Name: Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie ein verbessertes Rattenmodell für die Okklusion der mittleren Hirnarterie mit erhaltener Gefäßanatomie. Diese mikrochirurgische Methode ermöglicht präzise Schlaganfallforschung mit minimaler Mortalität.

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Diese Arbeit wurde 2023 vom Hebei Province Introducing Foreign Intelligence Project unterstützt. Wir danken Lisa Kreiner, PhD, von Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Das experimentelle Verfahren erhielt die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee an der Yantai University (Zulassungsnummer: YTDX20230410) und entsprach den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für diese Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 g verwendet. Eine umfassende Liste der verwendeten Tiere, Reagenzien und Geräte finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung von Tieren
<ol>
	<li>Halten Sie die Tiere in einer Umgebung, in der ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus, kontrollierte Temperatur und Luftfeuchtigkeit eingehalten werden. Stellen Sie sicher, dass sie uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser haben.</li>
</ol>
2. Anästhesie
<ol>
	<li>Betäuben Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung, die Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) enthält. 
	HINWEIS: Neigen Sie den Kopf und den Körper der Ratten nach unten. Die Injektionsstelle befindet sich im unteren rechten Quadranten des Abdomens des Tieres. Ziehen Sie den Kolben zurück, bevor Sie injizieren. Das durchschnittliche Injektionsvolumen beträgt 0,4 ml.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Einleitung der Anästhesie, indem Sie den Rückzugsreflex der Hinterpfote und den Blinzelreflex beurteilen. Wenn keine ausreichende Anästhesietiefe erreicht wird, ergänzen Sie während des chirurgischen Eingriffs mit Isofluran.</li>
</ol>
3. Verfahren zur ischämischen Modellierung
<ol>
	<li>Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven. Desinfizieren Sie die Operationstische und die zugehörige Ausrüstung mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie das Fell um die vorgesehene Inzisionsstelle herum rasieren. Desinfizieren Sie die Haut an der Operationsstelle dreimal mit Betadin und 70% Ethanol.</li>
	<li>Machen Sie einen ca. 1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie auf der Bauchseite und öffnen Sie die oberflächliche Faszie.</li>
	<li>Führen Sie eine scharfe und stumpfe Dissektion durch, um die Arteria carotis externa (ECA), die Arteria carotis interna (ICA) und die Arteria carotis communis (CCA) gemäß der zuvor beschriebenen Methode freizulegen7.</li>
	<li>Platzieren Sie drei 4-0-Seidennähte um die CCA und eine weitere Seidennaht durch die ECA in der Nähe der ICA-Bifurkation. Binden Sie einen lösbaren Schlupfknoten auf den proximalen CCA. Ziehen Sie die Naht an der distalen CCA mit einem Blutstiller fest, um den Blutfluss zu blockieren. Binden Sie während des Nähens einen weiteren Schlupfknoten locker um den CCA, um sicherzustellen, dass das Gefäß nicht verschlossen wird. 
	HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlupfknoten nicht zu eng ist, sondern nur ausreichend, um den Blutfluss zu blockieren, da er während der Gefäßnaht gelöst werden muss.</li>
	<li>Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 mm breiten Schnitt zwischen der proximalen Seidennaht und der mittleren Naht auf dem CCA. 
	HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt es dem Filament (silikonbeschichtete Spitze) ermöglicht, in das CCA einzudringen.</li>
	<li>Führen Sie ein 3 cm langes 4-0 Filament (silikonbeschichtete Spitze) in den CCA ein. Ziehen Sie die Seidennähte um das CCA fest, um das intraluminale Filament zu sichern und Blutungen zu vermeiden. Entfernen Sie dann die Naht aus dem distalen CCA.</li>
	<li>Führen Sie das Filament weiter in das Lumen des MCA ein und kontrollieren Sie die Nähte um das ECA, um sicherzustellen, dass das Filament nicht in das ECA eindringt. Die Einstecklänge beträgt typischerweise 18 mm bis 20 mm.</li>
	<li>Starten Sie einen Timer und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Okklusion beginnt. Vernähen Sie den Halsschnitt mit 3-0 Seidenfäden und legen Sie das Tier vorsichtig in einen Aufwachkäfig. Verabreichen Sie 0,5 ml normale Kochsalzlösung intraperitoneal.</li>
</ol>
4. Mikrochirurgisches Nähen des CCA
<ol>
	<li>Betäuben Sie die Ratte 1,5 h nach der Ischämie erneut. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle dreimal mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie den Schnitt erneut.</li>
	<li>Ziehen Sie das okkludierende Filament vorsichtig zurück, bis die weiße Spitze in der Nähe des CCA-Schnitts deutlich sichtbar ist. Platzieren Sie eine Mikroklemme horizontal in der Nähe des gesicherten intraluminalen Nahtknotens in der Nähe der CCA-Bifurkation. 
	HINWEIS: Vermeiden Sie es, die weiße Filamentspitze einzuklemmen, um ein Ablösen des Silikons und eine anschließende Thrombose zu verhindern.</li>
	<li>Lösen Sie den gesicherten intraluminalen Nahtknoten und entfernen Sie das Filament vollständig.</li>
	<li>Platzieren Sie eine weitere Mikroklemme in der Nähe der Herzseite des proximalen CCA-Knotens. Anschließend entfernen Sie den Nahtknoten um das proximale CCA. 
	HINWEIS: Die richtige Platzierung der Klemmen ist entscheidend für die Anhebung fixierter Gefäße in späteren Schritten, um die mikrovaskuläre Naht zu erleichtern. Platzieren Sie die Klammern horizontal auf den umgebenden Muskeln, um ein Verrutschen zu verhindern.</li>
	<li>Spülen Sie die Inzisionsstelle mit normaler Kochsalzlösung ab und trocknen Sie den Bereich mit einem sterilen Wattebausch, um das Blut zu entfernen und ein klares Operationsfeld zu erhalten.</li>
	<li>Unter einem Mikroskop (4-fache Vergrößerung) nähen Sie den CCA-Schnitt mit 11-0 mikrochirurgischen Nähten in einem unterbrochenen Muster, wobei je nach Schnittgröße in der Regel zwei Stiche erforderlich sind.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Nähen die Mikroklemmen an beiden Enden des CCA, um den Blutfluss wiederherzustellen.</li>
	<li>Üben Sie mit einem sterilen Wattebausch 30 s lang Druck auf die CCA-Nahtstelle aus. Beobachten Sie die CCA 2 Minuten lang, um sicherzustellen, dass keine Blutungen auftreten. Nähen Sie den Halsschnitt der Ratte und legen Sie das Tier zur Narkosewiederherstellung in eine 35 °C Pflegebox, bevor Sie es in den Käfig zurückbringen. 
	HINWEIS: Intraperitoneal mit Meloxicam in einer Dosis von 2 mg/kg zur postoperativen Analgesie verabreichen.</li>
</ol>
5. Färben mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
<ol>
	<li>Drei Tage nach der Ischämie-Reperfusion werden die Tiere unter tiefer Narkose mit 4% Isofluran und Zervixluxation eingeschläfert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gehirne und schneiden Sie sie mit einer Skalpellklinge in 2 mm dicke Kronenabschnitte8.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hirnabschnitte mit 2% TTC für 20 min bei 37 °C.</li>
	<li>Spülen Sie die Gehirnabschnitte zweimal mit 10 % Formalin aus und fixieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 % Formalin.</li>
	<li>Nehmen Sie digitale Fotos von aufeinanderfolgenden Schnitten auf und messen Sie die Infarktbereiche quantitativ mit der Image J-Software.</li>
</ol>
6. Neurologischer Funktionstest
HINWEIS: Die neurologische Funktion wurde mit dem Garcia-Test bewertet, nach einem früheren Bericht9.
<ol>
	<li>Beurteilen Sie die spontane Aktivität, die Symmetrie in der Bewegung aller vier Gliedmaßen, das Ausstrecken der Vorderpfote, das Klettern, die Propriozeption des Körpers und die Reaktion auf Vibrissae-Berührungen. Vergeben Sie Punktzahlen basierend auf den Garcia-Testkriterien, wobei eine maximale Punktzahl von 18 Punkten auf eine normale neurologische Funktion hinweist.</li>
</ol>
7. Statistische Analyse
<ol>
	<li>Verwenden Sie GraphPad Prism, um statistische Analysen mit dem Student's t-Test durchzuführen. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus. Betrachten Sie Unterschiede zwischen den Mittelwerten als statistisch signifikant, wenn P 0,05 <.</li>
</ol>

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats with Preserved Vascular Anatomy

<ol><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((China+stroke+surveillance+report+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">China stroke surveillance report 2021.</a> Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oxidative+stress+and+inflammation+to+prevent+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury.</a> Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).</li>
<li>Ringelstein, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+extent+of+hemispheric+brain+infarctions+and+clinical+outcome+in+early+and+delayed+middle+cerebral+artery+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization.</a> Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%3A+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jap+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+Impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+Doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice.</a> J Vis Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icaritin+inhibits+neuroinflammation+in+a+rat+cerebral+ischemia+model+by+regulating+microglial+polarization+through+the+GPER-ERK-NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway.</a> Mol Med. 28 (1), 142(2022).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+Deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).</li>
<li>Bracko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitropropionic+acid-induced+ischemia+tolerance+in+the+rat+brain+is+mediated+by+reduced+metabolic+activity+and+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).</li>
<li>Goldmacher, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+bone+marrow+stem+cells+and+their+effects+in+the+rat+MCAO+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model.</a> PLoS One. 8 (3), e60049(2013).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease.</a> Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).</li>
<li>Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+and+strain-related+variables+significantly+affect+outcome+in+a+murine+model+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia.</a> Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.

MCAo ist eine weit verbreitete Methode zur Erstellung von Tiermodellen für Schlaganfälle, die den bei Patienten beobachteten Schlaganfallprozess effektiv repliziert, indem der Blutfluss nach Ischämie wiederhergestelltwird 10,11,12. Unser Labor hat ein ischämisches Schlaganfallmodell entwickelt, das eine Reperfusion aus dem CCA ermöglicht, ohne das ECA zu schädigen. Nach der Induktion der Ischämie wird eine mikrochirurgische Reparatur der CCA durchgeführt. Obwohl keine direkte Messung des CCA-Blutflusses durchgeführt wurde, beobachteten die Experimentatoren eine vaskuläre Pulsation in der CCA, bevor sie mit der Reperfusion fortfuhren. Diese Technik bewahrt die anatomische Integrität der Halsgefäße und ähnelt gleichzeitig dem Schlaganfallprozess bei Patienten. Darüber hinaus haben Auswertungen der neurologischen Funktion und des Bereichs der Hirnischämie die Validität des durch diesen chirurgischen Ansatz induzierten Schlaganfalls bestätigt.
Die zuvor beschriebenen ischämischen Schlaganfallmodelle können von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden. Bei der Methode von Koizumi et al.4 stützt sich die Blutreperfusion aufgrund der Ligatur des CCA stark auf den Willis-Kreis. Variationen des zerebralen Gefäßsystems können jedoch das endgültige Hirninfarktvolumen beeinflussen und möglicherweise die Mortalitätsrate des Schlaganfallmodells aufgrund der geringen Blutperfusion erhöhen13,14. Darüber hinaus kann eine Ischämie der ECA die Funktion der Gesichtsmuskulatur und der Nerven beeinträchtigen, was sich auf die Beurteilung verschiedener neurologischer Funktionen auswirkt 15,16.
Die aktuelle Methode begegnet diesen Herausforderungen durch drei wichtige Schritte: (1) Halten Sie den CCA-Schnitt so klein wie möglich, nur groß genug für das Einsetzen von Filamenten, wodurch der Zeitaufwand und die mit der Gefäßnaht verbundenen Schäden reduziert werden. (2) Platzieren Sie mikrovaskuläre Klemmen so nah wie möglich an der CCA-Bifurkation, wenn Sie die distale CCA klemmen, um ein Einklemmen der weißen Filamentspitze zu verhindern, das zu Silikonablösung und Thrombose führen könnte. (3) Beobachtung der CCA auf wiederaufgenommene Pulsation und das Fehlen wesentlicher Blutungen vor dem Nähen des Mittellinienschnitts am Hals nach der Gefäßreparatur.
Die aktuelle Methode weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens besteht die Möglichkeit, dass sich an der Nahtstelle Embolien bilden, die bei einer Ablösung zu einer weiteren Hirnischämie führen können. Dieses Risiko sollte in zukünftigen Experimenten sorgfältig abgewogen und gehandhabt werden. Zweitens wurde in der Studie das Körpergewicht der Ratten nicht überwacht, was es schwierig macht, festzustellen, ob die Methode ihre Nahrungsaufnahme beeinflusst hat. Die Nahrungsaufnahme ist ein direkter Indikator für die Vorteile der Methode, und ihre Bewertung könnte wertvolle Erkenntnisse liefern. Schließlich erfordert die derzeitige Methode technische Kenntnisse in mikrochirurgischen Operationen, was ihre breite Anwendung ohne angemessene Ausbildung und Fachwissen einschränken kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MCAo-Modellierungsmethode zwar eine hohe physiologische Relevanz und strukturelle Integrität bietet, aber mit Einschränkungen verbunden ist, die für robustere Experimente behoben werden müssen. Die Erhaltung der anatomischen Integrität der Halsgefäße und die genaue Simulation von Schlaganfallprozessen bei Patienten sind wesentliche Stärken der Methode. Dieser Ansatz wird zweifellos wesentlich zur Erforschung des ischämischen Schlaganfalls beitragen und die Zuverlässigkeit und Genauigkeit experimenteller Modelle verbessern. Letztendlich kann dies dazu führen, dass weniger Versuchsgruppen benötigt werden, um therapeutische Wirkungen zu testen, was zu zuverlässigeren experimentellen Ergebnissen führt.

Schlaganfall, die häufigste Todesursache und langfristige neurologische Dysfunktion bei Erwachsenen weltweit, umfasst verschiedene Arten, wobei ischämischer Schlaganfall etwa 81,9% der Fälle ausmacht, während Hirnblutungen und Subarachnoidalblutungen 14,9% bzw. 3,1% ausmachen1. Ein ischämischer Schlaganfall resultiert häufig aus Arteriosklerose oder einem Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA), was zu einer Verringerung des lokalen zerebralen Blutflusses und einer anschließenden Hirnschädigung führt. Diese Verringerung der Nährstoffversorgung der ischämischen Zellen löst einen Energiemangel aus, der zu einem Verlust der Membranintegrität, einer Zellschwellung und schließlich zur Lyse führt. Darüber hinaus tragen Faktoren wie erhöhtes intrazelluläres Kalzium, exzitatorische Aminosäurefreisetzung, erhöhte Produktion freier Radikale und Aktivierung von Entzündungszellen zur Schädigung des Hirngewebes nach einem Schlaganfall bei2.
Die Behandlungsziele für ischämische Schlaganfälle sind vielschichtig: Reduzieren Sie laufende neurologische Schäden und senken Sie die Sterblichkeit und langfristige Behinderung; verhindern Sie Komplikationen, die durch Immobilität und neurologische Dysfunktion entstehen; und minimieren Sie das Risiko eines erneuten Schlaganfalls. Angesichts der Komplexität der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ist ein robustes Schlaganfallmodell für die Forschung und Entwicklung von Behandlungen für ischämische Schlaganfälle unerlässlich.
Derzeit ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAo) ein gängiges Tiermodell für ischämischen Schlaganfall3. MCAo wird typischerweise durchgeführt, indem ein Monofilament mit Silikonspitze oder Flamme durch die zervikalen Gefäße eingeführt wird, bis es den Ursprung der mittleren Hirnarterie (MCA) erreicht. Im Jahr 1986 entwickelten Koizumi und Kollegen eine Technik, bei der ein Monofilament mit Silikonspitze durch einen Schnitt in der Arteria carotis communis (CCA) eingeführt wurde, wodurch es den Eingang der MCA erreichen und seinen Blutfluss blockieren konnte4. Im Jahr 1989 berichtete Longas Gruppe über eine weitere MCAo-Methode, bei der ein Monofilament durch einen Schnitt in der Arteria carotis externa (ECA) eingeführt wurde. Das Monofilament durchläuft dann die Bifurkation der Arteria carotis interna (ICA) und der ECA, bevor es den Ausgangspunkt der MCA5 erreicht.
Die Grenzen der beiden bestehenden Methoden zur Induktion von MCAo sind offensichtlich. Koizumis Methode erfordert eine dauerhafte Blockade des ipsilateralen CCA, was zu einer verminderten MCA-Perfusion führt, da die Reperfusion ausschließlich auf dem Kreis von Willis4 beruht. Umgekehrt beinhaltet die Longa-Methode das Schneiden der ECA, was zu einer Schädigung des ECA-Systems und einer anschließenden Beeinträchtigung der Gesichtsmuskelfunktion führt5. Diese Schädigung kann sich auf die Nahrungs- und Wasseraufnahme auswirken sowie sensorische Funktionsstörungen des Gesichts verursachen, die die Rehabilitation und die Beurteilung der neurologischen Funktion nach ischämischem Schlaganfall beeinträchtigen6.
Das aktuelle Protokoll versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem es eine neue Methode entwickelt, um ein ischämisches Schlaganfallmodell zu induzieren, ohne die anatomische Struktur der Hirngefäße zu beschädigen. Dieser neuartige Ansatz nutzt mikrochirurgische Techniken, um die CCA zu reparieren und so die Nachteile früherer Methoden zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>10% Formalin</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BL913A</td><td></td></tr><tr><td>11-0 mikrochirurgische Nähte</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3/8 1&mal; </td><td></td>5</tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)</td><td>SIGMA</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Seidennaht</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3-0</td><td></td></tr><tr><td>4% Isofluran&nbsp; &nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20221102</tr><tr><td>6-0 Seidennaht</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20230408</tr><tr><td>Filament</td><td>Xinong Technologies Co Ltd.</td><td>2838-A5</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>230613BL</td><td></td></tr><tr><td>Männliche Sprague Dawley Ratten</td><td>Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.</td><td>SCXK (Lu) 20190003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroclips</td><td>Shanghai Jinzhong Medical Device Factory</td><td>W40150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>S100 OPMI pico</td><td></td></tr><tr><td>Pflegebox</td><td>Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.</td><td>FYL-YS-100L</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>SIGMA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr></tbody></table>

ein rattenmodell für den verschluss/die reperfusion der mittleren hirnarterie ohne beschädigung der anatomischen struktur der hirngefäße

A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion Without Damaging the Anatomical Structure of Cerebral Vessels

Ischämischer Schlaganfall ist die Hauptursache für langfristige Behinderung und Mortalität bei Erwachsenen weltweit. Tiermodelle des ischämischen Schlaganfalls haben wesentlich zu unserem Verständnis seiner pathologischen Mechanismen und zur Entwicklung potenzieller Behandlungsmethoden beigetragen. Gegenwärtig gibt es zwei gängige Methoden, bei denen Filamenttechniken (endovaskuläre Nahttechniken) verwendet werden, um Tiermodelle für zerebrale Ischämie zu induzieren. Diese Methoden haben jedoch inhärente Einschränkungen, wie z. B. eine verminderte Durchblutung des Gehirns, eine Schädigung des äußeren Halsschlagadersystems, eine gestörte Nahrungs- und/oder Wasseraufnahme und eine sensorische Dysfunktion des Gesichts. In diesem Artikel wird eine neue Methode zur Induktion eines ischämischen Schlaganfallmodells bei Ratten vorgestellt, ohne die zerebrale Gefäßanatomie zu beeinträchtigen. In dieser Studie wurde die Arteria carotis communis (CCA) von Sprague-Dawley-Ratten freigelegt und ein Schnitt gemacht. Anschließend wurde ein Filament durch den Schnitt in die Arteria carotis interna eingeführt, um die mittlere Hirnarterie zu verschließen. Nach 1,5 h induzierter Ischämie wurde das Verschlussfilament sowohl aus der Arteria carotis interna als auch aus der CCA vollständig entfernt. Der Schnitt in der CCA wurde anschließend mit 11-0 mikrochirurgischen Nähten unter dem Mikroskop vernäht (4-fache Vergrößerung). Durch den Einsatz mikrochirurgischer Techniken zur Reparatur der CCA wurde in dieser Studie erfolgreich eine einzigartige Methode entwickelt, um ein ischämisches Schlaganfallmodell bei Ratten zu induzieren und gleichzeitig die anatomische Integrität der zerebralen Blutgefäße zu erhalten.

Der Mikronahtvorgang 
Der Faden wurde bis nahe zur Einschnittstelle der A. carotis communis zurückgezogen, bis die weiße Fadenspitze sichtbar war (Abbildung 1A). Anschließend wurden Mikroklemmen an der A. carotis communis angebracht (Abbildung 1B). Unter dem Mikroskop bei 4facher Vergrößerung wurde die Einschnittstelle der A. carotis communis mit mikrochirurgischem Nahtmaterial in Einzelknopfnahttechnik verschlossen (Abbildung 1C). Danach wurden die Mikroklemmen von der A. carotis communis entfernt, wodurch die anatomische Struktur und der Blutfluss wiederhergestellt wurden (Abbildung 1D).
TTC-Färbung und Sterblichkeitsrate 
Insgesamt 12 männliche erwachsene Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: Sham- und Modellgruppe (jeweils n = 6). Leider verstarb ein Tier in der Sham-Gruppe aufgrund einer Überdosis Anästhetikum, und ein Tier in der Modellgruppe verstarb innerhalb von 24 Stunden. Die Infarkte, die durch die zerebrale Ischämie verursacht wurden, waren sowohl im Striatum als auch im Kortex sichtbar (Abbildung 2A). Drei Tage nach dem ischämischen Schlaganfall betrug der Gesamtinfarktanteil 29,3 % ± 1,6 % der Hemisphäre (Abbildung 2B), wobei die Sterblichkeitsrate nach der Operation 16,7 % betrug.
Beurteilung der neurologischen Funktion 
Am 1. und 3. Tag nach ischämischem Schlaganfall waren die Werte der Modellgruppen im Vergleich zu den Scheinoperationgruppen signifikant verringert (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Abbildung 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Abbildung 3B).
<img alt="Schema der chirurgischen Nahttechnik; Pinzette hält das Gewebe; Schritte: Nadeleinführung, Knotenbindung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Der Mikronahtvorgang. (A) Der Faden wird aus der A. carotis communis (CCA) zurückgezogen. Blaue Pfeile zeigen die mikrovaskulären Klammern an. (B) Der schwarze Pfeil zeigt den Einschnitt nach vollständiger Entfernung des Fadens an. Blaue Pfeile zeigen die mikrovaskulären Klammern an. (C) Unter dem Mikroskop (4fach vergrößert) wurde der CCA-Einschnitt mit 11-0 mikrochirurgischen Fäden in einer Einzelknopfnahttechnik vernäht. Blaue Pfeile zeigen die mikrovaskulären Klammern an. Der schwarze Pfeil zeigt den genähten Einschnitt an. (D) Die Mikroklemmen werden entfernt, und die Durchblutung der CCA wird wiederhergestellt. Der schwarze Pfeil zeigt die genähte Stelle der CCA an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Schnitte von ischämischem Hirngewebe, Balkendiagramm, Vergleich des prozentualen ischämischen Bereichs, Experimentellergebnisse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: TTC-Färbungsergebnisse des Ischämie-Modells. (A) Repräsentative Bilder von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-gefärbten Hirnschnitten nach zerebraler Ischämie. In lebendem Gewebe wird TTC enzymatisch durch Dehydrogenasen zu 1,3,5-Triphenylformazan reduziert, das eine rote Farbe aufweist. Die Gewebe in nekrotischen Bereichen bleiben aufgrund des Fehlens einer solchen enzymatischen Aktivität weiß. (B) Prozentsatz des ischämischen Bereichs bei Ratten drei Tage nach zerebraler Ischämie. Im Vergleich zur Sham-Gruppe **P &lt; 0,01. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Jede Gruppe umfasste fünf Ratten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Balkendiagramm zum Vergleich der Garcia-Scores in der Schein- vs. Modellgruppe, mit signifikantem Unterschied (**)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Bewertung der neurologischen Funktion. (A) Garcia-Scores einen Tag nach zerebraler Ischämie. (B) Garcia-Scores drei Tage nach zerebraler Ischämie. Im Vergleich zur Schein-Gruppe, **P &lt; 0,01. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Es wurden jeweils fünf Ratten pro Gruppe verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein Rattenmodell des Verschlusses/der Reperfusion der mittleren Hirnarterien, das die anatomische Struktur der Hirngefäße bewahrt, ohne Schäden zu verursachen.

Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße

Ischemic stroke stands as the primary cause of long-term disability and mortality among adults worldwide. Animal models of ischemic stroke have ...

In dieser Studie wird ein Rattenmodell für den Verschluss oder die Reperfusion der mittleren Hirnarterie entwickelt, das die Integration der zerebralen Gefäße aufrechterhält. Es konzentriert sich auf die Einführung einer neuen Methode zur Induktion eines ischämischen Schlaganfallmodells bei Ratten, ohne die zerebrale Gefäßanatomie zu beeinträchtigen. Das Projekt nutzt mikrochirurgische Techniken und die filamentinduzierte Ischämie.Es wird eine Methode eingeführt, um eine Ischämie zu induzieren, ohne die Arteria carotis communis oder das externe Karotissystem zu schädigen. Im Gegensatz zu Techniken, die den Blutfluss dauerhaft beeinträchtigen oder die zerebrale Gefäßanatomie schädigen können, behält dieses Protokoll die anatomische Integrität mehrerer Gefäße bei. Es bietet einen genaueren, weniger schädlichen Ansatz zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls.Zu Beginn setzen Sie die betäubte Ratte auf eine Operationsplattform. Nach der Rasur des Fells um den Hals und den linken Halsbereich desinfizieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadin und 70% Ethanol. Machen Sie einen 1,5 Zentimeter langen Mittellinienschnitt an der Bauchseite des Halses und öffnen Sie die oberflächliche Faszie.Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um die Arteria carotis externa, die Arteria carotis interna und die Arteria carotis communis freizulegen. Platzieren Sie drei 4-0-Seidennähte um die Arteria carotis communis und eine weitere Seidennaht durch die Arteria carotis externa in der Nähe der Bifurkation der Arteria carotis interna. Binden Sie einen lösbaren Schlupfknoten an der proximalen Arteria carotis.Ziehen Sie die Naht an der distalen Arteria carotis communis mit einem Blutstiller fest, um den Blutfluss zu blockieren. Binden Sie während des Nähens einen weiteren Schlupfknoten locker um die Arteria carotis communis, um sicherzustellen, dass das Gefäß nicht verschlossen wird. Machen Sie nun mit einer Schere einen 0,5 Millimeter großen Schnitt zwischen der proximalen Seidennaht und der mittleren Naht an der Arteria carotis communis.Führen Sie ein drei Zentimeter langes 4-0-Filament in die Halsschlagader ein. Ziehen Sie die Seidennähte um die Halsschlagader fest, um das intraluminale Filament zu sichern und Blutungen zu vermeiden. Entfernen Sie dann die Naht von der distalen Arteria carotis communis.Führen Sie das Filament weiterhin in das Lumen der mittleren Hirnarterie ein und steuern Sie die Nähte um die Arteria carotis externa. Starten Sie einen Timer und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Okklusion beginnt. Vernähen Sie den Halsschnitt mit 3-0 Seidennähten.Setzen Sie das Tier vorsichtig in einen Auffangkäfig. Nach der ischämischen Modellierung wird der Halsschnitt der anästhesierten Ratte wieder geöffnet. Ziehen Sie unter einem Präpariermikroskop das okkludierende Filament vorsichtig zurück, während Sie die Mikroklemme horizontal in der Nähe des intraluminalen Nahtknotens platzieren.Ziehen Sie sich weiter zurück, bis die weiße Spitze in der Nähe des Schnitts der Arteria carotis communis deutlich sichtbar ist. Entfernen Sie dann das Filament vollständig und lösen Sie den gesicherten intraluminalen Nahtknoten. Platzieren Sie eine weitere Mikroklemme in der Nähe der Herzseite des proximalen Knotens der Arteria carotis.Entfernen Sie anschließend den Nahtknoten um die proximale Arteria carotis. Spülen Sie die Inzisionsstelle mit Kochsalzlösung ab. Trocknen Sie den Bereich mit einem sterilen Wattebausch, um das Blut zu entfernen und ein klares Operationsfeld zu erhalten.Bei 4-facher Vergrößerung vernähen Sie nun den Schnitt an der Halsschlagader mit 11-0 mikrochirurgischen Nähten in einem unterbrochenen Muster. Entfernen Sie nach dem Nähen die Mikroklemmen an beiden Enden der Arteria carotis, um den Blutfluss wiederherzustellen. Üben Sie mit einem sterilen Wattebausch 30 Sekunden lang Druck auf die Nahtstelle der Arteria carotis communis aus.Beobachten Sie die Halsschlagader zwei Minuten lang, um sicherzustellen, dass keine Blutungen auftreten. Nähen Sie den Halsschnitt und legen Sie die Ratte zur Wiederherstellung der Anästhesie in eine 35 Grad Celsius heiße Pflegebox. Drei Tage nach der Ischämie-Reperfusion ist das Gehirn der euthanasierten Ratte zu entfernen.Frieren Sie das Gehirn bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten ein. Schneiden Sie nach dem Einfrieren das Gehirn mit einem Skalpell in zwei Millimeter dicke Kronenschnitte. Inkubieren Sie die Gehirnabschnitte mit 2%TTC für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation werden die Gehirnabschnitte in eine kleine Petrischale überführt und 2 % TTC verworfen. Fixieren Sie dann die Gehirnabschnitte mit 10% Formalin für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Formalin und spülen Sie die Gehirnabschnitte mit PBS aus.Nehmen Sie digitale Fotos von aufeinanderfolgenden Schichten auf. Messen Sie mit der ImageJ-Software quantitativ die Infarktbereiche. Nach der TTC-Färbung wurden die Infarkte infolge einer zerebralen Ischämie sowohl im Striatum als auch im Kortex beobachtet.Drei Tage nach dem ischämischen Schlaganfall wurde der Gesamtinfarktanteil bei etwa 30 % der Hemisphäre gemessen, mit einer Mortalitätsrate von 16,7 % nach der Operation.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Chirurgische Induktion der ischämischen Hirnschädigung in der Ratte ist ein weit verbreitetes Modell für Schlaganfall-Forschung. Hier zeigen wir die Induktion fokaler zerebraler Ischämie durch Verschluss der mittleren Hirnarterie. Visualisierung der resultierenden Infarkt durch histologischer Färbung und Magnetresonanz-Tomographie wird ebenfalls angezeigt.

Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

Wir zeigen in dem Video ein Verfahren zur Herstellung einer mittleren Zerebralarterie in erwachsenen Mäusen mit einem intraluminalen Monofilament. Wir zeigen auch, wie man das Ausmaß der Hirninfarkt von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung zu bewerten.

Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Dieses Video zeigt das Verfahren der Durchführung eines permanenten distalen Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) mit der Arteria carotis communis (CCA) bei gealterten Ratten, um einen ischämischen Schlaganfall zu modellieren. Dies blockiert den Blutfluss zum Gehirn, was zum neuronalen Tod führt und ein Modell zur Untersuchung von Schlaganfallmechanismen und möglichen Behandlungen erstellt.

Induktion von Ischämie über einen Verschluss der mittleren Hirn- und Halsschlagader in einem Rattenmodell

Quelle: Larpthaveesarp, A., et. al. Transientes Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie des neonatalen Schlaganfalls bei P10-Ratten. J. Vis. exp. (2017)Dieses Video zeigt die Etablierung des Modells des Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen. Die Arteria carotis interna (ICA) wird freigelegt und eine Ligatur wird gesichert, um den Blutfluss zu begrenzen. Durch die ICA wird ein Verschluss eingeführt, um die Arteria cebraralis media zu erreichen. Der Welpe darf...

Erzeugung eines Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen zur Induktion einer lokalen Hirnischämie

Wir beschreiben eine sehr reproduzierbare Methode zur dauerhaften Verschluss von einem Nagetier großen zerebralen Blutgefäßen. Diese Technik kann mit sehr wenig peripheren Schäden, minimale Blutverlust, eine hohe Rate der langfristigen Überleben und konsistente Infarktvolumen Einklang mit der menschlichen klinischen Bevölkerung erreicht werden.

Permanent Cerebral Gefäßverschluss<em&gt; Über</em&gt; Double Blattschraube und Durchtrennung

Neonataler Schlaganfall ist eine signifikante Ursache für frühe Hirnverletzungen, die ein translationales Modell mit konsistenten fokalen Verletzungsmustern und hoher Reproduzierbarkeit erfordern, um eine Studie zu ermöglichen. Diese Studie beschreibt das detaillierte chirurgische Verfahren zur Schaffung einer nicht-hämorrhagischen, einseitigen fokalen Ischämie-Reperfusionsverletzung bei langzeitäquivalenten Nagetieren.

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Modell von Neugeborenen Stroke in P10 Ratten

Intraluminal Filament Okklusion der mittleren zerebralen Arterie ist das am häufigsten verwendete in Vivo Modell der experimentellen Schlaganfall bei Nagetieren. Ein alternativer chirurgischer Ansatz ermöglichen gemeinsame Halsschlagader Reparatur erfolgt hier, wodurch der Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader und eine vollständige Reperfusion auf das mittlere zerebrale Arterie-Gebiet.

Mittlere zerebrale Arterie Okklusion so dass Reperfusion über gemeinsame Halsschlagader Reparatur bei Mäusen

Ein Maus-Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion wird gegründet, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu untersuchen. Wir nach distal verbinden rechts mittlere zerebrale Arterie und rechts gemeinsame Halsschlagader und Blutfluss nach 10 oder 40 min der Ischämie wiederherstellen.

Zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-reperfusion

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Vorbereitung auf die Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie über die Arteria carotis communis.

Eine modifizierte Modellpräparation für die Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie

Ziel dieser Studie war es, eine reproduzierbare Methode zur Durchführung einer Kraniektomie zu etablieren, gefolgt von permanenter, selektiver Okklusion der mittleren Hirnarterie bei Ratten zur Anwendung in experimentellen Studien zu motorischen und räumlichen Gedächtnisdefiziten.

Selektive und permanente Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Ratten: Ein experimenteller Ansatz zur Untersuchung motorischer und räumlicher Gedächtnisdefizite

Lernen Sie ein verbessertes Rattenmodell für die Okklusion der mittleren Hirnarterie mit erhaltener Gefäßanatomie. Diese mikrochirurgische Methode ermöglicht präzise Schlaganfallforschung mit minimaler Mortalität.

Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße (Video) | JoVE Journal

Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße

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