Name: Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Ferroptose in Medulloblastom-Zellen induziert wird, um neue Therapien für pädiatrische Tumoren zu entwickeln. Diese Methode nutzt Flusszytometrie zur Analyse lipidischer Hydroperoxide.

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Diese Arbeit wurde von der Regierung des Fürstentums Monaco sowie von der "Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer" (GEMLUC) und der Flavien-Stiftung unterstützt, die die Mittel für den Kauf von BD FACS Melody zur Verfügung stellte.

Die vorliegende Studie wurde mit DAOY-Wildtyp-Medulloblastom-Zelllinien (WT) durchgeführt, die bei 37 °C mit 5 % CO2 in DMEM-Medium und 8 % FBS supplementiert wurden. Die xCT-deletierte Zelllinie wurde unter den gleichen Bedingungen aufrechterhalten, wobei die Experimente in Medien durchgeführt wurden, die mit 1 mM N-Acetylcystein (NAC) ergänzt wurden. Die Zellen wurden regelmäßig mit einem kommerziell erhältlichen Mykoplasmen-Detektionskit auf Mykoplasmen untersucht und bis zur 10. Passage kultiviert.
1. Ernte und Aussaat der Zellen
HINWEIS: Alle Schritte werden mit sterilen aseptischen Techniken in einer Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durchgeführt. DAOY-Medulloblastomzellen sind adhärent, was bedeutet, dass alle nicht gebundenen Zellen durch Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2+ und Mg2+ verworfen werden können.
<ol><li>Nehmen Sie die Brühschale (Petrischale, 100 mm Durchmesser) mit den Zellen und entfernen Sie die schwimmenden Zellen und das Medium mit einem Aspirator von der Platte.</li>
	<li>Geben Sie 5-10 ml PBS in die Schüssel, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der Schale und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator von der Platte.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Trypsin (10-fache Verdünnung) in die Schale. Inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen der Platte lösen. Nehmen Sie 10 ml DMEM-Kulturmedium, das mit 8 % FBS ergänzt ist, und ernten Sie die Zellen mechanisch aus der Schale.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Nehmen Sie 500 μl der Zellsuspension und geben Sie sie zur Zählung in eine Küvette. Zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml Zellsuspension. Für diese Studie wurde ein automatisierter Zellzähler verwendet (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um 1.00.000 Zellen aus der Zellsuspension zu entnehmen.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 6-Well-Platte und geben Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in jede Vertiefung, dann fügen Sie DMEM-Kulturmedien hinzu, die mit 8 % FBS auf 2 ml in jeder Vertiefung ergänzt sind.</li>
</ol>2. Behandlung der Zellen
HINWEIS: Die Kontrolle und die Behandlungen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Gruppen sind wie folgt: Kontrolle (DMSO), 1 μM Erastin, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatin 1, 1 μM Erastin + 2 μM Ferrostatin 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatin 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatin 1. Für das Experiment werden vier 6-Well-Platten benötigt, wie in Tabelle 1 angegeben). Die kaufmännischen Details aller notwendigen Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>24 h nach der Aussaat die entsprechende Behandlung mit den Zellen in die Vertiefung geben.</li>
	<li>Lassen Sie die Gerichte bei 37 °C und 5 % CO2 im Inkubator.</li>
</ol>3. Lipidhydroperoxid-Färbung der behandelten Zellen mit der Sonde BODIPY 581/591 C11
HINWEIS: Die Stammlösung der Lipidhydroperoxid-spezifischen Sonde wird in DMSO in einer Konzentration von 1 mM hergestellt. Aliquote der Stammlösung werden bei -20 °C in undurchsichtigen Röhrchen gelagert. Bereiten Sie zum Färben eine 2 μM Arbeitslösung der Sonde in DMEM-Medien vor, die mit 8 % FBS ergänzt ist.
<ol><li>6 h nach der Behandlung die Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachten (Zellrundungen sollten sichtbar sein).</li>
	<li>Nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur. Entfernen Sie mit einem Aspirator das Medium und die schwimmenden (toten) Zellen.</li>
	<li>Geben Sie vorsichtig 2 ml PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator aus den Vertiefungen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL der Arbeitslösung der Sonde hinzu (2 μM Endkonzentration in DMEM, ergänzt mit FBS).</li>
	<li>Lassen Sie das Gericht bei 37 °C und 5 % CO2 30 min im Dunkeln im Inkubator stehen (die Platten können in Alufolie eingewickelt werden).</li>
</ol>4. Durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in den behandelten Zellen
HINWEIS: Alle folgenden Schritte werden im Dunkeln durchgeführt (keine Lichter in der Laminar-Flow-Haube).
<ol><li>Nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur. Entfernen Sie mit einem Aspirator die Fleckenlösung.</li>
	<li>Geben Sie vorsichtig 2 ml PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator aus den Vertiefungen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal und saugen Sie das restliche PBS mit einem Aspirator aus der Vertiefung ab.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl eines handelsüblichen Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle) auf den Boden jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen auf die Platte lösen. Nehmen Sie 250 μl FACS-Puffer (PBS, 2 mM EDTA, 0,5 % BSA) und ernten Sie die Zellen mechanisch aus den Wells.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in das entsprechende (zuvor gekennzeichnete) FACS-Röhrchen mit der Filterkappe. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen im Dunkeln auf Eis, bis die Analyse durchgeführt wird (die Analyse sollte innerhalb einer Stunde nach der Färbung durchgeführt werden). HINWEIS: Die Einrichtung und Kalibrierung der FACS-Maschine hängt von der verwendeten Maschine ab (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Erstellen Sie ein neues Experiment und geben Sie ihm einen Namen (Ferroptose in DAOY - Lipidhydroperoxide).</li>
	<li>Wählen Sie im Versuchsdesign den Laser (488 nm) und den Filter (FITC).</li>
	<li>Wählen Sie in den Ansichtsdaten die richtige Zellgröße (>12 μm) aus, stellen Sie die PMT-Spannungen ein (die Zellpopulation sollte im ersten Quadranten des SSC-H/FSC-H-Punktdiagramms angezeigt werden) und schalten Sie das Punktdiagramm ein.</li>
	<li>Fügen Sie ein neues Diagramm - Histogramm mit FITC-A auf der y-Achse und logarithmischer Skala hinzu.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Proben in das FACS-Röhrchen, legen Sie sie in die FACS-Maschine und laden Sie die Probe. Zeichnen Sie 10.000 FSC-Singulett-Ereignisse auf und benennen Sie die Datei (z. B. DAOY WT CTL 6h). Exportieren Sie die Datei als .fcs.</li>
</ol>5. Propidiumiodid (PI)-Färbung der abgestorbenen Zellen nach der Behandlung
HINWEIS: Das Versuchsdesign ist genau das gleiche wie bei der Messung von Lipidhydroperoxid (siehe Schritt 1 und Schritt 2).
<ol><li>24 h nach der Aussaat nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und stellen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium (mit abgestorbenen Zellen) in einem 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und sammeln Sie dann das PBS in das Röhrchen mit dem entsprechenden Medium.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl Trypsin (10-fache Verdünnung) auf den Boden jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen auf die Platte lösen. Verwenden Sie das jeweilige Medium + PBS, um die Zellen aus den Wells zu ernten.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 180 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer und legen Sie es bis zur Analyse auf Eis.</li>
	<li>Geben Sie kurz vor der Analyse PI-Lösung (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 2 μg/ml.</li>
</ol>6. Durchflusszytometrische Analyse toter Zellen 24 Stunden nach der Behandlung
HINWEIS: Die FACS-Geräteeinstellungen und die Kalibrierung erfolgen wie zuvor angegeben (siehe Schritt 4).
<ol><li>Erstellen Sie ein neues Experiment und geben Sie ihm einen Namen (Ferroptose in DAOY - Zelltod).</li>
	<li>Wählen Sie im Versuchsdesign den Laser (488 nm) und den Filter (PE).</li>
	<li>Wählen Sie in den Ansichtsdaten die richtige Zellgröße (>12 μm) aus, stellen Sie die PMT-Spannungen ein (die Zellpopulation sollte im ersten Quadranten des SSC-H/FSC-H-Dotplots erscheinen) und gaten Sie das Dotplot.</li>
	<li>Fügen Sie ein neues Diagramm - Histogramm mit PE-A auf der y-Achse und logarithmischer Skala hinzu.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Proben in das FACS-Röhrchen, legen Sie sie in die FACS-Maschine und laden Sie die Probe.</li>
	<li>Zeichnen Sie 10.000 FSC-Singulett-Ereignisse auf und benennen Sie die Datei (z. B. DAOY WT CTL 6h). Exportieren Sie die Datei als .fcs.</li>
</ol>7. Durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in den DAOY xCT-/- Zellen
HINWEIS: xCT-/- Zellen wurden wie zuvor beschriebenerzeugt 24.
<ol><li>Für dieses Experiment säen Sie die Zellen wie in Schritt 2 angegeben, aber ergänzen Sie das Medium anstelle der Behandlung über Nacht mit 1 mM NAC.</li>
	<li>Behalten Sie am nächsten Tag die NAC in einer Gruppe bei und entfernen Sie sie aus der anderen.</li>
	<li>Führen Sie die durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts auf genau die gleiche Weise durch, wie in Schritt 6 beschrieben.</li>
</ol>8. Analyse der Ergebnisse des Durchflusszytometers
<ol><li>Öffnen Sie das .fcs-Dokument in der FlowJo-Software (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Mit einem Doppelklick auf die einzelne Datei öffnen Sie alle Events (nicht nur FCS-Singuletts), die in der einzelnen Probe aufgezeichnet wurden (SSC-A/FSC-A Dot Plot). Da die Einstellungen so sind, dass das an der Maschine vorgenommene Gating nicht beibehalten wird, ist es notwendig, das Tor erneut zu erstellen und die Population zu benennen (z. B. DAOY WT).</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Gated Population , um ein weiteres Fenster mit dem Histogramm zu öffnen.</li>
	<li>Ändern Sie die Y-Achse auf den verwendeten Leuchtstofffilter (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>Ändern Sie die X-Achse in modal (normalisieren Sie jeden Peak auf seinen Modus, d. h. auf % der maximalen Anzahl von Zellen in einem bestimmten Bin).</li>
	<li>Kopieren Sie das Histogramm in den Layout-Editor. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Beispiele, und ziehen Sie jedes Mal, wenn ein neues Histogramm in den Layout-Editor eingefügt wird, es über das vorherige, sodass die Histogramme überlagert werden (halber Versatz).</li>
</ol>

FACS-Analyse von Lipidhydroperoxiden in ferroptotischen Medulloblastomzellen

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
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<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
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<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

Wir erklären, dass für die hier vorgestellte Studie kein Interessenkonflikt besteht.

Das primäre Kennzeichen des ferroptotischen Zelltods ist die unkontrollierte Akkumulation von Lipidhydroperoxiden in der Plasmamembran. Diese oxidative Schädigung kann auf enzymatische oder nicht-enzymatische Weise auftreten, aber in beiden Fällen ist die Reaktion eisenabhängig/katalysiert, was den Namen dieser Art des Zelltods erklärt. Die Lipidhydroperoxidation wird oft indirekt durch Messung der Abbauprodukte der Lipidhydroperoxidation geschätzt, wie z. B. 4-Hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) oder Malonaldehyd (MDA). Diese Produkte, die durch die peroxidative Zersetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren entstehen, können mit verschiedenen Makromolekülen reagieren, was zu einer Vielzahl von Erkrankungen führt, wie z. B. neurodegenerative Erkrankungen, Diabetes und chronische Herzinsuffizienz. Nichtsdestotrotz sind dies die Folgen des Peroxidationsereignisses, und es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um gute Lipidhydroperoxid-spezifische Sonden zu entwickeln.
Eine häufig verwendete Sonde ist BODIPY 581/591 C11, die auch ihre Nachteile hat, die es zu beachten gilt. Konkret weist die Fluoreszenzfarbe BODIPY 591/581 zwei Emissionspeaks auf, einen im reduzierten Zustand (590 nm) und einen im oxidierten Zustand (510 nm). Das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz bei diesen beiden Wellenlängen ist von besonderer Bedeutung, wenn eine genaue Quantifizierung angestrebt wird. Die Intensität der Einzelemissionsfluoreszenz von BODIPY 591/581 nm ist jedoch inder Literatur weit verbreitet 1,25,26,27,28, zumal die reduzierte Intensität der roten Emission bei 510 nm häufig durch den Spillover der Fluoreszenz des oxidierten Moleküls überdeckt wird 22,29. Dies ist einer der Hauptgründe, warum die Fluoreszenz von BODIPY 591/581 in der Regel qualitativ in Abhängigkeit von der einzelnen (grünen) Fluoreszenzintensität dargestellt wird.
Eine weitere wichtige Einschränkung dieser Sonde ist ihre konzentrationsabhängige Unterdrückung der Fluoreszenzemission durch Antioxidantien30. Daher sollte die Färbung in Medien ohne antioxidative Supplementierung durchgeführt werden. Im vorliegenden Protokoll wurde Ferrostatin 1, ein starker Abscheider von Lipidhydroperoxiden, verwendet; Nichtsdestotrotz wurde vor der Zugabe der Sonde Ferrostatin 1 entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen, so dass die Sonde nicht ihrer antioxidativen Aktivität ausgesetzt war.
Hinsichtlich der Ferroptose-Induktion könnten viele kommerziell erhältliche Medikamente eingesetzt werden. Hier kam Erastin, ein irreversibler Inhibitor des xCT-Transporters31, zum Einsatz. Da es kovalent an den Transporter bindet, könnten noch höhere Konzentrationen (bis zu 100 μM) für einen kürzeren Zeitraum (5 min) verwendet werden, gefolgt von einem Waschschritt31. Um die genaue Kinetik der Ferroptose nach vollständiger Hemmung der xCT zu bewerten, wurden xCT-/- Zellen in Abwesenheit von NAC verwendet. Eine massive Akkumulation von Lipidhydroperoxiden war nach 6 h nachweisbar, und 24 h nach der Aussaat waren praktisch keine lebensfähigen Zellen mehr nachweisbar. RSL3, ein hochpotenter Induktor der Ferroptose im nanomolaren Bereich, zeigte eine ähnliche Kinetik wie bei xCT-/- Zellen. Seine Wirkungsweise ist noch ziemlich umstritten, aber es scheint, dass sie die Aktivität nicht beeinflusst, sondern stattdessen den Abbau des GPx4-Enzyms32,33 induziert.
Ein wichtiger Aspekt der Ferroptose-Induktion in vitro ist die Zellkonfluenz. Es wurde seit langem beobachtet, dass eine konfluente Zellschicht viel widerstandsfähiger gegen Cysteinmangel, xCT- oder GPx4-Hemmung, GSH-Abbau usw. ist.34. Als Hauptgrund wird angegeben, dass physischer Kontakt, d.h. Konfluenz, zur Aktivierung des Hippo-Signalwegs führt, der wiederum den Stoffwechsel und die interne Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) herunterreguliert. Darüber hinaus könnte das Shuttle von reduziertem Cystein auch zur Resistenz gegen eine inkomplette xCT-Hemmung beitragen35. In der vorliegenden Studie wurde eine Konzentration von 1.00.000 Zellen pro Well (6-Well-Platte) verwendet, um eine geringe Konfluenz mit Zellen aufrechtzuerhalten, die eher groß und flach sind. Bei kleineren und runden Zellen, wie z. B. HD-MB03, könnte diese Zahl jedoch auf 1,50,000 bis 2,00,000 Zellen pro Well (6-Well-Platte) erhöht werden.
Die letzte Einschränkung der vorliegenden Studie ist der Nachweis des Zelltods mit der Propidiumiodid (PI)-Methode. Diese Methode ist benutzerfreundlich für den Nachweis jeder Art von Zelltod, und Ferroptose könnte durch die Verwendung von Ferroptose-spezifischen Inhibitoren wie Ferrostatin-1 von anderen Arten des Zelltods unterschieden werden. Die PI-Färbung basiert auf der Tatsache, dass sterbende Zellen die Membranintegrität verlieren, wodurch PI in die Zellen eindringen, zwischen den DNA-Basen interkalieren und ein Fluoreszenzsignal aussenden kann. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die Lipidhydroperoxidation eine Membranleckage induziert, die das Eindringen von PI ermöglicht, noch bevor der Zelltod eintritt. Daher ist es eine Herausforderung, die Kinetik der Ferroptose allein auf der Grundlage dieser Methode abzuschätzen.

Ferroptose ist eine neu kontextualisierte, von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) abhängige Art des Zelltods1. Neben ROS spielt Eisen eine entscheidende Rolle(n) bei dieser Art des Zelltods, daher der Name2. Der letzte und ausführende Schritt der Ferroptose ist die eisenkatalysierte Akkumulation oxidativer Schäden an Lipiden in der Plasmamembran, die schließlich zu einer Beeinträchtigung der Membranintegrität und selektiven Permeabilität und schließlich zum Zelltod durch Blasenbildung führt. Das Lipid-Hydroperoxidationsereignis ist ein natürlich vorkommendes Phänomen. Seine Ausbreitung in der Zellmembran wird jedoch durch die antioxidative Abwehr der Zelle verhindert. Der Hauptakteur in diesem Zusammenhang ist die Se-Protein-Glutathionperoxidase 4 (GPx4), die sich der Membran nähern und Lipidhydroperoxide in ihre weniger toxischen Alkoholderivateumwandeln kann 3. Die reduzierende Kraft für GPx4 wird hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, durch Glutathion (GSH) bereitgestellt, ein Tripeptid, das aus den nicht-essentiellen Aminosäuren Glycin, Glutamat und Cystein besteht. Die geschwindigkeitsbestimmende Aminosäure für die Biosynthese von GSH ist Cystein4. Obwohl Cystein als nicht-essentielle Aminosäure eingestuft wird, kann sein Bedarf seine interne Produktion in stark proliferativen Zellen (wie Krebszellen) leicht übersteigen. Damit wurde es wieder in die Gruppe der semi-essentiellen Aminosäuren eingeordnet. Der notwendige Import von Cystein erfolgt hauptsächlich durch das Xc-System, das den Import der oxidierten (dominanten) Form von Cystein (aka Cystin) auf Kosten des Glutamatexportsermöglicht 5. Das Xc-System setzt sich aus einer Na+-unabhängigen, Cl-abhängigen Transportuntereinheit, bekannt als xCT, und einer Chaperon-Untereinheit, bekannt als CD98, zusammen. Bis vor kurzem galten die antiferroptotischen Eigenschaften der xCT-GSH-GPx4-Achse als einzigartig und unreproduzierbar6. Im Jahr 2019 wurde jedoch ein alternativer antiferroptotischer Signalweg, bestehend aus Ubiquinol (Coenzym Q10) und seinem regenerativen Enzym - dem Ferroptose-Suppressorprotein 1 (FSP1) - beschrieben 7,8. Bald darauf wurde über ein weiteres Lipidhydroperoxid-Entgiftungssystem mit GTP-Cyclohydrolase-1/Tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4) berichtet9. Nichtsdestotrotz scheint die zentrale Rolle der xCT-GSH-GPx4-Achse bei der Prävention der Ferroptose nicht in Frage gestellt zu werden.
In den letzten zehn Jahren wurde die Ferroptose bei einer Vielzahl von Tumorarten ausgiebig untersucht, was ein großes Potenzial als Anti-Krebs-Strategie zeigt (überprüft von Lei et al.10). Darüber hinaus wurde berichtet, dass Krebszellen, die eine hohe Resistenz gegen konventionelle Chemotherapeutika und/oder eine Neigung zur Metastasierung aufweisen, überraschend empfindlich auf Ferroptose-Induktoren, wie z. B. Inhibitoren von GPx4 11,12,13, reagieren. Im Zusammenhang mit Hirntumoren ist das Potenzial ferroptotischer Induktoren jedoch noch weitgehend wenig untersucht. Während diese Art des Zelltods eng mit zerebralen Ischämie-Reperfusionsschäden14und neurodegenerativen Erkrankungen15 in Verbindung gebracht wurde, beschränkte sich ihr Potenzial im Zusammenhang mit Hirntumoren hauptsächlich auf das Glioblastom, den häufigsten bösartigen Schädel-Hirn-Tumor (überprüft von Zhuo et al.16). Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit des Medulloblastoms, dem häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern und einer der Hauptursachen für die Kindersterblichkeit, gegenüber Ferroptose-Induktoren weitgehend unerforscht. Nach unserem Kenntnisstand gibt es kaum begutachtete Literatur, die Ferroptose und Medulloblastom in Verbindung bringt. Nichtsdestotrotz haben einige Studien gezeigt, dass Eisen eine entscheidende Rolle für das Überleben, die Proliferation und das tumorigene Potenzial sowohl von Medulloblastom- als auch von Glioblastom-Krebsstammzellen (CSCs) spielt17,18 und sie möglicherweise anfälliger für Ferroptose-Induktion macht. Dies ist von besonderer Bedeutung, da das Medulloblastom berüchtigt ist für seine Subpopulation von CSCs oder tumorinitiierenden/-vermehrenden Zellen, die weitgehend für die Chemoresistenz, Dissemination und den Rückfall von Tumoren verantwortlich zu sein scheinen19.
Die Empfindlichkeit gegenüber der Ferroptose-Induktion wird in der Regel durch Messung des Gehalts/der Akkumulation von Lipidhydroperoxiden untersucht, die zum Zelltod führen können oder auch nicht. Die am häufigsten verwendeten Ferroptose-Induktoren sind (1) Erastin, ein Inhibitor des xCT-Transporters20, (2) RSL3, ein Inhibitor des GPx4-Enzyms2, und/oder (3) Eisendonoren, wie z. B. Ferroammoniumcitrat (FAC)21. Der Gehalt an Lipidhydroperoxid wird mit der selektiven Sonde BODIPY 581/591 C1122 bestimmt, die im reduzierten Zustand Anregungs- und Emissionsmaxima bei 581/591 nm aufweist. Bei Wechselwirkung mit und Oxidation durch Lipidhydroperoxide verschiebt die Sonde ihre Anregungs- und Emissionsmaxima auf 488/510 nm. Typischerweise geht ein signifikanter Anstieg des Lipidhydroperoxidgehalts dem feroptotischen Zelltod voraus. Da es sich bei der Ferroptose nicht um einen programmierten Zelltod handelt, gibt es keine molekulare Signalkaskade, die zu ihrer Ausführung führt. Daher besteht die einzige Möglichkeit, dies zu bestätigen, darin, den Gehalt an Lipidhydroperoxid zu überwachen und spezifische Inhibitoren für diese Art des Zelltods zu verwenden, wie z. B. Ferrostatin 123. Ferrostatin 1 ist ein lipophiles Antioxidans, das in das Lipidkompartiment der Zelle eindringen und Lipidhydroperoxide entgiften kann, wodurch ferroptotische Ereignisse verhindert werden.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Beckman</td><td>Schar Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mittel</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ferroamminiumcitrat</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Bovin-Serum (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz</td><td>Thermo</td><td>Fisher 11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

entschlüsselung des ferroptotischen phänotyps des medulloblastoms

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

Die Wechselwirkung von Eisen und Sauerstoff ist ein integraler Bestandteil der Entwicklung des Lebens auf der Erde. Nichtsdestotrotz fasziniert und rätselt diese einzigartige Chemie immer wieder und führt zu neuen biologischen Unternehmungen. Im Jahr 2012 erkannte eine Gruppe der Columbia University diese Wechselwirkung als zentrales Ereignis, das zu einer neuen Art des regulierten Zelltods namens "Ferroptose" führt. Das Hauptmerkmal der Ferroptose ist die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden aufgrund von (1) dysfunktionaler antioxidativer Abwehr und/oder (2) überwältigendem oxidativem Stress, der am häufigsten mit einem erhöhten Gehalt an freiem labilem Eisen in der Zelle zusammenfällt. Dies wird normalerweise durch die kanonische antiferroptotische Achse verhindert, die aus dem Cystintransporter xCT, Glutathion (GSH) und GSH-Peroxidase 4 (GPx4) besteht. Da es sich bei der Ferroptose nicht um eine programmierte Art des Zelltods handelt, sind keine für die Apoptose charakteristischen Signalwege beteiligt. Der gebräuchlichste Weg, diese Art des Zelltods nachzuweisen, ist die Verwendung von lipophilen Antioxidantien (Vitamin E, Ferrostatin-1 usw.), um ihn zu verhindern. Diese Moleküle können sich oxidativen Schäden in der Plasmamembran nähern und diese entgiften. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Aufklärung des ferroptotischen Phänotyps ist der Nachweis der vorangegangenen Akkumulation von Lipidhydroperoxiden, für die der spezifische Farbstoff BODIPY C11 verwendet wird. Das vorliegende Manuskript wird zeigen, wie Ferroptose in Wildtyp-Medulloblastomzellen mit Hilfe verschiedener Induktoren induziert werden kann: Erastin, RSL3 und Eisendonor. In ähnlicher Weise werden die xCT-KO-Zellen verwendet, die in Gegenwart von NAC wachsen und nach der Entfernung von NAC einer Ferroptose unterzogen werden. Der charakteristische "bubble" Phänotyp ist unter dem Lichtmikroskop innerhalb von 12-16 Stunden ab dem Zeitpunkt der Auslösung der Ferroptose sichtbar. Darüber hinaus wird eine BODIPY C11-Färbung mit anschließender FACS-Analyse verwendet, um die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden und den daraus resultierenden Zelltod mit der PI-Färbemethode zu zeigen. Um die ferroptotische Natur des Zelltods nachzuweisen, wird Ferrostatin-1 als spezifisches Ferroptose-verhinderndes Mittel verwendet.

Die Medulloblastom-Zelllinie DAOY wurde in einem Standard-DMEM-Medium kultiviert, das mit 8 % FBS ergänzt wurde, bis sie eine Konfluenz von etwa 60 % erreichte. Am Tag des Experiments wurden die Zellen geerntet und 1.00.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten plattiert, wie aus Tabelle 1 hervorgeht. Am folgenden Tag wurden die Zellen (in dreifacher Ausfertigung) entweder mit 1 μM Erastin, 0,3 μM RSL3 oder 250 μM FAC behandelt. Die Platten wurden dann bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator gelegt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen unter dem Mikroskop beobachtet, um sprudelnde Zellen zu erkennen, wie durch die Pfeile in Abbildung 1 dargestellt. Dies diente als Indikator dafür, dass das Medikament bei der Induktion der Ferroptose wirksam war, bevor die Zellen für die Lipidhydroperoxid-Färbung und die anschließende FACS-Analyse vorbereitet wurden.
Für den Nachweis des Lipidhydroperoxidgehalts wurde der spezifische Farbstoff BODIPY 581/591 C11 in einer Endkonzentration von 2 μM für 30 min verwendet. Da dieser Farbstoff redoxempfindlich ist, war es notwendig, jegliche Behandlung aus den Zellen zu entfernen und sie mit vorgewärmtem PBS zu waschen. Nach einer halben Stunde Färbung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, mit der Zellablösungslösung abgelöst und für die FACS-Analyse vorbereitet. Die in diesem Schritt erhaltenen Daten zeigten eine erhöhte grüne Fluoreszenz des Farbstoffs in den Proben, die mit allen drei Medikamenten behandelt wurden (Abbildung 2). Die stärkste Wirkung wurde jedoch mit 0,3 μM RSL3 (Abbildung 2B) beobachtet, während 1 μM Erastin (Abbildung 2A) und 250 μM FAC (Abbildung 2C) nach 6 Stunden Behandlung eine etwas geringere Wirkung zeigten.
Um festzustellen, dass die nachgewiesene Lipidhydroperoxid-Akkumulation zum Zelltod, insbesondere zur Ferroptose, führt, wurden die gleichen Behandlungen wie in Tabelle 1 für 24 Stunden angewendet. Für die Analyse toter Zellen mittels Durchflusszytometrie wurden sowohl die Zellen als auch der Überstand entnommen. Die lebenden und toten Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und dann für die anschließende durchflusszytometrische Analyse in FACS-Puffer resuspendiert. Die in Abbildung 3 dargestellten Daten zeigten, dass alle drei Behandlungen einen massiven Zelltod induzierten, der durch den Einsatz des Ferroptose-spezifischen Inhibitors Ferrostatin-1 vollständig verhindert wurde. Dies spricht eindeutig für das Auftreten des ferroptotischen Zelltods bei xCT-Hemmung, GPx4-Hemmung oder Eisenüberladung in Medulloblastomzellen.
Angesichts der Tatsache, dass die drei Medikamente etwas unterschiedliche Wirkungen auf die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden zeigten, wahrscheinlich aufgrund von Unterschieden in der Wirksamkeit, wurde ein genetischer Ansatz verwendet, um die volle Wirksamkeit der ferroptotischen Induktoren zu untersuchen. Zuvor erhaltene DAOY xCT-/- Zellen (Ergänzende Abbildung 1A) wurden in den gleichen Medien wie ihre WT-Gegenstücke kultiviert, jedoch mit NAC-Supplementierung. Diese positive Selektion ermöglichte es den xCT-/- Zellen, in Kultur zu wachsen. 6 Stunden nach der Entfernung von NAC aus dem Kultivierungsmedium begannen die Zellen jedoch, Lipidhydroperoxide auf dem gleichen Niveau zu akkumulieren wie WT-Zellen, die mit RSL3 behandelt wurden (Abbildung 4). Ähnlich wie bei der pharmakologischen Hemmung induzierte die Entfernung von NAC aus dem Medium das charakteristische Blasen von xCT-/- Zellen nach 6 h (Ergänzende Abbildung 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> Abbildung 1: Ferroptotischer Phänotyp von Medulloblastomzellen. Repräsentative Mikroskopische Aufnahmen von DAOY WT-Zellen, die 6 h lang mit 1 μM Erastin (ERA), 0,3 μM RSL3 oder 250 μM Ferrolamoniumcitrat (FAC) in Gegenwart oder ohne 2 μM Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1 (Ferro-1) behandelt wurden (oder nicht). Weiße Pfeile deuten auf runde, "blasenförmige" Zellen hin, was auf einen ferroptotischen Phänotyp hinweist, der unter einem Lichtmikroskop sichtbar ist. Vergrößerung: 20x, Einsätze: 40x. Maßstabsleisten: 50 μm, Einschübe: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> Abbildung 2: Lipidhydroperoxid als Schlüsselmarker für Ferroptose in Medulloblastomzellen. Repräsentative Daten der Lipidhydroperoxid-Färbung mittels Durchflusszytometrie in den Zellen, die 6 h lang mit (A,B) 1 μM Erastin (ERA), (C,D) 0,3 μM RSL3 oder (E,F) 250 μM Ferrammoniumcitrat (FAC) behandelt wurden, in Gegenwart oder nicht mit 2 μM Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1 (Ferro-1). (A,C,E) Punktdiagramme der aufgezeichneten Ereignisse; (B,T,F) Histogrammdarstellung des Lipidhydroperoxidgehalts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> Abbildung 3: Induktion des ferroptotischen Zelltods durch pharmakologischen Ansatz. Repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme von Propidiumiodid-gefärbten Zellen nach 6 Stunden Behandlung mit 1 μM Erastin (ERA), 0,3 μM RSL3 oder 250 μM Ferroramoniumcitrat (FAC) in Gegenwart oder nicht von 2 μM Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1 (Ferro-1). Das Gating trennt lebende (Q4) und tote (Q3) Populationen der Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> Abbildung 4: Ferroptose-Induktion durch genetischen Ansatz. Repräsentative Daten der Lipidhydroperoxid-Färbung mittels Durchflusszytometrie in den DAOY WT- und xCT-/- Zellen nach 6 h in Gegenwart oder nicht von 2 μM Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1 (Ferro-1). Auf der linken Seite ist die Histogrammdarstellung des Lipidhydroperoxidgehalts zu sehen. Auf der rechten Seite sind die Punktdiagramme der aufgezeichneten Ereignisse zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tafel I</td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 μM Erastin I</td>
			<td>1 μM Erastin II</td>
			<td>1 μM Erastin III</td>
		</tr><tr><td>Tafel II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 I</td>
			<td>0,3 μM RSL3 II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 μM FAC I</td>
			<td>250 μM FAC II</td>
			<td>250 μM FAC III</td>
		</tr><tr><td>Tafel III</td>
			<td>2 μM Ferro-1 I</td>
			<td>2 μM Ferro-1 II</td>
			<td>2 μM Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 M Erastin + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>1 M Erastin + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M Erastin + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td>Tafel IV</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 III</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Behandlungsdetails der Kontroll- und Versuchszellen.
Ergänzende Abbildung 1: Ferroptotischer Zelltod der DAOY xCT-/- Zellen. (A) Western-Blot-Analyse des xCT-Spiegels in DAOY WT- und xCT-/- Zellen in DMEM-Medien , ergänzt oder nicht mit 2 μM Ferrostatin-1. (B) Repräsentative Mikroskopische Aufnahmen der DAOY xCT-/- Zellen in Gegenwart (links) und Abwesenheit (rechts) von 1mM N-Acetylcystein für 6 h. Weiße Pfeile deuten auf runde, "blasenförmige" Zellen hin, was auf einen ferroptotischen Phänotyp hinweist, der unter einem Lichtmikroskop sichtbar ist. Vergrößerung: 40x. Maßstab: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Der Gehalt an Lipidhydroperoxid ist der am häufigsten verwendete Indikator für den feroptotischen Zelltod. Dieser Artikel zeigt die Schritt-für-Schritt-Durchflusszytometrie-Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in Zellen nach Ferroptose-Induktion.

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revealing-the-ferroptotic-phenotype-of-medulloblastoma

Research

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

In diesem Artikel haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter Mutanten von KI-Familienkinasen vorgestellt, die In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungstest und komplementärer Split-Luziferase-Assay umfassen.

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

Erfahren Sie, wie Ferroptose in Medulloblastom-Zellen induziert wird, um neue Therapien für pädiatrische Tumoren zu entwickeln. Diese Methode nutzt Flusszytometrie zur Analyse lipidischer Hydroperoxide.

Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms

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