Name: Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die lentivirale Erzeugung hypoxiesensitiver CAR-T-Zellen zur Krebsimmuntherapie. Diese Methode ermöglicht hypoxieabhängige Expression und selektive Zytotoxizität gegen Tumore für verbesserte Sicherheit.

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In dieser Studie wurde HER2-BBz-ODD, ein Hypoxie-sensitives CAR, das auf HER2 abzielt (Gen-ID: 2064), mit seinem regulären Gegenstück HER2-BBz verglichen. Die Schaltpläne der beiden CARs sind in Abbildung 1A dargestellt, die zeigt, dass HER2-BBz-ODD von HER2-BBz abgeleitet wird, indem die ODD-Sequenz an den C-Terminus von CD3ξ angehängt wird. Die Konstruktion von lentiviralen Vektoren, die die beiden CARs exprimieren, und die Erzeugung des entsprechenden Lentivirus durch 293T-Zelltransfektion wurde bereits beschrieben31.
1. Erzeugung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen durch lentivirale Infektion
<ol><li>Kryokonservierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Menschen werden schnell bei 37 °C in einem Wasserbad aufgetaut. Übertragen Sie die aufgetauten PBMCs in ein 15-ml-Röhrchen mit 9 ml serumfreiem Lymphozyten-Kulturmedium, ergänzt mit 400 IE IL-2, 5 ng/ml IL-7 und 10 ng/ml IL-15 (humanes T-Zell-Wachstumsmedium, im Folgenden als TGM bezeichnet).</li>
	<li>Nach der Entnahme eines Aliquots für die Zellzählung zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie die pelletierten PBMCs mit TGM bei einer Dichte von 4 × 106 Zellen/ml und überführen Sie die Suspension in eine 6-Well-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie anti-hCD3/hCD28-beschichtete Immunbeads vor.<ol><li>Übertragen Sie 100 μl Maus-IgG-Magnetkügelchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie 2 Mal mit einem Magnetständer mit PBS.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl PBS und fügen Sie 0,2 μg Maus-Anti-Human-CD3-Antikörper und 2 μg Maus-Anti-Human-CD28-Antikörper hinzu. Die Mischung vorsichtig mit einer Pipette mischen und über Nacht bei 4 °C wiegen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kügelchen 2 Mal mit einem Magnetständer mit PBS und suspendieren Sie sie in 100 μl PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie in Schritt 1.2 anti-hCD3/hCD28-beschichtete Immunobeads in einem Bead-to-Cell-Verhältnis von 1:1 auf die Platte. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C.</li>
	<li>Nach 48 Stunden Inkubation wird die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, nachdem die Zellen vorsichtig mit einer Pipette gemischt wurden. Stellen Sie das Röhrchen für 3 Minuten auf einen Magnetständer und übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen, um Immunbeads von den PBMCs zu entfernen.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Aliquot für die Zellzählung und säen Sie dann die PBMCs in 5 × 105 Zellen/Well in 300 μl TGM in eine flache 48-Well-Platte. Geben Sie 200 μl lentiviralen Stamm in die entsprechenden Vertiefungen und fügen Sie Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 × g bei 32 °C für 1,5 h und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig 300 μl Überstand aus jeder Vertiefung mit einer Pipette. Geben Sie dann mit einer Pipette 1 ml frisches TGM hinzu und stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C.</li>
	<li>Fügen Sie frisches TGM hinzu, um die Zelldichte alle 2-3 Tage auf 0,5-2 × 106 Zellen/ml einzustellen. Beginnen Sie damit, die Zellen zuerst auf eine 12-Well-Platte und dann auf eine 6-Well-Platte zu übertragen. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort, bis die Gesamtzahl 6 × 106 in einem Volumen von 4 ml erreicht. HINWEIS: Parallel dazu ist die CAR-Transduktion von Jurkat-T-Zellen nach den gleichen oben beschriebenen Verfahren durchzuführen, mit der Ausnahme, dass TGM durch RPMI1640 Medium ersetzt wird, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält.</li>
</ol>2. Beurteilung der sauerstoffabhängigen CAR-Expression in CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Die CAR-transduzierten T-Zellen aus Schritt 1.8 werden in zwei 12-Well-Platten mit einer Dichte von 2,5 × 106 Zellen/Well in 2 ml TGM plattiert. Legen Sie eine Platte direkt in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C (normoxischer Zustand, da der Standardzustand für die Kultivierung von Zellen 21 % O2 beträgt) und stellen Sie die andere Platte in eine mobile CO2/O2/N2 -Inkubatorkammer mit dem auf 1 % voreingestellten O2 -Gehalt (hypoxischer Zustand) und halten Sie die Kammer dann in einer befeuchteten 5 % CO2/94 % N2 -Inkubator bei 37 °C.</li>
	<li>Alle 24 Stunden werden 5 × 105 Zellen von den Platten unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 500 × g , entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren in 1 ml PBS. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche noch einmal.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 50 μl FACS-Puffer (PBS ergänzt mit 2 % FBS) in jedem Röhrchen. 50 μl einer Verdünnung von 1:100 PE-konjugierten Anti-Flag-Antikörper (0,2 μg/ml) zugeben und durch Pipettieren gründlich mischen. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie am Ende der Inkubation 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen. Durch Pipettieren gründlich mischen und dann 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie Schritt 2.4 noch einmal.</li>
	<li>Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer und überführen Sie dann die resultierende Zellsuspension in 5 ml-Durchflussröhrchen.</li>
	<li>Führen Sie in Schritt 2.6 eine Durchflusszytometrie an der Zellsuspension durch, um die Oberflächen-CAR-Expression zu bestimmen. Nicht transfizierte T-Zellen als Negativkontrolle einschließen.<ol><li>Verwenden Sie die Gatter FSC/SSC und FSC-A/FSC-H, um lebende Einzelzellen zu screenen. Sammeln Sie 1 × 104 Live-Einzelereignisse für jede Stichprobe. Gatet die Zellen, die positiv für EGFP sind (ein konstitutiver Marker, der im lentiviralen Vektor als Indikator für erfolgreich transduzierte T-Zellen verwendet wird) und dann die Zellen, die positiv für Phycoerythrin (PE) sind (CAR-exprimierende Zellen), um die PE-Positivität und die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) zu messen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse der Sauerstoffabhängigkeit der CAR-Expression in CAR-modifizierten Jurkat T-Zellen mittels Western Blot
<ol><li>Die CAR-transduzierten Jurkat T-Zellen aus Schnitt 1 werden in zwei 48-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Well (500 μl Kulturvolumen) in RPMI1640 Medium mit 10 % FBS plattiert.</li>
	<li>Für eine Platte wird CoCl2 bis zu einer Endkonzentration von 0 μM, 50 μM oder 200 μM in die Versuchsvertiefungen gegeben. Stellen Sie die Platte dann in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C (normoxischer Zustand). Für die andere Platte fügen Sie kein CoCl2 hinzu und stellen Sie sie in eine mobile CO2/O2/N 2-Inkubatorkammer mit dem auf 1 % (hypoxischer Zustand) voreingestellten O2-Niveau, bevor Sie sie in denselben Inkubator umfüllen.</li>
	<li>Nach 24 Stunden Inkubation werden die Zellsuspensionen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Röhrchen bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen und verwerfen Sie die Überstände zuerst mit einer 1-ml-Pipette, dann mit einer 100-μl-Pipette und resuspendieren Sie die Zellpellets in 50 μl 1x SDS-PAGE-Probenpuffer.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Proben in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Stellen Sie das Röhrchen sofort 30 s lang auf Eis und zentrifugieren Sie es dann 30 s lang bei 16.000 × g .</li>
	<li>Laden Sie 30 μl der freigegebenen Proben in jeden Schlitz eines 10-Well-PAGE-Gels mit 10 % SDS mit einer Dicke von 1,5 mm. Lassen Sie das Gel 30 min lang bei 80 V laufen, erhöhen Sie dann die Spannung auf 100 V und lassen Sie es 1,5 h laufen.</li>
	<li>Am Ende der Elektrophorese übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine PVDF-Membran unter Verwendung der Standard-Nasstransfermethode, wobei der Strom und die Dauer auf 400 mA bzw. 1 h eingestellt sind.</li>
	<li>Blockieren Sie die Membran in Blockierungspuffer (5 % Milch (w/v) in PBST (PBS+0,05 % Tween-20)) für 1 h bei Raumtemperatur. Schneiden Sie dann das Stück zwischen 30 kD und 40 kD für den Nachweis der GAPDH-Ladesteuerung und das Stück zwischen 50 kD und 70 k D für den Nachweis der CAR-Moleküle aus.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 30-40 kD- und 50-70 kD-Stücke mit einem Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (1:2.000 Verdünnung) bzw. einem Maus-Anti-Flag-Antikörper (1:2.000 Verdünnung) in 3 ml Blockierungspuffer entweder bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen mit PBST bei Raumtemperatur auf einer Plattformwippe für 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membranen mit HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern (1:5.000 Verdünnung) in 3 ml Blockierungspuffer bei Raumtemperatur für 1 h; Anschließend die Bahn 5 x 10 min mit PBST waschen.</li>
	<li>Entwickeln Sie die Membranen, indem Sie sie mit einem HRP-Substrat inkubieren, und visualisieren Sie dann die detektierten Proteinbanden mit einem lumineszierenden Bildanalysator.</li>
</ol>4. In-vitro-Bewertung der Sauerstoffabhängigkeit der Zytotoxizität, die durch Hypoxie-empfindliche CAR-T-Zellen vermittelt wird
<ol><li>An Tag 0 säen 1 × 104 Zielzellen (SKOV3-Luc-Zellen) pro Versuchsvertiefung in 200 μl DMEM mit 10 % FBS in zwei schwarzen 96-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden.</li>
	<li>Entfernen Sie an Tag 1 vorsichtig 100 μl des Überstands von der Oberseite jeder Vertiefung. Fügen Sie CAR-T-Zellen oder nicht transduzierte T-Zellen in einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 1:1, 2:1 und 4:1 in 100 μl DMEM-Medium mit 10 % FBS hinzu.</li>
	<li>Eine Platte wird in einer 21 % O2 -Atmosphäre und die andere in einer 1 % O2 -Atmosphäre in einer beweglichen CO2/O2/N2 -Inkubatorkammer aufgestellt, wie in Schritt 2.1 beschrieben. HINWEIS: Wenn keine mobile CO2/O 2/N2 -Inkubatorkammer verfügbar ist, kann die Zugabe von CoCl2 zum Kulturmedium verwendet werden, um einen hypoxischen Zustand nachzuahmen.</li>
	<li>Übertragen Sie an Tag 2, nach 24 Stunden Co-Kultivierung, vorsichtig den gesamten Überstand (ca. 150-200 μl) mit einer Pipette in eine neue 96-Well-Platte mit U-Boden. Für den späteren Zytokinnachweis bei -20 °C lagern, indem Sie die in Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren befolgen.</li>
	<li>Geben Sie 60 μl 1x passiven Lysepuffer in jede Versuchsvertiefung der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden aus Schritt 4.4. Legen Sie dann die Platten auf einen Schüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang, um eine effiziente Zelllyse zu gewährleisten.</li>
	<li>Geben Sie 60 μl Glühwürmchen-Luziferase-Substrat in jede Versuchsvertiefung und messen Sie die Luziferase-Aktivität sofort mit einem Mikroplatten-Reader.</li>
	<li>Berechnen Sie die normalisierte Zytotoxizität (%) mit Hilfe von Gleichung (1): Normalisierte Zytotoxizität (%) = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"> ×100 (1)</li>
</ol>5. Nachweis der IL-2- und IFN-γ-Sekretion durch Hypoxie-empfindliche CAR-T-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie an Tag 0 eine 1:250-Verdünnung des IL-2- oder IFN-γ-Capture-Antikörpers in Beschichtungspuffer vor. Geben Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISA-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Der Beschichtungspuffer wird hergestellt, indem 7,13 g NaHCO3 und 1,59 g Na2CO3 in 1 l destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 9,5 eingestellt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie an Tag 1 den unadsorbierten Capture-Antikörper, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen und dann die Wells 3x mit 200 μl Wash Buffer (PBS mit 0,05 % Tween 20) waschen.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl Assay-Verdünnungsmittel (PBS mit 10 % FBS) in jede Vertiefung und inkubieren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Lösung, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen; Waschen Sie dann die Wells 3x mit 200 μL Wash Buffer.</li>
	<li>Die gefrorenen Überstandsproben/-platten aus Schritt 4.4 werden bei Raumtemperatur aufgetaut. Sobald die Proben und Standards vollständig aufgetaut sind, verdünnen Sie sie mit Assay Diluent. Geben Sie 100 μl verdünnte Proben oder Standards in jede Vertiefung der beschichteten ELISA-Platte und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Für den IL-2-Nachweis wird eine 10-fache Verdünnung empfohlen, während für den IFN-γ-Nachweis eine 50-fache Verdünnung bevorzugt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die Proben und Standards, indem Sie die Platte kräftig auf den Kopf stellen, und waschen Sie die Wells dann 5x mit 200 μl Wash Buffer pro Well.</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Nachweislösung her, indem Sie den IL-2-Nachweisantikörper oder den IFN-γ-Nachweisantikörper/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) im Verhältnis 1:250 im Assay-Verdünnungsmittel verdünnen. Geben Sie 100 μl der Arbeitsdetektionslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 7x mit 200 μl Waschpuffer.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl Substratreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Stopplösung (1 M H2SO4) in jede Vertiefung. Lesen Sie sofort die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader ab.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Funktionelle Validierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen für selektive Tumoren

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Überstände und Zellen cellection Protokoll Schritt 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>10 ml Pipette</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipettieren Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glycin-SDS Elektrophoresepuffer</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Überstände und Zellen cellection Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 3,4</td></tr><tr><td>4x Protein SDS PAGE Loading Buffer</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T-Zellen culture Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>96-Wells schwarze Gewebekulturplatten mit flachem Boden</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Zytotoxizitätsassay Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>96-Well-ELISA-Platten</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>ELISA Protokoll Schritt 5</td></tr><tr><td>96-Well-Plattenschüttler</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>96-Well-U-Boden-Gewebekulturplatten</td><td>ThermoScientific</td><td>268200</td><td>Überstände cellection Protokoll Schritt 4,5</td></tr><tr><td>Anti-FLAG-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Carbinol</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Kohlendioxid-Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Zellzählplatte</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Zellzählung Protokoll Schritt 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Maus IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Maus IgG magnetische Kügelchen Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 1,3,4</td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Gel-Bildgebungssystem</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Kobaltchloridlösung (0,5 M)</td><td>Bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>Hypoxischer Zustand Protokoll Schritt 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>weigh Protokoll Schritt 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH Maus mAb</td><td>ABklonal</td><td>AC002</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Immunoblotting -Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>GloMax-Mikrotiterplatten-Reader</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>Luciferase-Aktivitätsmessung -Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Immunoblotting -Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Mikrogefrierzentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>Humane IFN-& gamma; ELISA Set</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA Protokoll Schritt 5 Artikel: Rekombinante humane IFN-& gamma; Lyophilisierter Standard, Nachweis Antikörper Biotin Anti-Human IFN-& gamma; , Capture Antikörper gereinigtes Anti-Human-IFN-& Gamma;, Enzymreagenz Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>Humanes IL-2 ELISA-Set</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA Protokoll Schritt 5 Artikel: Rekombinanter humaner IL-2 lyophilisierter Standard, Nachweis-Antikörper Biotin Anti-Human-IL-2, Capture Antikörper gereinigtes Anti-Human-IL-2, Enzymreagenz Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>P40933</td><td>T-Zellen culture Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45 T-Zellen</td><td>culture Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D systems</td><td>P13232</td><td>T-Zellen culture Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>Inverses</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>CKX41</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat construction Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Durchflusszytometrie Protokoll Schritt 2</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Luciferase Reporter Assay Protokoll Schritt 4 Artikel: Passiver Lysepuffer, Glühwürmchen-Luciferase-Substrat</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Protokoll Schritt 5</td></tr><tr><td>mobiles CO2/O2/N2 Inkubator Kammer</td><td>China Innovation Instrument Co., GmbH.</td><td>Smartor118</td><td>Hypoxischer Zustand Protokoll Schritt 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Maus Anti-Hexa Histidin Tag</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>NcmBlot Rapid Transfer Puffer</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Immunoblotting -Protokoll Schritt 3 Artikel: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagenz (A), NcmECL Ultra stabilisiertes Peroxid-Reagenz (B) & nbsp;</td></tr><tr><td>NovoNectin-beschichtete 48-Well-Flachplatten</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>CAR-T-Zellen Aufbau Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) Tablettensatz</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Substratreagenz Protokoll Schritt 5 Artikel: OPD-Tablette (Silberfolie), Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Tablette (Goldfolie)</td></tr><tr><td>PE-konjugiertes Anti-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Durchflusszytometrie Protokoll Schritt 2</td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Lentivirus-Infektion Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>Proteinmarker 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Gereinigte NA/LE Maus Anti-Human-CD3</td><td>BD</td><td>566685</td><td>T-Zellen Kultur Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>Aufgereinigte NA/LE Maus Anti-Human-CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>T-Zellen Kultur Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td></td><td>ATCC HTB-77</td><td>Zytotoxizitätstest Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Zellkultur Protokoll Schritt 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Immunoblotting Protokoll Schritt 3</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating Protokoll Schritt 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Serumfreies Lymphozytenkulturmedium Protokoll Schritt 1</td></tr></tbody></table>

generierung und funktionelle verifizierung von hypoxie-sensitiven chimären antigenrezeptor-t-zellen

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

Die Fusion der ODD-Domäne von HIF-1α mit der CAR-Einheit stellt eine primäre Strategie zur Erzeugung eines Hypoxie-sensitiven CAR dar. Das in dieser Studie analysierte Hypoxie-sensitive HER2-targeting-CAR mit der Bezeichnung HER2-BBz-ODD wurde unter Verwendung dieser Strategie konstruiert, indem die ODD-Sequenz in sein konventionelles HER2-BBz integriert wurde (Abbildung 1A). In dieser Studie nutzten wir die lentivirale Transduktion zur Expression von HER2-BBz-ODD CAR oder HER2-BBz CAR und untersuchten anschließend ihre Sauerstoffsensitivität in zwei Zelltypen: humane PBMCs und Jurkat T-Zellen.
Die erste Untersuchung befasst sich mit der Expression von CAR unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu normoxischen Bedingungen, die sowohl in CAR-transduzierten PBMC-abgeleiteten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie als auch in CAR-transduzierten Jurkat T-Zellen durch Western Blot durchgeführt wurde. Im Setting von CAR-transduzierten PBMC-abgeleiteten T-Zellen beobachteten wir, dass HER2-BBz-ODD CAR eine signifikant höhere Expression unter 1% O2 als unter 21% O2 aufwies, sowohl in Bezug auf den Prozentsatz der CAR-positiven Zellen als auch auf die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) (Abbildung 1B). Die Immunblotting-Analyse von CAR-transduzierten Jurkat-T-Zellen bestätigte auch die Hypoxie-abhängige Induktion von HER2-BBz-ODD.
Es ist erwähnenswert, dass in diesem Zusammenhang der hypoxische Zustand bequem nachgeahmt werden kann, indem dem Kulturmedium CoCl2, ein chemischer Induktor der Hypoxie, zugesetzt wird. Wie in Abbildung 1C dargestellt, zeigten unsere Immunblotting-Ergebnisse, dass die Exposition bei 50 oder 200 μM CoCl2 die Wirkung der Exposition bei 1 % O2 rekapitulierte, was die Expression des HER2-BBz-ODD CAR, aber nicht die des HER2-BBz CAR deutlich induzierte. Die funktionelle Charakterisierung von Hypoxie-sensitiven CAR wurde mit PBMC-abgeleiteten CAR-T-Zellen durchgeführt. In der Studie wurde eine Glühwürmchen-Luciferase-tragende SKOV-3-Zelllinie als Zielzelllinie verwendet. Dieser Aufbau ermöglichte es uns, die zielzellassoziierte Luciferase-Aktivität als Proxy für die Beurteilung der Zytotoxizität zu messen, die durch co-kultivierte CAR-T-Zellen vermittelt wird.
Wie in Abbildung 1D gezeigt, zeigten die Messungen, dass die HER2-BBz CAR-T-Zellen Zielzellen effektiv abtöten, unabhängig davon, ob die Atmosphäre normoxisch oder hypoxisch war. Im Gegensatz dazu zeigten die HER2-BBz-ODD CAR-T-Zellen unter normoxischen Bedingungen für alle drei untersuchten E:T-Verhältnisse eine signifikant schwächere Zytotoxizität. Ihre Zytotoxizität war jedoch signifikant erhöht, wenn sie hypoxischen Bedingungen ausgesetzt wurden. Die Überstandsspiegel von IL-2 und IFN-γ wurden ebenfalls per ELISA gemessen, nachdem CAR-T-Zellen 24 Stunden lang mit Zielzellen co-kultiviert wurden. Für beide Zytokine wurde eine höhere Sekretion unter 1 % O2 im Vergleich zu 21 % O2 für HER2-BBz-ODD CAR-T-Zellen beobachtet, was mit den Zytotoxizitätsdaten übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigten HER2-BBz CAR-T-Zellen eine geringere Sekretion der beiden Zytokine unter 1% O2 im Vergleich zu 21% O2, was auf einen nachteiligen Einfluss von Hypoxie auf die zelluläre Aktivität hinweist (Abbildung 1E). Zusammengenommen bestätigten diese Ergebnisse überzeugend die Hypoxie-sensitive Natur von HER2-BBz-ODD CAR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> Abbildung 1: Aufbau und Charakterisierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Designs eines Hypoxie-sensitiven CAR, HER2-BBz-ODD, und seines konventionellen Gegenstücks, HER2-BBz. Beide CARs bestehen aus einem N-terminalen CD8α-Signalpeptid, einem FLAG-Tag, einem humanen HER2-gerichteten scFv, einer CD8-Scharnier- und Transmembrandomäne sowie einem intrazellulären Teil, der aus einer kostimulatorischen Domäne von 4-1BB, einer CD3ξ-Signaldomäne, einem IRES und einem EGFP besteht. HER2-BBz-ODD unterscheidet sich von HER2-BBz durch die Fusion einer ODD-Domäne mit dem C-Terminus der CD3ξ-Signaldomäne, was seine hypoxische Expression ermöglicht, indem es seinen Ubiquitin-abhängigen Abbau unter normoxischen Bedingungen fördert. (B,C) Untersuchungen der sauerstoffabhängigen Expression von HER2-BBz-ODD CAR. (B) Eine Bewertung wurde mit humanen PBMC-abgeleiteten CAR-T-Zellen durchgeführt, nachdem sie 24, 48 oder 72 Stunden lang unter 1 % oder 21 %O2 mittels Durchflusszytometrie kultiviert worden waren. (C) Die andere Bewertung bezog sich auf CAR-transduzierte Jurkat-T-Zellen, bei denen Zelllysate 24 Stunden nach Kultivierung unter 21 %O2, 50 oder 200 μM CoCl2 oder 1 %O2 geerntet und mittels Western Blotting auf CAR-Expression analysiert wurden, wobei HER2-BBz CAR-transduzierte Zellen als Kontrolle einbezogen wurden. (D,E) In vitro Zytotoxizität und Zytokinsekretion von CAR-T-Zellen unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen. (D) CAR-T-Zellen wurden mit Glühwürmchen-Luziferase-exprimierenden SKOV3-Zellen bei indizierten E:T-Verhältnissen unter 1 % bzw. 21 %O2 co-kultiviert. Nach 24 Stunden Co-Kultivierung wurde die Tötungseffizienz der Zielzellen bestimmt, indem die Veränderung der zellassoziierten Glühwürmchen-Luziferase-Aktivität im Vergleich zu nicht transduzierten T-Zellen gemessen wurde. (E) Die Überstände wurden für den Nachweis von sezerniertem IL-2 und IFN-γ gesammelt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (n = 3 gesunde Spender) (****p &lt; 0,0001) dargestellt. Abkürzungen: scFv = einkettige Fragmentvariable; CAR = chimärer Antigenrezeptor. Die Panels C und D sind von Liao et al.31 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Transduktion primärer menschlicher T-Zellen mit einem Gen von Interesse, um die Kompatibilität mit den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sicherzustellen.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Erfahren Sie die lentivirale Erzeugung hypoxiesensitiver CAR-T-Zellen zur Krebsimmuntherapie. Diese Methode ermöglicht hypoxieabhängige Expression und selektive Zytotoxizität gegen Tumore für verbesserte Sicherheit.

Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

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