Name: Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Elektroporation und Denervierung des Levator Auris Longus bei Mäusen zur Untersuchung neuromuskulärer Synapsenregeneration. Diese Methode ermöglicht die Analyse muskelbirtiger Proteine und postsynaptischer Rezeptororganisation.

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<meta charset="utf8"></head><body>Elektroporation und Nervenverletzung im Levator Auris longus-Muskel der Maus

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 Dumont Pinzette&nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>anti 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Verdünnung 1 : 300</td></tr><tr><td>anti S100 Gebrauchsfertig</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Verdünnung 1 : 5</td></tr><tr><td>anti SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Verdünnung 1 : 50</td></tr><tr><td>Chlorhexidingluconat 2%</td><td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaltlicht-Präparier-Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>Modell SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Verdünnt 1 : 100</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzetten</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Dumont Mini Pinzette &ndash; Stil 5</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>11200-14</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>ECM 830 Elektroporator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Nadelelektroden&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td><td>10 mm gerade</td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>Inhalationsanästhesiegerät</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 Table Top</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>Instituto de Salud Publica - Chile</td><td></td><td>Erwachsene (3-6 Monate alt) CF-1 Mäuse beiderlei Geschlechts (30-45 g)</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naht Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Resorbierbarer Polyglykolsäurefaden</td></tr><tr><td>tdTomato-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>tdTomato-Plasmid unter der Kontrolle des CMV-Promotors</td></tr><tr><td>Tramadolhydrochlorid 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Verdünnen</td></tr><tr><td>&alpha;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Verdünnung 1 : 500</td></tr></tbody></table>

kombinierte in vivo elektroporation und kurzfristige reinnervation des kranialen levator auris longus skelettmuskel

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

Die hohe Fluoreszenzquantenausbeute des tdTomato-Proteins20 macht es zu einem geeigneten Tracer für die Effizienz der Elektroporation. Daher wurde die Expression des tdTomato-Proteins in LAL-Muskeln durch in vivo Elektroporation untersucht (Abbildung 1). Die LAL-Muskeln wurden 21 Tage nach der Elektroporation präpariert. Ganzpräparationen zeigen das dünne kaudale Band (cLAL, cyanfarbenes Polygon) des LAL-Muskels mit seinen zwei Innervationsregionen und das dicke rostrale Band (rLAL, gelbes Polygon) mit seinen fünf Innervationsregionen 8,10 (Abbildung 1B). Abhängig von der Stelle der DNA-Injektion und der Positionierung der Elektroden war ein hoher Anteil an Muskelfasern, insbesondere aus dem rLAL-Teil, positiv für die Expression von tdTomato (Abbildung 1B). Transversale Kryoschnitte wurden wiebeschrieben 16 durchgeführt, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu bewerten (Abbildung 1C). Die Quantifizierung zeigt 66,70 % ± 5,95 % der positiven Fasern für die tdTomato-Expression (Abbildung 1D). Um die Schädigung der Muskelfasern zu bewerten, wurde dann die Muskelmembran mit WGA und die Zellkerne mit DAPI markiert (Abbildung 1C), um das Vorhandensein von zentralen Kernen (Pfeilspitzen) als Zeichen für Schädigungs-/Regenerationszyklen zu identifizieren. Es wurden keine signifikanten Unterschiede im prozentualen Anteil der Fasern mit zentralen Kernen zwischen Kontroll- und elektroporierten LAL-Muskeln gefunden (Abbildung 1E).
Die Quetschung des hinteren aurikulären Astes des Nervus facialis denerviert den LAL-Muskel6 (Abbildung 2A). LAL-Muskeln von Kontrollmäusen und von Mäusen 5 Tage, 10 Tage und 60 Tage nach der Nervenverletzung wurden mit den zuvor beschriebenen Methoden präpariert, fixiert und gefärbt16,21. Kurz gesagt, der SV2-Antikörper markiert synaptische Vesikel und wird zusammen mit dem 2H3-Antikörper gegen Neurofilamente verwendet, um die gesamte präsynaptische Domäne 6,16,22,23,24 freizulegen. Der S100B-Antikörper wurde zur Färbung von Schwann-Zellen verwendet, während α-BTX postsynaptische AChRs detektierte. Die konfokale Mikroskopie zeigte eine vollständige NMJ-Denervierung 5 Tage nach der Nervenverletzung (Abbildung 2B). Postsynaptische Domänen scheinen 10 Tage nach der Nervenverletzung wieder innerviert zu sein (Abbildung 2B). Nach 60 Tagen (Abbildung 2B) zeigten die regenerierten NMJs einen ähnlichen Phänotyp wie die Kontrolle.
Schließlich wurde die kombinierte Anwendung von in vivo Elektroporation und Gesichtsnervenquetschprotokollen getestet. Zu diesem Zweck wurden LAL-Muskeln mit einem Vektor elektroporiert, der das tdTomato-Protein exprimiert, und 3 Tage später wurde eine Nervenverletzung durchgeführt. Nach 9 Tagen wurde der LAL-Muskel präpariert, fixiert und gefärbt, um die prä- und postsynaptischen NMJ-Domänen freizulegen (Abbildung 3A). Die Expression des tdTomato-Proteins in Muskelfasern kann zusammen mit denervierten (grüne Pfeilspitze) und reinnervierten NMJs (gelbe Pfeile) beobachtet werden (Abbildung 3B). Die Quantifizierung ergab, dass 58,37 % ± 4,63 % der Fasern positiv für die Expression von tdTomato sind (Abbildung 3C, linker Balken), während 47,00 % ± 10,69 % der postsynaptischen Domänen reinnerviert sind (Abbildung 3C, rechter Balken).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> Abbildung 1: Effizienter in vivo Elektroporations-vermittelter Gentransfer von LAL-Muskeln. Ein Plasmid, das für das tdTomato-Protein kodiert, wurde in LAL-Muskeln durch in vivo Elektroporation von adulten Mäusen exprimiert. Die DNA-Lösung wurde unter die rLAL-Muskelfaszie injiziert, und Goldnadelelektroden wurden über dem Muskel positioniert, um fünf Impulse von 100 V/cm2 mit einer Dauer von 20 ms bei 1 Hz (A) abzugeben. Die gesamten montierten Muskeln wurden 21 Tage nach der Elektroporation präpariert und mit α-BTX (weiß) auf AChR gefärbt. Elektroporierte Fasern, die tdTomato (rot) exprimieren, wurden im rLAL-Muskel (B) beobachtet. Der rLAL-Muskel wurde querschnitten und mit WGA (gelb) und DAPI (cyan) (C) gefärbt, um die Muskelmembran bzw. die Muskelkerne zu detektieren. Die Effizienz des Verfahrens wurde als Prozentsatz der tdTomato-exprimierenden Fasern (rot in C) an den Gesamtfasern mittels WGA-Färbung (D) quantifiziert. Der Anteil der zentralen Kerne (Pfeilspitzen) wurde als Parameter der Muskelfaserschädigung/-regeneration quantifiziert (E). Die Statistik stellt den Mittelwert ± SEM von N dar: drei Tiere pro Gruppe (kontrolliert und elektroporiert). Maßstabsleiste = 1 mm (B), 50 μm (C). ns = nicht signifikant; t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> Abbildung 2: Kurzfristige NMJ-Regeneration unter Verwendung eines Nerv-Crush-Verletzungsprotokolls. Bei einer spezifischen Verletzung der Nervenquetschung kann der hintere Ohrast des Nervus facialis (Cyan) effizient freigelegt werden, indem einige anatomische Indikatoren identifiziert werden: die Vena auricularis posterior, der Bauch des Musculus digastricus und der knorpelige Gehörgang (A). Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder von LAL-Muskel-NMJs, die 5 Tage, 10 Tage und 60 Tage nach dem Nervencrush von adulten Mäusen entnommen oder präpariert wurden. NMJs wurden durch Markierung von motorischen Axonen und Terminals (SV2 für synaptische Vesikel plus 2H3 für Neurofilamente; cyan), Schwann-Zellen (anti-S100 B; gelb) und AChRs (α-BTX; magenta) identifiziert (B). Die unteren Felder zeigen die motorischen Axone (linke Felder) und die AChR-Kanäle (rechte Felder) getrennt an. Graue Formen wurden gezeichnet, um die Position der postsynaptischen Domänen abzugrenzen und den Innervationsstatus zu beurteilen. Maßstabsleisten = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> Abbildung 3: Kombinierte in vivo Elektroporations- und Nervenquetschungsverletzungsprotokolle. Der LAL-Muskel wurde mit einem Plasmid elektroporiert, das für das tdTomato-Protein (rot) kodiert. Der hintere Ohrast des Nervus facialis wurde 3 Tage nach der Elektroporation gequetscht. Nach 9 Tagen wurde der LAL-Muskel präpräpariert (A), und prä- und postsynaptische Komponenten wurden durch Markierung von motorischen Axonen und Enden (SV2 plus 2H3-Antikörper, cyan) und AChRs (α-BTX; magenta) (B) identifiziert. Angedeutet sind ein denerviertes (grüne Pfeilspitze) und ein reinnerviertes NMJ (gelber Pfeil). Quantifizierung des Anteils der Fasern, die positiv für die Expression des tdTomato-Proteins sind (linker Balken), und des Anteils der postsynaptischen Domänen, die von einem regenerierten motorischen Axon kontaktiert werden (rechter Balken) (C). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM von N dar: 3 Mäuse pro Gruppe. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die...

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Craniofacial Knorpel entwickeln in engem Kontakt mit anderen Geweben und sind schwer zu lebenden Tieren zu manipulieren. Wir sind mit Elektroporation, um molekulare Werkzeuge während des Wachstums des kraniofazialen Skeletts liefern unter Umgehung der frühen Embryonalentwicklung Effekte. Dieser Ansatz erlaubt es uns, effizient Testkandidat...

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum der primären Riechzellen zu ermöglichen. Diese spezielle Eigenschaft kann für die zelluläre Transplantation verwendet werden. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf der Verwendung von OECs in einer Kehlkopfnervenschädigung-Modell.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Die Verwendung des Nervus masseterus als Spendernerv stellt eine einstufige Alternative zum zweistufigen Standardverfahren der Transplantation des Nervus crossfacial und des freien Muskeltransfers bei Gesichtslähmung dar. Wir geben eine detaillierte Beschreibung, um diese Technik mit einem Gracilis-Muskeltransfer sicher durchzuführen und besprechen Indikationen und Einschränkungen.

Einstufige Dynamische Reanimation des Lächelns in Irreversible Fazialisparese von Free Funktionsmuskelüber

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen verwendet die Maus Levator Auris Longus (LAL) Muskeln, um spontan aufnehmen und Nerv-evozierten postsynaptischen Potenziale (Strom-Klemme) und Ströme (Voltage-Clamp) an der neuromuskulären Synapse. Diese Technik können wichtige Einblicke in die Mechanismen der synaptischen Übertragung unter normalen und Krankheit darstellen.

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

Tiermodelle der Cochlea-Implantate können Kenntnisse über die technologischen Grundlagen für die Behandlung von permanenten Schallempfindungs-Schwerhörigkeit mit elektrischer Stimulation voraus. Diese Studie bietet eine chirurgische Protokoll für akute ohrenbetäubend und Cochlea-Implantation von Elektroden-Array in Mäusen als auch die funktionale Bewertung mit auditory Brainstem Response.

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Ansatz zur Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell, einschließlich Beschreibungen verschiedener induzierbarer Verletzungsmuster.

Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung eines implantierbaren Systems zur in vivo-chronologischen Aufzeichnung evozierter und spontaner elektromyographischer Potentiale vorgestellt. Das System wird auf die Untersuchung der Reinnervation der Kehlkopfmuskulatur nach Einer Nervenverletzung angewendet.

Ein implantierbares System für die chronische In-Vivo-Elektromyographie

Verletzungen des volumetrischen Muskelverlusts (VML) übersteigen die endogene Regenerationsfähigkeit, was zu dauerhaften funktionellen Defiziten führt. Die aktuelle VML-Forschung konzentriert sich vor allem auf die Gliedmaßen- und Rumpfmuskulatur. Um mechanistische Studien von VML auf kraniofaziale Muskeln auszudehnen, wird in diesem Artikel eine in vivo Methode zur longitudinalen Beurteilung der Funktion der Kaumuskulatur vor und nach einer VML-Verletzung beschrieben.

In vivo Funktionsbeurteilung des Kaumuskels von Ratten nach chirurgischer Entstehung einer Verletzung durch volumetrischen Muskelverlust (VML)

Erfahren Sie die In-vivo-Elektroporation und Denervierung des Levator Auris Longus bei Mäusen zur Untersuchung neuromuskulärer Synapsenregeneration. Diese Methode ermöglicht die Analyse muskelbirtiger Proteine und postsynaptischer Rezeptororganisation.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

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