Name: Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Endothelzellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus mit schonender Dissoziation und magnetischer Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gefäßbiologie und Krankheitsmechanismen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Rationalisierung der Extraktion von Pankreas-Endothelzellen der Maus für Krankheitsstudien

<table><tbody><tr><td>1,5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Schale</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G Nadeln</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sieb</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-Biotin</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin Hitzeschock behandelt</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1, aus Kalbsleder</td><td>Sigma Aldrich& nbsp;</td><td>C9791</td><td>Attachment-Reagenz im Protokoll</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatischer Zellzähler</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td>Immunfluoreszenz-Einweg-Sicherheitsskalpelle</tr><tr><td></td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>Gehalten bei 37 > C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand mit dem QuadroMACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokügelchen Anti-Biotin</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Zur Beurteilung der Zellmorphologie</td></tr><tr><td>Molekulares Wasser</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Orbitalschüttler&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) (kein Ca2+, kein Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Vorwärtsmaus</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Revese Maus&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Forward Maus&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Reverse Maus</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Reverse Maus&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Vorwärtsmaus</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Vorwärtsmaus</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Rückwärtsmaus</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 12" lange Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Feinzange</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Feinschere</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen 2cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Immunfluoreszenz-Wasserbad</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von endothelzellen der bauchspeicheldrüse der maus

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

Nach diesem Protokoll können etwa 2 x 106 lebende Zellen gewonnen werden, wenn 3 Maus-Bauchspeicheldrüsen gepoolt werden, und 750.000 Zellen aus einer einzigen Maus-Bauchspeicheldrüse. Um die Anreicherung von EC zu validieren, führten wir die folgenden Analysen durch: 1) quantitative PCR: Im Vergleich zu den Flow-Through-Proben (d.h. den nicht-CD31-Antikörper-gebundenen Fraktionen) wiesen die EC-Fraktionen signifikant höhere Spiegel von Pecam1 (kodiert für CD31) und Kdr (kodierend für VEGFR2), zwei EC-Markergene33, und niedrigere Spiegel von NK6 Homöobox 1 (Nkx6.1)), einem Transkriptionsfaktor in den endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse, auf (Abbildung 4A); 2) Western Blotting: EC-angereicherte Proben aus drei Präparaten (pEC-1-3) zeigten starke Signale von CD31 in der erwarteten Größe (~130 kDa). Im Vergleich dazu zeigten die Eingangs- und FT-Proben ein minimales CD31-Signal. Als Positivkontrolle zeigten auch Lysate von MS1-Zellen, einer pEC-Zelllinie, ein starkes CD31-Signal (Abbildung 4B); 3) Trypanblau-Färbung: Wir fanden heraus, dass die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen bei etwa 50 % lag (Abbildung 4C); 4) Durchflusszytometrie nach einem veröffentlichten Protokoll15 : Durch Gating an der lebenden Zellpopulation (Abbildung 4D) fanden wir heraus, dass die CD31+-Zellen bei 88 % und die TdTomato+-Zellen bei 76 % lagen. Bemerkenswert ist, dass die Mehrzahl der isolierten Zellen CD31 und TdTomato co-exprimiert (Abbildung 4E). Als Negativkontrollen zeigten die ungefärbten MS1-Zellen und MS1, die mit IgG inkubiert wurden, keine lebenden Zellen, wie sie mit CD31 markiert waren. Als Positivkontrolle, d.h. MS1-Zellen, die für CD31 gefärbt wurden, zeigten sie nahezu 100% lebende CD31+-Zellen (Abbildung 4F). Wir kultivierten auch die isolierten Zellen, führten eine Immunfluoreszenzfärbung von PECAM1 nach einem veröffentlichten Protokolldurch 36 und bildeten TdTomato ab, das robuste Signale beider Marker in den isolierten Zellen zeigte, was auf das Vorhandensein von ECs hindeutet (Abbildung 4G).
<img alt="Pankreasdiagramm zur Veranschaulichung von Intra-Insel-ECs für die Untersuchung der Gefäßstruktur und die Analyse der zellulären Interaktion." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1: Illustration der Vaskularisation der Bauchspeicheldrüse und der Pankreasinseln. Eine bildliche Darstellung der Endothelzellen (ECs) der Bauchspeicheldrüse und der Intra-Insel-ECs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Diagramm zur Vorbereitung der einzelligen Bauchspeicheldrüse; Zentrifugation, CD31-Biotin-Markierung, Durchflussanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Überblick über den Arbeitsablauf. 1) Pankreasdissektion, 2) mechanischer Verdau, 3) Enzyminkubation, 4) Zentrifugation, 5a) Entfernung des Überstands und 5b) sekundärer Kollagenaseverdau der Zellpellets mit Verreibung zur Filterung in 6), 7) und 8) Rekonstitution von Pellets und Antikörperbindung, 9) Inkubation von Mikrobeads, 10) Anreicherung von MACS-Säulen, 11) Zellzählung für die Lebensfähigkeit und 12) nachgelagerte Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Gewebedissektion, die den Entnahme-, Isolierungs- und Trimmprozess der Bauchspeicheldrüse in der biologischen Forschung zeigt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Schritte der Gewebeverarbeitung. Bilder von (A) der Bauchhöhle, (B) der isolierten Bauchspeicheldrüse der Maus und (C) der getrimmten Bauchspeicheldrüse der Maus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Ergebnisse der Genexpression, CD31-Analyse, DAPI, Zellsortierung, Fluoreszenz und Durchflusszytometrie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Validierung isolierter EC-Fraktionen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus. (A) qPCR von FT-Proben und angereicherter EC-Fraktion mit CD31 zur Anreicherung. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) und Nkx6.1 (pankreatischer β-zellspezifischer Transkriptionsfaktor)33. * bedeutet p &lt;0,05 im Vergleich zu FT auf der Grundlage von t-Tests . n = 3-4 gepoolte Proben, bestehend aus je 3 Mäusen. (B) Western-Blotting von CD31. pEC-1-3 zeigen angereicherte ECs aus 3 separaten gepoolten Mausproben an. Zelllysate von 30 mg wurden auf jede Spur geladen, gefolgt von einer Ponceau S-Färbung. (C) Zellzählung und Trypanblau-Färbung von angereicherten pECs für den Viabilitätsassay. (D) Durchflusszytometrische Gating-Strategie für Maus-pECs, die mit 4'-, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und CD31-Antikörpern gefärbt wurden. (E) Durchflusszytometrische Histogramme von ungefärbtem MS1 (oben links), MS1, gefärbt mit AlexaFluor-488-Sekundärantikörper (IgG-Kontrolle; oben rechts), MS1, gefärbt mit CD31 (unten links) und den isolierten Maus-pECs, gefärbt mit CD31 (unten rechts). (F) Prozentsatz lebender Zellen, quantifiziert mittels Durchflusszytometrie. (G) Immunfluoreszenz der CD31-Expression (grün) mit DAPI-Gegenfärbung (blau) und endogenem TdTomato-Fluoreszenzreporter (rot). Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Immunfluoreszenzmikroskopie CD31/CD144/DAPI, UMAP-Genexpressionsanalyse von Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Abbildung 5: CD31- und CD144-Spezifität in der Bauchspeicheldrüse der Maus. (A) Immunfluoreszenz der Bauchspeicheldrüse der Maus mit CD31 (Magenta) und CD144 (Cyan), mit DAPI-Gegenfärbung. Bild, das mit einem 10-fach-Objektiv unter einem inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurde. Maßstabsleiste = 100 μm. Gestrichelte Linien markieren den Inselbereich. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP), die die Expression von Cdh5 und Pecam1 in den Insel-ECs von C57BL6-Mäusen zeigt, die mit scRNA-seq (GSE128565)37 nachgewiesen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzym</td>
			<td>Gebrauchen</td>
			<td>Temperatur und Zeit</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase I</td>
			<td>Einzelzelldissoziation, EC-Anreicherung der gesamten Bauchspeicheldrüse</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Dieses Protokoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase IV</td>
			<td>Inselisolierung und nicht-enzymatische Dissoziation</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase + Trypsin</td>
			<td>Untersuchung duktaler Zellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase B</td>
			<td>Einzellige Suspension der Bauchspeicheldrüse</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase NBI</td>
			<td>Isolierung von Inselzellen</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase P</td>
			<td>Acinar lebensfähige Suspension</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenase XI</td>
			<td>Isolierung von Inselzellen</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Einzellige Suspension</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Einzellige Suspension</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Einzelzelldissoziation, ganze Bauchspeicheldrüse</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Zusammenfassung verschiedener Protokolle, die zur Verarbeitung von Pankreasproben der Maus verwendet werden.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Lernen Sie die Isolierung von Endothelzellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus mit schonender Dissoziation und magnetischer Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gefäßbiologie und Krankheitsmechanismen.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

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