert, so dass es schwierig wird, die Länge und Breite des Sphäroids zu messen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig06.jpg"> Abbildung 6: Ein repräsentatives Bild eines Bohrlochs mit zwei schlecht gewachsenen Sphäroiden, aufgenommen an Tag 14. Maßstabsleiste = 200 μm. Dabei hat eines der Sphäroide eine Größe von 246,61 μm x 178,31 μm und das andere 289,13 μm x 252,35 μm. Dies ist ein Beispiel, bei dem es wahrscheinlich ein Problem mit den anfänglichen Verdünnungen oder der Qualität der Zellen gibt, die zum Starten des Experiments verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Sphäroide entwickeln auch eine EZM mit vier der primären EZM-Komponenten: Kollagen-I, Laminin, Hyaluronsäure und Fibronektin. In Studien, die das Labor zuvor veröffentlicht hat, wurde der Vorteil der Co-Kultur gegenüber PANC-1 allein in Bezug auf Homo-PANC-1-Sphäroide gezeigt, die diffuses Kollagen, kein Fibronektin und eine geringere Hyaluronsäureablagerung aufweisen.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig07.jpg"> Abbildung 7: Repräsentatives Bild der vier primären EZM-Komponenten, wie es am Tag 17 bei unbehandelten Sphäroiden zu sehen war: Kollagen I, Laminin, Hyaluronsäure und Fibronektin. Diese Bilder werden nach immunfärbenden Kryoschnitten des Sphäroids aufgenommen. Die Helligkeit dieser Bilder wurde gleichmäßig erhöht, um Unterschiede im Erscheinungsbild hervorzuheben. Bereiche, in denen Gewebe beschädigt ist oder fehlt, müssen während der Intensitätsmessungen angepasst werden. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen Pankreaskrebs-Sphäroiden aus Co-Kultur

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

growing-desmoplastic-three-dimensional-pancreatic-cancer-spheroids

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Dieses Video erklärt das 3D-magnetische Bioprinting von co-kultivierten Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und Fibroblasten. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und aktivierte Pankreasfibroblastenzellen werden unter dem Einfluss magnetischer Kräfte co-kultiviert und mit einer biokompatiblen Nanopartikelanordnung magnetisiert, um Sphäroide zu erzeugen.

Magnetisch biogedruckte 3D-Sphäroid-Co-Kulturen: Eine Methode zur Co-Kultivierung von Krebszellen und Fibroblasten

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Etablierung einer dreidimensionalen Co-Kultur von Tumor-Sphäroid und T-Zell. Es wird ein Agarose-Abguss mit Mikrovertiefungen hergestellt, die Tumor-Sphäroide enthalten, gefolgt von der Zugabe von T-Zellen. Nach der Inkubation ermöglicht dieser Aufbau die Untersuchung der Interaktion von T-Zellen mit Tumorsphäroiden in einer kontrollierten dreidimensionalen Umgebung.

Ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell der Infiltration von T-Zellen in Tumor-Sphäroiden

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung von 3-dimensionalen (3D) Sphäroid Kokultur Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten, gefolgt von Messung von Stoffwechselfunktionen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer beschrieben.

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Es fehlen umfassende In-vitro-Modelle , die die relevante menschliche Krankheit getreu rekapitulieren. Die aktuelle Studie präsentiert die dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidbildung und -kultur, ein zuverlässiges In-vitro-Werkzeug zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion beim menschlichen hepatozellulären Karzinom.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie die Co-Kultur-Methode zur Erzeugung desmoplastischer 3D-Sphäroide aus Pankreaskrebszellen. Dieses Modell ermöglicht mechanistische Studien zum Tumorwachstum und Hochdurchsatz-Screenings therapeutischer Substanzen.

Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen Pankreaskrebs-Sphäroiden aus Co-Kultur

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