Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum

Bakterielle Krankheitserreger nutzen Virulenzfaktoren, um verschiedene Nischen innerhalb des Wirtsorganismus zu besiedeln. Wir arbeiten daran, zu verstehen, wie bakterielle Krankheitserreger spezifische Umweltreize im Wirtsgewebe wahrnehmen, um die Expression von Virulenzfaktoren zu regulieren. Der humanpathogene Erreger Yersinia pseudotuberculosis nutzt den Virulenzfaktor des Sekretionssystems Typ 3, um Effektorproteine in Wirtszellen zu injizieren.

Das Sekretionssystem vom Typ drei ermöglicht es den Bakterien, die Abwehrmechanismen des Wirts zu untergraben und das Wirtsgewebe zu besiedeln. Die Expression des Yersinia Typ III Sekretionssystems ist jedoch metabolisch belastend, so dass die Expression von Genen des Typ 3 Sekretionssystems als Reaktion auf Umwelteinflüsse wie die Temperatur streng reguliert wird. Unsere früheren Veröffentlichungen zeigten, dass die Expression des Yersinien-Typ-III-Sekretionssystems durch die Eisenverfügbarkeit und die Sauerstoffspannung durch einen Transkriptionsfaktor namens ISCR gesteuert wird.

Diese Ergebnisse sind von Bedeutung, da Yersinien Wirtsgewebe besiedeln, die sich in ihrem Eisengehalt und ihrer Sauerstoffspannung unterscheiden. Zum Beispiel enthält das Darmlumen ausreichend Eisen für das Yersinienwachstum, hat aber eine niedrige Sauerstoffspannung. Im Gegensatz dazu haben Gewebe wie das Blut eine sehr geringe Eisenverfügbarkeit, aber eine höhere Sauerstoffspannung.

Unsere Methode ermöglicht es uns, Yersinien unter Kulturbedingungen zu züchten, die in der Menge an verfügbarem Eisen und Sauerstoff variieren, um zu untersuchen, wie sich diese Umwelteinflüsse auf die Expression des Typ-3-Sekretionssystems auswirken. Diese Methode wird uns helfen, den molekularen Mechanismus zu bestimmen, durch den die Verfügbarkeit von Eisen und Sauerstoff die Expression des Typ-3-Sekretionssystems steuert, und uns helfen zu verstehen, wie dies den Ausgang einer Yersinien-Infektion steuert. Zu Beginn Streifen Sie Yersinia Pseudo tuberculosis auf Lysogeny-Bouillon-Agarplatten.

Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei Raumtemperatur. Sobald sich sichtbare Kolonien gebildet haben, inokulieren Sie eine einzelne isolierte Kolonie in vier Milliliter M9-Medium. Kultivieren Sie es über Nacht bei 26 Grad Celsius mit Belüftung bei 250 U/min.

Legen Sie eine Küvette mit der Kultur in ein Spektrometer und verdünnen Sie die Kultur dann in 14 Millilitern sterilem chelatisiertem M9-Medium ohne Eisenzusatz, um einen OD600-Wert von 0,1 zu erreichen. Legen Sie die Kolben in einen 26 Grad Celsius heißen Shaker und inkubieren Sie sie acht Stunden lang. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie die Kultur, um drei frische Kulturen zu starten. zwei für anaerobes Wachstum und eine für aerobes Wachstum.

Für die aerobe Kultivierung verdünnen Sie die Kultur auf einen OD600-Wert von 0,1 in 14 Millilitern sterilen chelatisierten M9-Medien ohne Eisenzusatz. Anschließend 12 Stunden lang mit Belüftung bei 26 Grad Celsius kultivieren. Für die anaerobe Kultivierung verdünnen Sie die Kultur in 14 Millilitern sterilem chelatisiertem M9-Medium in zwei säuregewaschene Glasröhrchen.

Geben Sie im ersten Röhrchen filtersterilisiertes Eisensulfat bis zu einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Liter. Geben Sie in das zweite Röhrchen Eisensulfat für eine Endkonzentration von 0,01 Milligramm pro Liter. Inkubieren Sie beide Röhrchen in einer anaeroben Kammer bei Raumtemperatur für 12 Stunden.

Induzieren Sie dann die Aktivität des Sekretionssystems vom Typ 3, indem Sie die anaeroben Kulturen auf 37 Grad Celsius umstellen und die Inkubation vier Stunden lang fortsetzen. Als nächstes verdünnen Sie die aerob wachsenden Kulturen auf einen OD600-Wert von 0,2, indem Sie 14 Milliliter chelatisiertes M9-Medium in zwei säuregewaschene Kolben geben. Eisensulfat in den erforderlichen Endkonzentrationen wird in die Kolben gegeben.

Beide Kolben werden zwei Stunden lang bei 26 Grad Celsius und 250 U/min belüftet. Nach zwei Stunden werden die Kulturen auf 37 Grad Celsius mit einer Belüftung bei 250 U/min für vier Stunden umgestellt, um die Aktivität des Typ-3-Sekretionssystems zu induzieren. Nach Induktion des Typ-3-Sekretionssystems in Yersinia pseudotuberculosis werden normalisierte Volumina dieser Kultur, die in 15-Milliliter-Röhrchen inkubiert wurden, übertragen.

Geben Sie vier Mikroliter Rinderserumalbumin in jedes Röhrchen als Kontrolle der Proteinfällung. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.200 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,22-Mikron-PVDF-Filter, der an einer Spritze befestigt ist, in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Dann wird Trichloressigsäure zugegeben, die 10 % des Überstandsvolumens entspricht. Wirbeln Sie die Röhren eine Minute lang kräftig ein. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius auf Eis.

Geben Sie anschließend zwei Milliliter jeder Probe in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 21.000 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumaufsatz abgesaugt. Wiederholen Sie das Pipettieren von zwei Millilitern der Probe in dasselbe Röhrchen, zentrifugieren Sie und aspirieren Sie den Überstand.

Konsolidieren Sie die Fällungsreaktionen in einem einzigen Zwei-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Pellets mit einem Milliliter eiskaltem 100%igem Aceton, zentrifugieren Sie sie und ziehen Sie den Überstand an. Nachdem Sie den Überstand ein letztes Mal entfernt haben, trocknen Sie das Pellet eine Stunde lang auf der Bank.

Das gefällte Protein sollte wie ein Schleier an der Seite des Röhrchens aussehen. Dann resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 Mikrolitern F-S-B-DFT-Lösung. Eine Minute lang gründlich vortexen.

Anschließend kochen Sie die Proben auf einem Heizblock bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend kurz bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur zentrifugieren. Laden Sie 15 Mikroliter jeder anaeroben Probe und 10 Mikroliter jeder aeroben Probe zur Analyse in ein 12,5 %-SDS-PAGE-Gel.

Nachdem der Gellauf abgeschlossen ist, verwenden Sie Silberfärbung, um Proteine auf dem Gel sichtbar zu machen. Zu Beginn geben Sie ein SDS-PAGE-Gel mit getrennten aeroben Proben von Yersinia pseudotuberculosis in ein Bildgebungssystem. Wählen Sie in der Software die Banden aus, die das Effektorprotein des Sekretionssystems vom Typ drei, YopE, in allen Vertiefungen darstellen.

Stellen Sie das Referenz-YopE-Band auf das entsprechende Sample ein. Exportieren Sie die von der Software berechneten relativen Quantifizierungswerte für alle YopE-Bänder. Wählen Sie dann alle BSA-Bänder in allen Vertiefungen aus.

Stellen Sie sicher, dass die BSA-Referenzbande mit der Probe der YopE-Referenzbande übereinstimmt. Exportieren Sie die relativen Quantifizierungswerte für alle BSA-Banden. Dividieren Sie den YopE-Wert durch den BSA-Wert für jede Bedingung, um normalisierte Ergebnisse zu erhalten.

Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel zeigte, dass in den anaeroben Proben 38-mal mehr YopE in den eisenarmen Proben im Vergleich zu den eisenreichen Proben vorhanden war. In den aeroben Proben wurden diese Proteine in nahezu gleichen Mengen sezerniert.