Name: Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Yersinia pseudotuberculosis das Typ-III-Sekretionssystem bei Eisenmangel und anaerobem Wachstum reguliert. Diese Methode zeigt die metabolische Kontrolle bakterieller Virulenzfaktoren.

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<meta charset="utf8"></head><body>T3SS-Aktivität bei Yersinia pseudotuberculosis unter Eisenmangel und anaerobem Stress

<ol><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+structure%2C+function+regulation+of+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).</li>
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<li>Bearden, S. W., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yfe+system+of+Yersinia+pestis+transports+iron+and+manganese+and+is+required+for+full+virulence+of+plague%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague.</a> Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%3A+Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis.</a> FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).</li>
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<li>Miller, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IscR+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+type+III+secretion+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence.</a> PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 mL Luer-Lok Tip Spritze</td><td>BD</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS Laufpuffer&nbsp;</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>0,25 M Tris Base, 1,92 M Glycin, 1% SDS in 1 L Volumen</td></tr><tr><td>12,5% SDS-Page Gel</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kulturröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>Für die Erstübernacht&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Falcom</td><td>352196</td><td>Für die Sammlung von Überständen</td></tr><tr><td>250 mL Kulturkolben</td><td>Belco</td><td>251000250</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Filtersystem</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>6 N Salzsäurelösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732185</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>A949-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Bio Rad ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio Rad</td><td>Modellnummer: Universalhaube III</td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen aus Borosilikatglas</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-34</td><td>Für die anaerobe Kultivierung</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Chelex M9 +0,9% Glukosemedien</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1% Casaminosäuren, <stark>0,9 % Dextrose</stark>, 0,0005 % Thiamin, 5 g/l Chelex 100 Harz. Rühren Sie das Medium 18 h lang bei Raumtemperatur um, filtrieren Sie es mit einer 500 mL Corning Filtrationseinheit, fügen Sie dann MgSO4 für 1 mM MgSO4 final Lösung</td></tr> hinzu <tr><td>Final Sample Buffer (FSB)</td><td>Hausgemachtes</td><td></td><td>0,1 M Tris-HCl, 4 % SDS, 20 % Glycerin, 0,2 % Bromophenol Blue</td></tr><tr><td>FSB: DVB-T-Lösung</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>FSB+0,2M DTT</td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio Rad</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z</td><td>Software</td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860021</td><td></td></tr><tr><td>LB Agarplatten</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 15 g Agar in 1 L Gesamtvolumen. Autoklavierte</td></tr><tr><td>M9+0,2% Glukosemedien</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td>6 g/l Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% Casaminosäuren, <stark>0,2% Dextrose</stark>, 0,0005% Thiamin&nbsp;</td></tr><tr><td>Millex-GP PES 0,22 μm Filteraufsatz für Spritze</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>Für die FeSO47H2O-Filtration</td></tr><tr><td>Millex-GV PVDF 0,22 μm Filteraufsatz für Spritze</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RS</td><td>Für die Überstandsfiltration</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Ungefärbt Standard</td><td>Bio Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gelapparat</td><td>Bio Rad</td><td>Modellnummer: Mini PROTEAN Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>SilverXpress Silber-Färbe-Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr><tr><td>The BellyDancer Shaker</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRAA1155</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäurelösung 6.1N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl Anaerobe Kammer</td><td>Coy Lab Products</td><td></td><td>https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details</td></tr><tr><td>qPCR Primer-Sequenzen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA vorwärts - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA rückwärts - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd vorwärts - ccagcatcagccccatacag</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd rückwärts - tggcttgtcggatgcacttc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE vorwärts - CCATAAACCGGTGGTGGAC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE Rückwärts - CTTGGCATTGAGTGATACTG</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der aktivität des yersinia pseudotuberculosis typ iii sekretionssystems nach eisenmangel und anaerobem wachstum

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

Diese Methode ermöglicht den relativen Vergleich von sezernierten Yops unter verschiedenen Bedingungen relativ zu einer Referenzbedingung von Interesse. Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt eine Darstellung der Art und Weise, wie die Normalisierung von Zellkulturen typischerweise unter jeder Kulturbedingung ablaufen würde, und das Volumen an TCA, das jedem Überstand zugesetzt würde. Hier werden repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von Wildtyp (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 sowie zwei kongenen Mutanten, ΔyscNU und ΔyopE, gezeigt. Die ΔyopE-Mutante wird als Kontrolle ohne YopE verwendet, während die ΔyscNU-Mutante als vollständige T3SS-Negativkontrolle verwendet wird, da sie nicht in der Lage ist, ein funktionsfähiges T3SS13,14 zusammenzusetzen. In Abbildung 2 ist ein repräsentatives Bild eines silbergefärbten 12,5%igen SDS-PAGE-Gels dargestellt, das die sezernierten Proteine enthält. Wie oben beschrieben, enthielt jede Probe spike-in-BSA als Kontrolle für die Proteinfällungseffizienz. Bei der Analyse der Daten sollten anaerobe und aerobe Datensätze als unabhängige Datensätze behandelt werden, da sie jeweils separat normiert wurden. In den anaeroben Proben war ~38-mal mehr YopE in den Proben mit niedrigem Eisengehalt im Vergleich zu den Proben mit hohem Eisengehalt vorhanden, was mit früheren Ergebnissenübereinstimmt 15,16. In den aeroben Proben wurde eine ähnliche Menge an sezerniertem YopE in Proben mit niedrigem und hohem Eisengehalt beobachtet, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt16. Im Allgemeinen werden mindestens drei biologische Replikate jeder Bedingung verwendet, um die statistische Signifikanz zu ermitteln.
Um zu bestätigen, dass dieses Protokoll zu einem adäquaten Eisenmangel führt, wurde eine qPCR-Analyse an den eisenresponsiven Genen yfeA und bfd im Wildtyp-Stamm unter allen Bedingungen durchgeführt. YfeA ist das periplasmatische Bindungsprotein eines ABC-Transportsystems, das für den Eisentransport verantwortlich ist, während Bfd ein Bakterioferritin-assoziiertes Ferredoxin ist, das an der Mobilisierung der Eisenspeicher beteiligt ist 17,18,19,20. RNA wurde wie zuvor beschrieben isoliert21, und wie erwartet waren yfeA und bfd unter eisenarmen Bedingungen im Vergleich zu eisenreichen Bedingungen sowohl aerob als auch anaerob signifikant hochreguliert, wie in Abbildung 3 gezeigt. Zusätzlich quantifizierten wir die yopE-mRNA-Steady-State-Spiegel mittels qPCR, um zu bestätigen, dass die beobachteten Ergebnisse für relatives YopE auf Proteinebene mit den yopE-Transkriptspiegeln übereinstimmten (siehe Abbildung 3). 
Da Bakterien unter stressigen Kultivierungsbedingungen zur Lyse neigen, war es wichtig zu zeigen, dass die Schritte in diesem Protokoll nicht zu einer bakteriellen Lyse führen, die möglicherweise die Ergebnisse verfälschen könnte. Um dies zu bestätigen, wurden TCA-präzipitierte Überstandsproben einem Western Blot unterzogen und auf YopE und RpoA, eine Untereinheit der RNA-Polymerase und ein zytoplasmatisches Protein, untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, folgte das YopE-Expressionsmuster zwar dem in Abbildung 3 gezeigten, es gab jedoch keine Hinweise auf RpoA in den Probenüberständen, was darauf hindeutet, dass es keine beobachtbare Lyse gab, die zytoplasmatisches RpoA in den Überstand freisetzen würde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf für die Züchtung von Yersinia pseudotuberculosis unter variierender Eisen- und Sauerstoffverfügbarkeit. Grafische Darstellung der Kultivierungsschritte. Beachten Sie, dass säuregewaschene Gläser ab Tag 4 verwendet werden müssen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Ergebnisse von silbergefärbtem 12,5%igem SDS-PAGE-Gel von TCA-präzipitiertem Protein aus Kulturüberständen. Ausgefällte Kulturüberstände wurden auf ein 12,5%iges SDS-PAGE-Gel geladen und mit Silber gefärbt. (A) Sekretionsprofil von anaerob gezüchteten WT-, ΔyscNU- und Δ yopE-Stämmen. Repräsentative relative Werte von YopE, normiert auf die anaerobe WT-Eisen-Probe. (B) Sekretionsprofil von aerob gezüchteten WT-, ΔyscNU- und Δ yopE-Stämmen. Repräsentative relative Werte von YopE, normiert auf die aerobe WT-Eisen-Probe. Weiße Pfeile zeigen YopE (~23 kDa) an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Relative mRNA-Spiegel von eisenresponsiven Genen zeigen Eisenmangel. Die RNA wurde aus WT Y. pseudotuberculosis isoliert, die unter den in Abbildung 1 beschriebenen Bedingungen kultiviert wurde. qPCR wurde verwendet, um die relative Expression von yfeA-, bfd- und yopE-Spiegeln zu messen, die unter anaeroben (A-C) und aeroben (D-F) Bedingungen auf 16S rRNA normalisiert waren. ****p &lt; 0,0001, bestimmt durch einen ungepaarten t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Das Fehlen von zytoplasmatischem RpoA in überstehenden Proben zeigt das Fehlen einer Zelllyse unter Kulturbedingungen. 5 μl gefällte Überstände von (A) anaeroben und (B) aeroben Proben aus Abbildung 3 wurden auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel zusammen mit einer Pelletkontrolle durchgeführt. Die Proteine wurden für das Western Blotting auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde geschnitten, und die obere Hälfte wurde mit einem Anti-RpoA-Antikörper auf RpoA untersucht, und die untere Hälfte wurde mit einem Anti-YopE-Antikörper auf YopE untersucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">(ein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ANAEROB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zustand</td>
			<td>OD</td>
			<td>Zu sammelndes Volumen (ml)</td>
			<td>Volumen von 6,1 N TCA zu Sup (mL) hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Eisenarm</td>
			<td>0.5</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Hoher Eisengehalt</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">(B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AEROB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zustand</td>
			<td>OD</td>
			<td>Zu sammelndes Volumen (ml)</td>
			<td>Volumen von 6,1 N TCA zu Sup (mL) hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Eisenarm</td>
			<td>0.9</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Hoher Eisengehalt</td>
			<td>1.4</td>
			<td>3.857</td>
			<td>0.386</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Repräsentativer Arbeitsablauf für die Probenentnahme. An Tag 5 (A) wurden nach Abschluss der 4-stündigen Inkubation bei 37 °C für die anaeroben Proben 6 ml der Probe mit dem niedrigsten OD600-Wert entnommen und der Rest des Probenvolumens entsprechend normiert. Nach der Filterung des Überstands wurden 6,1 N TCA zugegeben. (B) Nach Abschluss der aeroben Inkubationen (2 Stunden bei 26 °C und 4 Stunden bei 37 °C) wurden 6 ml der Probe mit dem niedrigsten OD600-Wert entnommen und der Rest des Probenvolumens entsprechend normalisiert. Nach der Filterung des Überstands wurden 6,1 N TCA zugegeben.

Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

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Research

Forschung

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Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Wir beschreiben hier eine Methode für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae in metallbeschränkten flüssigen Medien, um die Expression von Genen für die Metallaufnahme zu erleichtern. Wir skizzieren auch nachgelagerte Experimente, um den Phänotyp von Gonokokken zu charakterisieren, die unter diesen Bedingungen angebaut werden. Diese Methoden können angepasst werden, um für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen in anderen Bakterien geeignet zu sein.

Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallakquise von Host Ligands

Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.

Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Erfahren Sie, wie Yersinia pseudotuberculosis das Typ-III-Sekretionssystem bei Eisenmangel und anaerobem Wachstum reguliert. Diese Methode zeigt die metabolische Kontrolle bakterieller Virulenzfaktoren.

Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum

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