Name: In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Lernen Sie die in vitro-Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen bei der Maus. Diese Methode erreicht 90% Reinheit und nutzt Durchflusszytometrie zur Analyse.

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<meta charset="utf8"></head><body>Th17-Zelldifferenzierung aus naiven CD4+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

<ol><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Bhaumik, S., Basu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+dynamics+of+Th17+differentiation+and+its+developmental+plasticity+in+the+intestinal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response.</a> Front Immunol. 8, 254(2017).</li>
<li>Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+effector+functions+of+T%28H%2917+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction and effector functions of T(H)17 cells.</a> Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).</li>
<li>Korn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+initiates+an+alternative+pathway+to+induce+proinflammatory+T%28H%2917+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells.</a> Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).</li>
<li>Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).</li>
<li>Yang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+17+lineage+differentiation+is+programmed+by+orphan+nuclear+receptors+ROR+alpha+and+ROR+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma.</a> Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>McGeachy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin+23+receptor+is+essential+for+the+terminal+differentiation+of+interleukin+17-producing+effector+T+helper+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo.</a> Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2+superfamily+cytokine+Activin-A+is+induced+during+autoimmune+neuroinflammation+and+drives+pathogenic+Th17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation.</a> Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).</li>
<li>Ramesh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+human+Th17+cells+selectively+express+P-glycoprotein+and+are+refractory+to+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids.</a> J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).</li>
<li>Basdeo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-Th17+%28nonclassical+Th1%29+cells+are+functionally+distinct+from+classical+Th1+and+Th17+cells+and+are+not+constrained+by+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells.</a> J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).</li>
<li>Cua, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-23+receptor+gfp+reporter+mice+reveal+distinct+populations+of+IL-17-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells.</a> J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).</li>
<li>Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1%2C+Th17%2C+and+Th9+effector+cells+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+different+pathological+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes.</a> J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).</li>
<li>Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+targets+and+triggers+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unexpected targets and triggers of autoimmunity.</a> J Clin Immunol. 34, Suppl 1 (0 1) S56-S60 (2014).</li>
<li>Chang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+non-coding+aequences+CNS6+and+CNS9+control+cytokine-induced+Rorc+transcription+during+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).</li>
<li>Bunte, K., Beikler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+and+the+IL-23%2FIL-17+axis+in+the+pathogenesis+of+periodontitis+and+immune-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3394(2019).</li>
<li>Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+of+Th17+differentiation+and+the+Yin-Yang+of+Th17+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases.</a> Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).</li>
<li>Berghmans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+orchestrates+the+number+and+function+of+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).</li>
<li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+Th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Du, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone+releasing+hormone+signaling+promotes+Th17+cell+differentiation+and+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation.</a> Nat Commun. 14 (1), 3298(2023).</li>
<li>Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-associated+increase+in+IFN-gamma+synthesis+by+mouse+CD8%2B+T+cells+correlates+with+shifts+in+the+frequencies+of+cell+subsets+defined+by+membrane+CD44%2C+CD45RB%2C+3G11%2C+and+MEL-14+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression.</a> J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+an+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>El-Hindi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-specific+CerS4+depletion+prolonged+inflammation+and+enhanced+tumor+burden+in+the+AOM%2FDSS-induced+CAC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model.</a> Int J Mol Sci. 23 (3), 1866(2022).</li>
<li>Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+resistance+to+regulation+by+IL-4+during+Th17+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation.</a> J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+interleukin-2-based+fusion+molecule%2C+HCW9302%2C+differentially+promotes+regulatory+T+cell+expansion+to+treat+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice.</a> Front Immunol. 14, 1114802(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD62L, BV650, Klon MEL-14, 1:200 Verdünnung</td><td>BD</td><td>Cat# 564108; RRID: AB_2738597</td><td></td></tr><tr><td>monoklonales Anti-CD4 der Ratte, FITC, Klon RM4-5, 1:200 Verdünnung</td><td>BioLegend</td><td>Cat#100509; RRID: AB_312712</td><td></td></tr><tr><td>monoklonales Ratten-Anti-IL-17A, PE, Klon TC11-18H10.1, 1:200 Verdünnung</td><td>BioLegend</td><td>Cat#506903; RRID: AB_ 315463</td><td></td></tr><tr><td>monoklonales Anti-Maus-/Human-CD44, APC, Klon IM&, 1:200 Verdünnung</td><td>BioLegend</td><td>Cat#103012; RRID: AB_312963</td><td></td></tr><tr><td>monoklonales Anti-ROR der Ratte & Gamma T, APC, Klon B2D, 1:200 Verdünnung</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#17-6981-80; RRID: monoklonaler</td> FOXP3-Antikörper AB_2573253 <td></td></tr><tr><td>Ratte, PE, Klon FJK-16s, 1:200 Verdünnung</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3 SAFIRE</td><td>gereinigte Biogems</td><td>Cat#05112-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD28 SAFIRE gereinigte</td><td>Biogems</td><td>Cat#10312-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IFN Gamma</td><td>Biogems</td><td>Cat#80822-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IL-4</td><td>biogems</td><td>Cat#81112-25</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Xilong scientific</td><td>Cat#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung</td><td>gibco</td><td>Cat#35050079</td><td></td></tr><tr><td>Maus rIL-1 beta</td><td>Sino Biological</td><td>Cat#50101-MNAE</td><td></td></tr><tr><td>Maus rIL-6</td><td>Sino Biological</td><td>Cat#50136-MNAE</td><td></td></tr><tr><td>Maus rIL-23</td><td>Sino Biological Cat</td><td>#CT028-M08H</td><td></td></tr><tr><td>Maus TGF beta 1</td><td>Sino Biological Cat</td><td>#50698-M08H</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Procell</td><td>Cat#PB180327</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-2</td><td>Peprotech</td><td>Cat#212-12</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>Cat#11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Critical commercial assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Organ Lymphocyte Separation Solution Kit</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#TBD0018SOP</td><td>Enthält Flüssigkeit zur Trennung von Lymphozyten aus tierischem Milzgewebe, Verdünnungsmittel für Gewebeproben (Kat.-Nr. 2010C1119), Probenreinigungslösung (Kat.-Nr. 2010X1118), Probenwaschlösung (Kat.-Nr. TBTDM-W), Gewebehomogenat-Spülflüssigkeit (F2013TBD)</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX vorgemischt)</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td>https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.</td></tr><tr><td>Fixierung/Permeabilisierung Konzentrat</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixierung / Permeabilisierung Verdünnungsmittel</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff EF506</td><td>invitrogen</td><td>Cat#65-0866</td><td></td></tr><tr><td>HiScript II Q RT SuperMix für qPCR (+gDNA-Wischer)</td><td>Vazyme</td><td>Cat#R223-01</td><td>https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.</td></tr><tr><td>Leukozyten-Aktivierungscocktail</td><td>BD</td><td>Katze#550583</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-17A (Interleukin 17A) ELISA Kit</td><td>Elabscience&reg;</td><td>Cat#E-EL-M0047</td><td></td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ T-Zell-Isolationskit, Maus</td><td>STEMCELL</td><td>Cat#19765</td><td>EasySep Kit enthält einen CD4+ T-Zell-Isolationscocktail für Mäuse [Kat.-Nr. 19852C.1], einen T-Zell-Depletionscocktail für Mäuse [Kat.-Nr. 18766C], Streptavidin RapidSphered 50001 [Kat.-Nr. 50001], normales Rattenserum [Kat.-Nr. 13551]); Lagern Sie Rattenserum nur bei -20 °C; C; andere Komponenten, die bei 2-8 °C gelagert werden sollen.</td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>SPARKeasy Cell RNA Kit</td><td>Sparkjade</td><td>Cat#AC0205-B</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus: C57BL/6</td><td>Gempharmatech</td><td>Cat#000013</td><td></td></tr><tr><td> Oligonukleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Il17a TaqMan Primer mit Sonde</td><td>ribobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maus Il17f TaqMan Primer mit Sonde</td><td>ribobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maus Il23r TaqMan Primer mit Sonde</td><td>ribobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maus Rora TaqMan Primer mit Sonde</td><td>ribobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin TaqMan Primer mit</td><td>Sonde ribobio</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software und Algorithmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora</td><td>Cytek</td><td>https://spectrum.cytekbio.com/</td><td></td></tr> <tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Tree Star</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad prism 9</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Kindly</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>Cat#MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Rundbodenröhrchen</td><td>Corning</td><td>Cat#352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>NEST</td><td>Cat#601052</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Gewebekulturplatte (abgeflachter Boden)</td><td>Corning</td><td>Cat#3548</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>NEST</td><td>Cat#602052</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Zellsieb</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>96-well Unskirted qPCR Platten</td><td>VIOX scientific</td><td>Cat#V4801-M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Corning</td><td>Cat#430167</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur CO2-Inkubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>HEPA Class100</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora</td><td>Cytek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>RWD</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>AlphaCell</td><td>Cat#J633201</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR System</td><td>Roche</td><td>LightCycler96</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Pinzette</td><td>RWD</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differenzierung von naiven cd4+ t-zellen in pathogene th17-zellen in der maus

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

Unser Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Forschungen über die Differenzierung pathogener Th17-Zellen entwickelt. Der erste Schritt des Experiments besteht darin, die Reinheit von naiven CD4+ T-Zellen, die aus der Milz isoliert wurden, durch magnetische Kügelchensortierung zu detektieren, was die Grundlage für den Erfolg unserer anschließenden pathogenen Th17-Zelldifferenzierung ist. Die Reinheit naiver CD4+ T-Zellen wurde mit Hilfe der Oberflächenmarker CD62L23 und CD4424 nachgewiesen, während FOXP325 als Marker für Treg-Zellen verwendet wurde. Wir fanden heraus, dass der Gehalt an Treg-Zellen nach der Sortierung signifikant reduziert war und die Reinheit naiver CD4+ T-Zellen mindestens 95% erreichen konnte (Abbildung 1). Um die Differenzierung pathogener Th17-Zellen zu vergleichen, wurden naive CD4+ T-Zellen mit Th0-Medium (Tabelle 1) und Th17-Differenzierungsmedium (Tabelle 1) für insgesamt 5 Tage kultiviert. Es zeigte sich, dass T-Zellen sowohl in Th0- als auch in Th17-Medien Clusterwachstum zeigten (Abbildung 2).
Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern gegen mehrere Zytokine in differenzierten CD4+ T-Zellen auf Basis der Durchflusszytometrie markiert. Wir untersuchten IL17A26 und RORγT27 als charakteristische Zytokine der Th17-Zelldifferenzierung und fanden heraus, dass 90% der naiven CD4+ T-Zellen unter der Stimulation mit neuem Th17-Zellkulturmedium erfolgreich zu pathogenen Th17-Zellen differenzierten (Abbildung 3). Abbildung 5 zeigt die Signaturgene von Th17-Zellen, die mittels PCR nachgewiesen wurden, was beweist, dass die pathogenen Th17-Zellen, die wir durch Differenzierung erhalten haben, stabil exprimieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig01.jpg"> Abbildung 1: Gating-Strategie zur Analyse von Signaturzytokinen in C57BL/6J-Mäusen vor und nach naiver CD4+ T-Zellisolierung. Abkürzungen: FSC-H = forward scatter-peak height; SSC-H = seitliche Streu-Peah-Höhe; FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Bilder von naiven CD4+ T-Zellen der Maus, die 5 Tage lang unter pathogenen Th17- und Th0-Bedingungen kultiviert wurden. (A) Th0-Zellen; (B) pathogene Th17-Zellen. Maßstabsleisten = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig03.jpg"> Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analyse nach Differenzierung, die durch Th0-Zellkulturmedium und Th17-Zellkulturmedium induziert wurde. Abkürzungen: FSC-H = forward scatter-peak height; SSC-H = seitliche Streu-Peah-Höhe; FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig04.jpg"> Abbildung 4: Der Gehalt an IL-17A im Überstand von Th0-Zellkulturmedium und Th17-Zellkulturmedium nach Induktion der Differenzierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Expressionsniveaus von Signaturzytokinen in differenzierten CD4+ T-Zellen von C57BL/6J-Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td colspan="3">Zielpathogenes Th17-Zellkulturmedium</td>
			<td colspan="3">Th0-Zellkulturmedium</td>
			<td colspan="3">Klassisches nicht-pathogenes Th17-Zellkulturmedium</td>
			<td colspan="3">Klassisch pathogenes Th17-Zellkulturmedium.</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Reagenz</td>
			<td colspan="2">Endkonzentration</td>
			<td>Menge</td>
			<td colspan="2">Endkonzentration</td>
			<td>Menge</td>
			<td colspan="2">Endkonzentration</td>
			<td>Menge</td>
			<td colspan="2">Endkonzentration</td>
			<td>Menge</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Fötales Rinderserum</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 mL</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 mL</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 mL</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">β-Mercaptoethanol</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">GlutaMAXTM Nahrungsergänzungsmittel (100x)</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Natriumpyruvat-Lösung (100x)</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Anti-Maus-IFN-Gamma (1 mg/ml)</td>
			<td colspan="2">5 μg/ml</td>
			<td>250 μL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">10 μg/ml</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">10 μg/ml</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Anti-Maus IL-4 (2 mg/ml)</td>
			<td colspan="2">5 μg/ml</td>
			<td>125 μL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">5 μg/ml</td>
			<td>250 μL</td>
			<td colspan="2">10 μg/ml</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maus rIL-1 beta (20 μg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maus rIL-6 (20 μg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">50 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2">50 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maus rIL-23 (50 μg)</td>
			<td colspan="2">50 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">10 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maus TGF beta (100 μg)</td>
			<td colspan="2">3 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2">1 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maus IL-2 (5 μg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">RPMI 1640</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>Bis 50 mL</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>Bis 50 mL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>Bis 50 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Gesamt</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>50 mL</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>50 mL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zielpathogene Th17-Zellkultur, Th0-Zellkultur, klassische nicht-pathogene und pathogene Th17-Zellkulturmedien.

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

in-vitro-differentiation-naive-cd4-t-cells-into-pathogenic-th17-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des...

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen...

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Embryonale Stammzellen der Maus können in vitro mit dem OP9-DL1 Co-Kultursystem zu T-Zellen differenziert werden. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert eine sorgfältige Beachtung der Reagenzien-/Zellpflege und der wichtigsten technikabhängigen Schritte. Hier diskutieren wir diese kritischen Parameter und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Einführung dieser Technologie zu fördern.

Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Lernen Sie die in vitro-Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen bei der Maus. Diese Methode erreicht 90% Reinheit und nutzt Durchflusszytometrie zur Analyse.

In vitro Differenzierung von naiven CD4⁺ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

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