Name: Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie den Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln. Diese Methode ermöglicht die Kapselung von Enzymen und Membranproteinen für synthetische Zellen.

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Die Autoren danken Aditya Iyer für die Klonierung des pBAD-PercevalHR-Gens und Gea Schuurman-Wolters für die Unterstützung bei der Proteinproduktion und -reinigung. Die Forschung wurde durch das NWO-Gravitationsprogramm "Building a Synthetic Cell" (BaSyC) gefördert.

Protokoll zur Verkapselung von Lipid-Vesikeln für komplexe Proteinnetzwerke

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Wir stellen ein Protokoll für die Synthese von (Membran-)Proteinen vor, die submikrometergroße Lipidvesikel (proteoLUVs) enthalten, und die Umwandlung von proteoLUVs in riesen-unilamelläre Vesikel (proteoGUVs). Das Protokoll sollte anwendbar sein für die Rekonstitution anderer Membranproteine13, 19, 30, 40 und die Verkapselung anderer Stoffwechselnetzwerke als der hier vorgestellten L-Arginin-Abbau- und Glycerin-3-phosphat-Synthesewege.
Die Rekonstitution von Membranproteinen in Liposomen führt in der Regel zu einer zufälligen Orientierung der Proteine innerhalb der Lipidmembran. Für ArcD und Glpt spielt die Orientierung keine Rolle, da die Proteine bidirektional arbeiten und sich die gelösten Stoffe in Abhängigkeit vom Vorzeichen des gesamten elektrochemischen Potentials bewegen. Bei Proteinen, die in eine Richtung funktionieren, steht die Hälfte der Moleküle nicht für die Aktivität zur Verfügung, wenn ihre Ausrichtung 50/50 ist.
Die Extrusion von Vesikeln durch einen Polycarbonat-Filter verengt die Größenverteilung, und die Vesikel werden umso homogener, je kleiner die Porengröße der Filter ist. Kleinere Vesikel haben jedoch den Preis, dass sie ein kleineres Volumen und damit eine sehr geringe Anzahl von Proteinen (Enzyme, Membranproteine) pro Vesikel haben. Um den Anteil von LUVs zu minimieren, bei denen eine oder mehrere Komponenten fehlen, kann die Konzentration der Proteine wie in Abbildung 3A,B gezeigt angepasst werden, aber bei sehr kleinen Vesikeln sind stochastische Effekte unvermeidlich.
Das gelgestützte Quellverfahren beruht auf der Abscheidung von beschallten Vesikeln (SUVs) auf einer getrockneten Agaroseoberfläche. Während des Trocknungsprozesses bildet sich ein Konzentrationsgradient der Vesikel und die Lipidkonzentration ist an der Peripherie des Spots am höchsten. Dies ist auf ein Phänomen zurückzuführen, das als Kaffeefleckeneffekt bekannt ist41,42. Dies hat zur Folge, dass nur ein kleiner Bereich innerhalb des Spots eine Konzentration an Lipiden enthält, die für die GUV-Bildung geeignet sind. Kreisförmige, ungleichmäßig konzentrierte Lipidflecken führen zu großen ungenutzten Flächen, die für die Vesikelfusion nicht zur Verfügung stehen. Daher wird die Effizienz der GUV-Bildung bei diesem Ansatz gering. Um die Ausbeute an GUVs zu erhöhen, sollte eine gleichmäßige Lipidabscheidung angestrebt werden, die durch Schleuderbeschichtung42 oder Nutzung des Kaffeefleckeneffekts41 erreicht werden kann.
Weitere Hinweise zum Protokoll:
Es sollte darauf geachtet werden, dass mehrere Membranproteine (>10) durchschnittlich pro Vesikel rekonstituiert werden, um stochastische Effekte zu vermeiden. Vermeiden Sie daher Lipid-Protein-Verhältnisse von mehr als 400:1 w/w. Für die meisten Proteine wird eine zufällige Orientierung angenommen.
Im Idealfall ist das Volumen der Gesamtmembranproteine so klein wie möglich und überschreitet sowieso nicht 10-20% des Liposomenvolumens. Durch die Zugabe größerer Volumina wird mehr Waschmittel eingebracht und die Mehrheit der vorgeformten Liposomen kann lysieren, was sich negativ auf die Rekonstitutionseffizienz auswirken kann.
Die Voräquilibrierung des Extruders mit der entsprechenden Lösung ist wichtig, um eine Verdünnung der Komponenten während der Verkapselung zu vermeiden. Im Idealfall sollte die Voräquilibrierungslösung auch die löslichen Enzyme enthalten, aber die Einbeziehung von Enzymen kann aufgrund des relativ großen Volumens, das für die Voräquilibrierung des Extruders benötigt wird, zu kostspielig sein. Daher lassen wir diese Komponenten in der Regel weg und akzeptieren eine 5%ige Verdünnung der Enzyme.
Den Gemischen, die Proteoliposomen enthalten, sollten Ionophore zugesetzt werden, da die Moleküle stark hydrophob sind und an Oberflächen adsorbieren können, wenn keine Vesikel vorhanden sind. Es ist darauf zu achten, dass das zugegebene Lösungsmittelvolumen gering ist (<1 % des gesamten Reaktionsvolumens). Es werden Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Lösungsmittel die Stoffwechselnetzwerke in den Vesikeln nicht beeinflussen. Ionophorkonzentrationen von etwa 1 μM sind im Allgemeinen sicher für Gesamtlipidkonzentrationen von ~3 mg/ml.
Es sollte darauf geachtet werden, dass die Tröpfchen gründlich getrocknet werden. Wenn die Tröpfchen nicht trocken genug sind, ist die GUV-Bildung weniger effizient, da Lipide Lipidaggregate bilden und sich MLVs bilden können, wenn die Quelllösung hinzugefügt wird.
Glukose wird verwendet, um die Osmolarität des äußeren mit dem inneren Medium abzugleichen; Letzteres enthält Saccharose anstelle von Glukose, um die Dichte der Vesikel zu erhöhen und dadurch die Sedimentation der GUVs zu erleichtern. Darüber hinaus erhöht Glukose in der äußeren Umgebung den Phasenkontrast, wodurch das Vesikel leichter sichtbar wird.
Stochastische Effekte sind bei GUVs viel weniger ein Problem; Hier kann das Oberflächen-Volumen-Verhältnis jedoch inakzeptabel niedrig werden, so dass die Anzahl der Membranproteine (z. B. Transporter) für das interne Stoffwechselnetzwerk limitierend wird. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode erlaubt keine genaue Kontrolle über die Größe der ProteoGUVs, aber die Mehrzahl fällt in den Größenbereich von 5-50 μm.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Arbeit einen umfassenden Überblick über die Rekonstitution von Membranproteinen und die Enzymverkapselung in Lipidvesikeln unterschiedlicher Größe bietet. Wir demonstrieren den Aufbau von funktionellen Vesikeln für die Synthese von ATP und Bausteinen aus einfachen Vorläufern wie Aminosäuren und Glycerin. Die Rekonstitution von Membranproteinen in GUVs bleibt eine Herausforderung, aber die hier vorgestellten Protokolle ebnen den Weg für weitere Entwicklungen in der Bottom-up-Forschung in der synthetischen Biologie.

Der Bereich der synthetischen Biologie von unten konzentriert sich auf die Konstruktion von (minimalen) Zellen 1,2 und metabolischen Bioreaktoren für biotechnologische 3,4 oder biomedizinische Zwecke 5,6,7,8. Die Konstruktion synthetischer Zellen bietet eine einzigartige Plattform, die es Forschern ermöglicht, (Membran-)Proteine unter genau definierten Bedingungen zu untersuchen, die denen der natürlichen Umgebung nachahmen, und ermöglicht so die Entdeckung von emergenten Eigenschaften und verborgenen biochemischen Funktionen von Proteinen und Reaktionsnetzwerken9. Als Zwischenschritt hin zu einer autonom funktionierenden synthetischen Zelle werden Module entwickelt, die wesentliche Merkmale lebender Zellen wie metabolische Energieerhaltung, Protein- und Lipidsynthese sowie Homöostase erfassen. Solche Module erweitern nicht nur unser Verständnis des Lebens, sondern haben auch Anwendungsmöglichkeiten in den Bereichen Medizin8 und Biotechnologie10.
Transmembranproteine sind das Herzstück praktisch jedes Stoffwechselnetzwerks, da sie Moleküle in oder aus der Zelle transportieren, Signale senden und auf die Qualität der Umwelt reagieren und zahlreiche biosynthetische Rollen spielen. Daher erfordert das Engineering von Stoffwechselmodulen in synthetischen Zellen in den meisten Fällen die Rekonstitution von integralen und/oder peripheren Membranproteinen zu einer Membrandoppelschicht, die aus spezifischen Lipiden besteht und eine hohe Integrität (geringe Permeabilität) aufweist. Der Umgang mit diesen Membranproteinen ist anspruchsvoll und erfordert spezifisches Wissen und experimentelle Fähigkeiten.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Membranproteine in Phospholipid-Vesikeln zu rekonstituieren, meist mit dem Ziel, die Funktion11,12, die Regulation13, die kinetischen Eigenschaften14,15, die Lipidabhängigkeit15,16 und/oder die Stabilität17 eines spezifischen Proteins zu untersuchen. Diese Verfahren umfassen die rasche Verdünnung von durch Detergenzien gelöstem Protein in wässrigen Medien in Gegenwart von Lipiden18, die Entfernung von Detergenzien durch Inkubation von durch Detergenzien gelöstes Protein mit detergenzient destabilisierten Lipidvesikeln und die Absorption des Detergens bzw. der Detergenzien auf Polystyrolkügelchen19 oder das Entfernen von Detergenzien durch Dialyse oder Größenausschlusschromatographie20. Organische Lösungsmittel wurden verwendet, um Lipidvesikel zu bilden, z. B. durch die Bildung von Öl-Wasser-Interphasen21, aber die Mehrzahl der integralen Membranproteine wird inaktiviert, wenn sie solchen Lösungsmitteln ausgesetzt werden.
In unserem Labor rekonstituieren wir hauptsächlich Membranproteine mit der Detergenz-Absorptionsmethode zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs)19. Dieses Verfahren ermöglicht die Co-Rekonstitution mehrerer Membranproteine und die Verkapselung von Enzymen, Metaboliten und Sonden im Vesikellumen22,23. Die Membranprotein-haltigen LUVs können in riesen-unilamelläre Vesikel (GUVs) mit/ohne Verkapselung wasserlöslicher Komponenten umgewandelt werden, wobei entweder die Elektroformation24 oder die gelgestützte Quellung25 und spezifische Bedingungen zur Erhaltung der Integrität der Membranproteine26 verwendet werden.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Rekonstitution eines außerhalb des Gleichgewichts befindlichen metabolischen Netzwerks in LUVs vorgestellt, das ATP durch den Abbau von L-Arginin in L-Ornithin regeneriert27. Die Bildung von ATP ist an die Produktion von Glycerin-3-phosphat (G3P) gekoppelt, einem wichtigen Baustein für die Phospholipidsynthese22,28. Der Stoffwechselweg besteht aus zwei integralen Membranproteinen, einem Arginin/Ornithin (ArcD) und einem G3P/Pi-Antiporter (GlpT). Darüber hinaus werden drei lösliche Enzyme (ArcA, ArcB, ArcC) für das Recycling von ATP benötigt, und GlpK wird verwendet, um Glycerin in Glycerin-3-phosphat umzuwandeln, wobei das ATP aus dem Abbau von L-Arginin verwendet wird, siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über den Weg. Dieses Protokoll stellt einen guten Ausgangspunkt für den zukünftigen Aufbau noch komplexerer Reaktionsnetzwerke dar - für die Synthese von Lipiden oder Proteinen oder die Teilung von Zellen. Die Lipidzusammensetzung der Vesikel unterstützt die Aktivität einer Vielzahl von integralen Membranproteinen und wurde für den Transport verschiedener Moleküle in oder aus den Vesikeln optimiert 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den Weg der ATP-Produktion und der Glycerin-3-phosphat-Synthese und -Ausscheidung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Kurz gesagt, gereinigte Membranproteine (solubilisiert in Dodecyl-β-D-Maltosid, DDM) werden zu vorgeformten Lipidvesikeln hinzugefügt, die mit Triton X-100 destabilisiert wurden, was die Insertion der Proteine in die Membran ermöglicht. Die Detergensmoleküle werden anschließend (langsam) durch die Zugabe von aktivierten Polystyrolkügelchen entfernt, was zur Bildung von gut verschlossenen Proteoliposomen führt. Lösliche Bestandteile können dann zu den Vesikeln hinzugefügt und über Gefrier-Tau-Zyklen verkapselt werden, wodurch die Moleküle im Prozess der Membranfusion eingefangen werden. Die gewonnenen Vesikel sind sehr heterogen und viele sind multilamell. Sie werden dann durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 400, 200 oder 100 nm extrudiert, was zu gleichmäßiger großen Vesikeln führt; Je kleiner die Porengröße, desto homogener und unilamellär sind die Vesikel, jedoch zum Preis eines kleineren inneren Volumens. Nicht eingebaute Proteine und kleine Moleküle werden durch Größenausschlusschromatographie aus der externen Lösung entfernt. Die proteoLUVs können durch gelgestütztes Aufquellen in mikrometergroße Vesikel umgewandelt werden, und diese proteoGUVs werden dann gesammelt und in einem mikrofluidischen Chip zur mikroskopischen Charakterisierung und Manipulation gefangen. Abbildung 2 zeigt einen schematischen Überblick über das gesamte Protokoll.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Überblick über das Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln mit Submikrometer- (LUVs) und Mikrometergröße (GUVs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Rekonstitutions- und Verkapselungsprotokolle funktionieren gut und die Funktionalität der Proteine bleibt erhalten, aber die proteoLUVs und proteoGUVs sind heterogen groß. Mikrofluidische Ansätze 31,32 ermöglichen die Bildung von mikrometergroßen Vesikel, die in ihrer Größe homogener sind, aber eine funktionelle Rekonstitution von Membranproteinen ist im Allgemeinen nicht möglich, da das restliche Lösungsmittel in der Doppelschicht die Proteine inaktiviert. Die ProteoLUVs haben eine Größe von 100 bis 400 nm, und bei niedrigen Enzymkonzentrationen kann die Verkapselung zu Vesikeln mit unvollständigen Stoffwechselwegen führen (stochastische Effekte; siehe Abbildung 3). LUVs sind ideal für den Aufbau spezifischer Stoffwechselmodule, wie hier gezeigt, für die Produktion von ATP und Bausteinen wie G3P. Solche proteoLUVs können möglicherweise in GUVs eingekapselt werden und als organellenähnliche Kompartimente für die Wirtsvesikel dienen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Anzahl der Moleküle pro Vesikel mit einem Durchmesser von 100, 200 oder 400 nm. (A) Wenn die verkapselten Proteine (Enzyme, Sonden) im Bereich von 1-10 μM liegen. (B) Die Rekonstitution erfolgt bei 1 bis 1.000, 1 bis 10.000 und 1 bis 100.000 Membranproteinen pro Lipid (mol/mol). Wir gehen davon aus, dass Moleküle in den angegebenen Konzentrationen verkapselt und bei diesen Protein-Lipid-Verhältnissen in die Membran eingebaut werden. Bei einigen Enzymen haben wir gesehen, dass sie an Membranen binden, was ihre scheinbare Konzentration in den Vesikeln erhöhen kann. Abkürzung: LPR = Lipid-Protein-Ratio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Dichtfilter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore Zentrifugalfiltereinheiten Amicon Ultra</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Formedium-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Saccharose</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fürmedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>Jasco</td><td>Spektrofluorometer FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Schwerkraft-Durchflusssäule</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 100 & Mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 1000 & Mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Handheld LCP Dispenser</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Handheld</td><td>Sonicator Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Large Falcon Tube Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithin</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Laser Scanning Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidik Chip</td><td>Hausgemacht&nbsp;</td><td>PDMS based</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrometer</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 Spektralphotometer NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln für GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Nadeln für die Mikrofluidik</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Osmolalitätsmessgerät</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 basic Gefrierpunkt Osmometer</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat Filter</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membran Produkt: 10417104</td><td>0,4 &micro; m</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranin</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Quarzküvette (schwarz)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 Harz&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Sonics Sonics & Materialien INC</td><td>Sonics Vibrationszelle</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0,2</td><td>0,2 &micro; m</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Zentrifuge 5418</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-Abstandshalter</td><td>Hausgemacht&nbsp;</td><td>Teflonbasis</td><td>45 x 26 x 1,5 oder 45 x 26 x 3 oder 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>Spektroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spektrometer</td><td>Jasco</td><td>V730 Spektralphotometer</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

aufbau von stoffwechselnetzwerken außerhalb des gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen vesikeln

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Wir stellen eine Methode vor, um komplexe Proteinnetzwerke in Vesikel einzubauen, an denen integrale Membranproteine, Enzyme und fluoreszenzbasierte Sensoren unter Verwendung gereinigter Komponenten beteiligt sind. Diese Methode ist relevant für das Design und den Bau von Bioreaktoren und die Untersuchung komplexer metabolischer Reaktionsnetzwerke außerhalb des Gleichgewichts. Wir beginnen mit der Rekonstitution von (mehreren) Membranproteinen zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs) nach einem zuvor entwickelten Protokoll. Anschließend verkapseln wir ein Gemisch aus gereinigten Enzymen, Metaboliten und fluoreszenzbasierten Sensoren (fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe) mittels Gefrier-Auftau-Extrusion und entfernen nicht eingebaute Komponenten durch Zentrifugation und/oder Größenausschlusschromatographie. Die Leistung der Stoffwechselnetzwerke wird in Echtzeit gemessen, indem das ATP/ADP-Verhältnis, die Metabolitenkonzentration, der interne pH-Wert oder andere Parameter durch Fluoreszenzauslesung überwacht werden. Unsere Membranprotein-haltigen Vesikel mit einem Durchmesser von 100-400 nm können mit bestehenden, aber optimierten Verfahren in riesig-unilamelläre Vesikel (GUVs) umgewandelt werden. Der Ansatz ermöglicht den Einbau löslicher Komponenten (Enzyme, Metaboliten, Sensoren) in mikrometergroße Vesikel, wodurch das Volumen der Bioreaktoren um Größenordnungen vergrößert wird. Das metabolische Netzwerk, das GUVs enthält, wird in mikrofluidischen Geräten gefangen, um sie mit optischer Mikroskopie zu analysieren.

Die Rekonstitution von solubilisierten Membranproteinen in Liposomen erfordert die Destabilisierung von vorgeformten Vesikel. Die Zugabe geringer Mengen an Triton X-100 führt zunächst zu einer Erhöhung der Absorption bei 540 nm (A540) aufgrund einer Zunahme der Lichtstreuung durch die Schwellung der Vesikel (Abbildung 4). Der maximaleA-540-Wert ist der Punkt, an dem die Liposomen mit Detergens (Rsat) gesättigt sind, wonach jede weitere Zugabe von Triton X-100 zu einer teilweisen Solubilisierung der Vesikel führt. Bei Rsol sind die Liposomen vollständig solubilisiert (Abbildung 4). Für die Rekonstitution von Membranproteinen verwenden wir typischerweise Vesikel, die zu 60% über Rsat destabilisiert sind (durch Pfeil gekennzeichnet).
Das rekonstituierte Membranprotein ArcD wird für den Transport von L-Arginin in die Vesikel und L-Ornithin aus den Vesikeln verwendet und wird zusammen mit den verkapselten Enzymen ArcA, ArcB und ArcC verwendet, um ATP aus ADP und anorganischem Phosphat zu recyceln. GlpT ist ein Glycerin-3-phosphat/Phosphat-Antiporter, der zusammen mit GlpK für die Synthese (und Ausscheidung) von Glycerin-3-phosphat aus Glycerin plus ATP benötigt wird, das durch den L-Arginin-Abbau produziert wird. Die Zugabe von 5 mM L-Arginin bei t = 0 zu den Proteoliposomen führt zu einem steilen Anstieg des Verhältnisses der PercevalHR-Fluoreszenz bei 500 nm und 430 nm Anregung39, was das ATP/ADP-Verhältnis innerhalb der Vesikel widerspiegelt (Abbildung 5). Bei Zugabe von Glycerin wird das ATP für die Synthese von Glycerin-3-phosphat verwendet, was zu einer Absenkung des ATP/ADP-Verhältnissesführt 28. Der Abbau von L-Arginin führt auch zu pH-Veränderungen, die mit Pyranin oder pHluorin quantifiziert werden können27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Recycling von ATP über den L-Arginin-Abbauweg. LUVs mit 2,7 mg Lipid/ml werden in eine Küvette gegeben und das Fluoreszenzverhältnis bei 500 nm und 430 nm aufgezeichnet. 5 mM L-Arginin werden bei t = 0 zugegeben. Das F500/F430-Verhältnis ist ein Maß für das ATP/ADP-Verhältnis in den Vesikel. Abkürzung: LUVs = groß-unilamelläre Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die ATP-produzierenden LUVs können auch zur Bildung von GUVs verwendet werden. Die Rehydrierung von getrockneten Proteo-LUVs auf einem LGT Agarosegel führt zur Bildung von mikrometergroßen Vesikeln (Abbildung 6). Die Bildung von Proteo-GUVs innerhalb der getrockneten LUV-Spots hängt stark von der lokalen Konzentration der Lipide und dem Grad der Dehydratisierung ab. In einigen Gebieten gibt es große Flecken von GUVs, während an anderen Stellen im selben Tröpfchen keine oder nur wenige GUVs gebildet werden können. Die Bildung von GUVs über die LGT-Agarose-unterstützte Quellung führt zu einer Reihe von GUV-Größen, typischerweise von wenigen Mikrometern bis zu mehr als 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Abbildung 6: DIC-Bilder von ProteoGUVs, die durch gelgestützte Schwellung gebildet werden. Maßstabsleiste = 25 μm. Abkürzungen: DIC = differentieller Interferenzkontrast; GUVs = riesig-unilammellares Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die GUVs werden geerntet und in einem β-Kasein-passivierten PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät gefangen (Abbildung 7). Das Gerät ist so konzipiert, dass viele Vesikel in einem einzigen Experiment gefangen und analysiert werden können, und das Gerät wird zur Steuerung der externen Umgebung (Flussrate, Pufferzusammensetzung usw.) verwendet. 34. Selbst wenn die Ausbeute an Proteo-GUVs gering ist, können durch den konstanten Fluss von GUVs durch den mikrofluidischen Chip viele Vesikel gesammelt werden. Sobald genügend GUVs gefangen sind, wird das System mit einem osmotisch ausgeglichenen Puffer gewaschen, um externe Komponenten wie lösliche Proteine, kleine Moleküle und Fluoreszenzsonden zu entfernen. Der Waschpuffer wird dann durch eine Substratlösung gleicher Osmolalität ersetzt, die 50 mM KPi (pH 7,0), unterschiedliche Mengen an Glukose (zur Einstellung der Osmolalität) und Substrate wie 10 mM L-Arginin enthält. Es wird ein Zeitreihenexperiment an mehreren Traps des Mikrofluidik-Chips durchgeführt und alle 90 s Bilder aufgenommen (405 nm und 488 nm Anregung bei Verwendung von PercevalHR). Weiterhin wird zu jedem Zeitpunkt ein Hellfeldbild aufgenommen. Das Verhältnis der Emissionsintensitäten nach Anregung bei 488 und 405 nm ist ein Maß für das ADP/ATP-Verhältnis in den Vesikel.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Abbildung 7: Einfangen von Vesikeln mit dem Mikrofluidik-Chip. (A) Einfangen der Vesikel, begleitet von der Fähigkeit, die äußere Umgebung und die Flussrate zu kontrollieren. (B) ProteoGUVs, die in einem mikrofluidischen Gerät gefangen sind und mit einem 405-nm-Laser (grün) und einem 488-nm-Laser (rot) angeregt werden. Die Emission für beide Kanäle wird bei &gt;500 nm gemessen. Das Hellfeldbild ermöglicht die Visualisierung der Vesikel ohne Fluoreszenz. Maßstabsleiste = 25 μm. Abkürzung: GUVs = riesen-unilamelläre Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

In den Niederlanden zielt das BaSyC-Konsortium darauf ab, synthetische Zellen aus molekularen Bausteinen zu konstruieren. Das BaSyC-Konsortium setzt sich aus Forschungsgruppen zusammen, die von der Molekularbiologie über Chemie und Physik bis hin zu Computational Sciences reichen. Das Ziel dieses Konsortiums ist es, ein sich selbst replizierendes System zu schaffen, das in der Lage ist, autonom zu wachsen, Informationen zu übertragen und zu teilen.Und wir konzentrieren uns derzeit auf den Aufbau molekularer Netzwerke, die in komplexere molekulare Systeme integriert sind. Zu den jüngsten Entwicklungen in der synthetischen Biologie gehört die Entwicklung von Modulen für zelluläre Funktionen und deren Integration in komplexe Netzwerke für Anwendungen in der Diagnostik, Therapie, synthetischen Immunologie und adaptiven Materialien. Dieser Fortschritt erstreckt sich über Gruppen in Europa, Amerika und Asien und fördert sowohl Top-down- als auch Bottom-up-Ansätze für den Aufbau synthetischer Zellen.Zu den aktuellen Technologien in unserem Bereich gehören die ingenieurwissenschaftlichen und evolutionären Methoden zum Aufbau und zur Optimierung von Stoffwechselnetzwerken. Wir nutzen KI für die molekulare Selektion und fortschrittliche biochemische und biophysikalische Techniken für die Isolierung von Komponenten und die Bildung von Netzwerken. Wir setzen auch Membranrekonstitution, physikalische Verkapselung und Visualisierung mittels Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie ein.Mit der Integration von Modulen steigt die Anzahl der Membranproteine und Enzyme enorm an, was unsere Rekonstitutions- und Verkapselungstechnologien vor Einschränkungen stellt. Die stochastische Verkapselung wird bei Vesikeln im Submikrometerbereich zu einem Problem, und die Effizienz der Bildung von mikrometergroßen Vesikeln nimmt ab, wenn mehrere Membranproteine in der Lipidmembran rekonstituiert werden. In Groningen haben wir metabolische Netzwerke für die ATP-Produktion und die Aufrechterhaltung eines außerhalben Gleichgewichtszustands durch Substratfütterung und Produktexport entwickelt.Darüber hinaus haben wir das ATP-Recycling mit der Synthese und Ausscheidung von Lipidvorläufern verknüpft, wodurch sekundäre Vesikel in die Lage versetzt werden, Lipide zu produzieren, was einen bedeutenden Fortschritt in unserem Bereich darstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

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