Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum
May 31st, 2024
Bakterien besiedeln Wirtsgewebe, die in der Bioverfügbarkeit von Sauerstoff und Eisen variieren, doch die meisten Ansätze zur Untersuchung von Bakterien verwenden belüftete, reichhaltige Medien. Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung des humanpathogenen Erregers Yersinia pseudotuberculosis unter unterschiedlichen Eisenkonzentrationen und Sauerstoffspannungen und die Quantifizierung der Aktivität des Yersinia Typ III Sekretionssystems, das ein wichtiger Virulenzfaktor ist.
Bakterielle Krankheitserreger nutzen Virulenzfaktoren, um verschiedene Nischen innerhalb des Wirtsorganismus zu besiedeln. Wir arbeiten daran, zu verstehen, wie bakterielle Krankheitserreger spezifische Umweltreize im Wirtsgewebe wahrnehmen, um die Expression von Virulenzfaktoren zu regulieren. Der humanpathogene Erreger Yersinia pseudotuberculosis nutzt den Virulenzfaktor des Sekretionssystems Typ 3, um Effektorproteine in Wirtszellen zu injizieren.
Das Sekretionssystem vom Typ drei ermöglicht es den Bakterien, die Abwehrmechanismen des Wirts zu untergraben und das Wirtsgewebe zu besiedeln. Die Expression des Yersinia Typ III Sekretionssystems ist jedoch metabolisch belastend, so dass die Expression von Genen des Typ 3 Sekretionssystems als Reaktion auf Umwelteinflüsse wie die Temperatur streng reguliert wird. Unsere früheren Veröffentlichungen zeigten, dass die Expression des Yersinien-Typ-III-Sekretionssystems durch die Eisenverfügbarkeit und die Sauerstoffspannung durch einen Transkriptionsfaktor namens ISCR gesteuert wird.
Diese Ergebnisse sind von Bedeutung, da Yersinien Wirtsgewebe besiedeln, die sich in ihrem Eisengehalt und ihrer Sauerstoffspannung unterscheiden. Zum Beispiel enthält das Darmlumen ausreichend Eisen für das Yersinienwachstum, hat aber eine niedrige Sauerstoffspannung. Im Gegensatz dazu haben Gewebe wie das Blut eine sehr geringe Eisenverfügbarkeit, aber eine höhere Sauerstoffspannung.
Unsere Methode ermöglicht es uns, Yersinien unter Kulturbedingungen zu züchten, die in der Menge an verfügbarem Eisen und Sauerstoff variieren, um zu untersuchen, wie sich diese Umwelteinflüsse auf die Expression des Typ-3-Sekretionssystems auswirken. Diese Methode wird uns helfen, den molekularen Mechanismus zu bestimmen, durch den die Verfügbarkeit von Eisen und Sauerstoff die Expression des Typ-3-Sekretionssystems steuert, und uns helfen zu verstehen, wie dies den Ausgang einer Yersinien-Infektion steuert. Zu Beginn Streifen Sie Yersinia Pseudo tuberculosis auf Lysogeny-Bouillon-Agarplatten.
Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei Raumtemperatur. Sobald sich sichtbare Kolonien gebildet haben, inokulieren Sie eine einzelne isolierte Kolonie in vier Milliliter M9-Medium. Kultivieren Sie es über Nacht bei 26 Grad Celsius mit Belüftung bei 250 U/min.
Legen Sie eine Küvette mit der Kultur in ein Spektrometer und verdünnen Sie die Kultur dann in 14 Millilitern sterilem chelatisiertem M9-Medium ohne Eisenzusatz, um einen OD600-Wert von 0,1 zu erreichen. Legen Sie die Kolben in einen 26 Grad Celsius heißen Shaker und inkubieren Sie sie acht Stunden lang. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie die Kultur, um drei frische Kulturen zu starten. zwei für anaerobes Wachstum und eine für aerobes Wachstum.
Für die aerobe Kultivierung verdünnen Sie die Kultur auf einen OD600-Wert von 0,1 in 14 Millilitern sterilen chelatisierten M9-Medien ohne Eisenzusatz. Anschließend 12 Stunden lang mit Belüftung bei 26 Grad Celsius kultivieren. Für die anaerobe Kultivierung verdünnen Sie die Kultur in 14 Millilitern sterilem chelatisiertem M9-Medium in zwei säuregewaschene Glasröhrchen.
Geben Sie im ersten Röhrchen filtersterilisiertes Eisensulfat bis zu einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Liter. Geben Sie in das zweite Röhrchen Eisensulfat für eine Endkonzentration von 0,01 Milligramm pro Liter. Inkubieren Sie beide Röhrchen in einer anaeroben Kammer bei Raumtemperatur für 12 Stunden.
Induzieren Sie dann die Aktivität des Sekretionssystems vom Typ 3, indem Sie die anaeroben Kulturen auf 37 Grad Celsius umstellen und die Inkubation vier Stunden lang fortsetzen. Als nächstes verdünnen Sie die aerob wachsenden Kulturen auf einen OD600-Wert von 0,2, indem Sie 14 Milliliter chelatisiertes M9-Medium in zwei säuregewaschene Kolben geben. Eisensulfat in den erforderlichen Endkonzentrationen wird in die Kolben gegeben.
Beide Kolben werden zwei Stunden lang bei 26 Grad Celsius und 250 U/min belüftet. Nach zwei Stunden werden die Kulturen auf 37 Grad Celsius mit einer Belüftung bei 250 U/min für vier Stunden umgestellt, um die Aktivität des Typ-3-Sekretionssystems zu induzieren. Nach Induktion des Typ-3-Sekretionssystems in Yersinia pseudotuberculosis werden normalisierte Volumina dieser Kultur, die in 15-Milliliter-Röhrchen inkubiert wurden, übertragen.
Geben Sie vier Mikroliter Rinderserumalbumin in jedes Röhrchen als Kontrolle der Proteinfällung. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.200 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,22-Mikron-PVDF-Filter, der an einer Spritze befestigt ist, in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Dann wird Trichloressigsäure zugegeben, die 10 % des Überstandsvolumens entspricht. Wirbeln Sie die Röhren eine Minute lang kräftig ein. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius auf Eis.
Geben Sie anschließend zwei Milliliter jeder Probe in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 21.000 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumaufsatz abgesaugt. Wiederholen Sie das Pipettieren von zwei Millilitern der Probe in dasselbe Röhrchen, zentrifugieren Sie und aspirieren Sie den Überstand.
Konsolidieren Sie die Fällungsreaktionen in einem einzigen Zwei-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Pellets mit einem Milliliter eiskaltem 100%igem Aceton, zentrifugieren Sie sie und ziehen Sie den Überstand an. Nachdem Sie den Überstand ein letztes Mal entfernt haben, trocknen Sie das Pellet eine Stunde lang auf der Bank.
Das gefällte Protein sollte wie ein Schleier an der Seite des Röhrchens aussehen. Dann resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 Mikrolitern F-S-B-DFT-Lösung. Eine Minute lang gründlich vortexen.
Anschließend kochen Sie die Proben auf einem Heizblock bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend kurz bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur zentrifugieren. Laden Sie 15 Mikroliter jeder anaeroben Probe und 10 Mikroliter jeder aeroben Probe zur Analyse in ein 12,5 %-SDS-PAGE-Gel.
Nachdem der Gellauf abgeschlossen ist, verwenden Sie Silberfärbung, um Proteine auf dem Gel sichtbar zu machen. Zu Beginn geben Sie ein SDS-PAGE-Gel mit getrennten aeroben Proben von Yersinia pseudotuberculosis in ein Bildgebungssystem. Wählen Sie in der Software die Banden aus, die das Effektorprotein des Sekretionssystems vom Typ drei, YopE, in allen Vertiefungen darstellen.
Stellen Sie das Referenz-YopE-Band auf das entsprechende Sample ein. Exportieren Sie die von der Software berechneten relativen Quantifizierungswerte für alle YopE-Bänder. Wählen Sie dann alle BSA-Bänder in allen Vertiefungen aus.
Stellen Sie sicher, dass die BSA-Referenzbande mit der Probe der YopE-Referenzbande übereinstimmt. Exportieren Sie die relativen Quantifizierungswerte für alle BSA-Banden. Dividieren Sie den YopE-Wert durch den BSA-Wert für jede Bedingung, um normalisierte Ergebnisse zu erhalten.
Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel zeigte, dass in den anaeroben Proben 38-mal mehr YopE in den eisenarmen Proben im Vergleich zu den eisenreichen Proben vorhanden war. In den aeroben Proben wurden diese Proteine in nahezu gleichen Mengen sezerniert.
Übersicht
Diese Studie untersucht, wie der menschliche Erreger Yersinia pseudotuberculosis seinen Virulenzfaktor, das Typ-III-Sekretionssystem, als Reaktion auf Umweltreize wie Eisenverfügbarkeit und Sauerstoffspannung reguliert. Die Forschung hebt die metabolische Belastung der Expression dieses Virulenzfaktors und die Mechanismen seiner Regulation hervor.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Pathogenese
- Wirt-Erreger-Interaktionen
Hintergrund
- Bakterielle Erreger nutzen Virulenzfaktoren zur Kolonisierung von Wirtsgeweben.
- Das Typ-III-Sekretionssystem ist entscheidend für das Injizieren von Effektorproteinen in Wirtszellen.
- Die Expression von Virulenzfaktoren wird durch Umweltbedingungen reguliert.
- Eisenverfügbarkeit und Sauerstoffspannung beeinflussen die Expression des Typ-III-Sekretionssystems in Yersinia pseudotuberculosis erheblich.
Zweck der Studie
- Um zu verstehen, wie Yersinia pseudotuberculosis Umweltreize erkennt.
- Um die Regulation des Typ-III-Sekretionssystems unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen.
- Um die metabolischen Auswirkungen der Expression von Virulenzfaktoren zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von Yersinia pseudotuberculosis unter verschiedenen Eisenkonzentrationen.
- Anpassung der Sauerstoffspannung während des bakteriellen Wachstums.
- Quantifizierung der Aktivität des Typ-III-Sekretionssystems.
- Analyse der regulatorischen Mechanismen, die an der Expression von Virulenzfaktoren beteiligt sind.
Hauptergebnisse
- Yersinia pseudotuberculosis reguliert sein Typ-III-Sekretionssystem basierend auf Eisen- und Sauerstoffniveaus.
- Die Expression des Typ-III-Sekretionssystems ist metabolisch kostspielig und streng kontrolliert.
- Umweltreize haben einen erheblichen Einfluss auf die Virulenz des Erregers.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der bakteriellen Anpassung in Wirtsumgebungen bei.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert Einblicke in die regulatorischen Mechanismen bakterieller Virulenzfaktoren.
- Das Verständnis dieser Mechanismen kann Strategien zur Bekämpfung bakterieller Infektionen beeinflussen.
- Zukünftige Forschung könnte zusätzliche Umweltfaktoren untersuchen, die die Virulenz beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Yersinia pseudotuberculosis T3SS activity under iron starvation and anaerobic growth provides a robust framework for interrogating pathogen virulence regulation in host-relevant conditions. This approach enables mechanistic de-risking of antimicrobial targets by linking environmental cues to effector protein secretion, directly informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for antimicrobial discovery campaigns focused on T3SS inhibition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of T3SS regulatory mechanisms in response to iron and oxygen, clarifying virulence pathway control.
- Supports functional target validation by quantifying effector secretion under defined environmental conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking for T3SS as an antimicrobial target.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of virulence factor modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for inducing and quantifying T3SS activity in vitro.
- Enables reproducible measurement of secreted effector proteins using SDS-PAGE and silver staining.
- Supports assay readiness for compound screening targeting T3SS function.
- Allows normalization and quantitative comparison across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with host-relevant iron and oxygen environments encountered during infection.
- Facilitates translational continuity by modeling pathogen adaptation to mammalian tissue niches.
- Enables risk-adjusted advancement of T3SS-targeted candidates based on functional readouts.
- Provides a framework adaptable to other pathogens with robust iron uptake systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on environmental regulation of T3SS and virulence factor expression.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for effector secretion under defined conditions.
- Analytics: Enables normalization and statistical comparison of protein secretion across iron and oxygen gradients.
- Translational Research: Models pathogen behavior in host-like environments, informing preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for evaluating T3SS activity in diverse Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T3SS as a drug target by linking environmental cues to functional output.
- Operational Value: Standardizes effector quantification and assay conditions for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for T3SS-targeted programs by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culturing under controlled iron and oxygen conditions.
- Needs access to acid-washed glassware, chelated media, and protein quantification infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and quantification protocols.
- Adaptable to other pathogens with similar iron uptake systems, pending optimization.
- Dependent on accurate normalization and statistical analysis of effector protein outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
