Name: Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Lernen Sie die Transfektionsmethode für Naegleria gruberi Trophozoiten zur Untersuchung von CERE-Replikation und DNA-Maschinerie. Dieses Protokoll ermöglicht stabile Transfektion über mehrere Passagen hinweg.

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Diese Studien wurden teilweise durch ein Stipendium des George F. Haddix Fund der Creighton University (KMD) finanziert. Abbildung 1 wird in biorender.com generiert, und Abbildung 3 wird in benchling.com generiert.

Die Einzelheiten zu den Spezies, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Sequenz des pGRUB-Konstrukts mit 17.004 Basenpaaren ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.
1. Trophozoiten züchten
<ol><li>Gefrorene Trophozoiten von N. gruberi bei 37 °C 3 Min. auftauen.</li>
	<li>Trophozoiten werden in T25-Kolben in modifiziertem Pepton/Hefeextrakt/Nukleinsäure/Folsäure/Hämin mit 10 % fötalem Kälberserum (PYNFH)-Medium plus 2 % Puffer (Dinatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat) inokuliert.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Trophozoiten bei 25 °C bis ~80% konfluent, wo sie eine amöboide Morphologie aufweisen (Abbildung 2A). HINWEIS: Bei der anfänglichen Wiederbelebung einer Kultur von Trophozoiten aus ihrem gefrorenen Zustand kann es bis zu 5-7 Tage dauern, bis ein T25 konfluent wird. Dekantieren Sie die Medien alle 3-4 Tage und ersetzen Sie sie durch frische Medien.</li>
	<li>Legen Sie die konfluenten Kolben für 5-10 min auf Eis, um die anhaftenden Trophozoiten aus dem Kunststoff zu lösen. Den Kolben vorsichtig schwenken, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu entfernen. Die Trophozoiten haben nun eine "aufgerundete" Morphologie (Abbildung 2B).</li>
	<li>Teilen Sie die Kulturen 1:2 bis 1:4 in neue Gewebekulturflaschen auf.</li>
	<li>Entfernen Sie das PYNFH und ersetzen Sie es durch sterile Zystenmedien (120 mM Natriumchlorid, 0,03 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dinatriumphosphat, 1 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 0,03 mM Calciumchlorid, 0,02 mM Eisenchlorid, pH 6,8)22 , um das N. gruberi zu enzysten. HINWEIS: Die Mehrzahl der Trophozoiten wird nach 72 h enzystiert (Abbildung 2C). Die Exzystierung sollte innerhalb von 72 Stunden abgeschlossen sein.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zysten aus den Kolben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 20 °C bei 600 x g und resuspendieren Sie die Zysten in PYNFH-Medien mit 10 % fötalem Kälberserum, um die Zellen zu exzysten. Bei 25 °C 24 h inkubieren, bis die Trophozoiten zu schlüpfen beginnen.</li>
</ol>2. Transfizierende Trophozoiten
<ol><li>Die Trophozoiten werden in eine 6-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden (1 ml von 1 x 106 Trophozoiten/ml) überführt und bei 25 °C kultiviert.</li>
	<li>Transfizieren Sie die Zellen, wenn sie 70 %-80 % konfluent erreichen (~10,4 x 104 Zellen/cm2 in 6-Well-Clustern). Erwärmen Sie das Transfektionsreagenz vor Gebrauch auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch wie folgt vor: 75 ng Plasmid-DNA und 0,225 μl des Transfektionsreagenzes in 200 μl PYNFH-Medien ohne FBS. Bereiten Sie eine ausreichende Plasmid-Transfektions-Reagenzmischung vor, um die Transfektion in doppelter Ausführung durchzuführen. HINWEIS: In dieser Studie wurde ein bakterielles Plasmid verwendet, das einen Klon von N. gruberi CERE (pGRUB) in voller Länge enthält. Als Negativkontrolle wurde ein leeres Plasmid (pGEM) verwendet (Abbildung 3).</li>
	<li>Das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.</li>
	<li>Entfernen Sie ~800 μL Medium aus den Trophozoiten-Monoschichten kurz vor der Transfektion.</li>
	<li>Geben Sie das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch auf die Trophozoiten.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platte alle 15 Minuten vorsichtig, um zu verhindern, dass sich das Medium an den Rändern der Platte ansammelt.</li>
	<li>Waschen Sie die Monolayer einmal mit 2 mL Wachstumsmedium nach 1 h Inkubation bei 25 °C.</li>
	<li>Behandeln Sie die Monolayer mit 10 U DNase in 1 mL 10x DNase Puffer für 15 min bei 37 °C, um restliche Plasmid-DNA zu entfernen, waschen Sie sie einmal mit Wachstumsmedium, fügen Sie 2 mL frisches Medium hinzu und stellen Sie sie bei 25 °C. Inkubieren Sie die Platte 24-36 Stunden lang.</li>
	<li>Lege die Platte für 10 Minuten auf Eis, um die Zellen freizusetzen.</li>
	<li>Teilen Sie eine Vertiefung (1:2) in zwei neue Vertiefungen auf.</li>
	<li>Sammle Trophozoiten aus den verbleibenden Vertiefungen zu Versuchszwecken. HINWEIS: Alle Kulturen werden doppelt ausgeführt. Für jede Bedingung wird 1 Vertiefung für den Durchgang und 1 für die CERE-Isolierung verwendet.</li>
</ol>3. Isolierung von CERE und Naegleria
<ol><li>Berechnen Sie die Anzahl der Trophozoiten in jeder Vertiefung, die für die CERE-Isolierung verwendet wird, durch Trypanblau-Ausschlussfärbung und ein Hämozytometer23.</li>
	<li>Legen Sie die Trophozoiten in ein 2,0-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie die Trophozoiten einmal in 100 mM Natriumchlorid (pH 7,5) durch Zentrifugation (600 x g, 10 min, 4 °C). HINWEIS: Natriumchlorid verhindert, dass die Trophozoiten an den Seiten des Röhrchens haften bleiben.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 100 μl 100 mM EDTA (pH 7,5).</li>
	<li>Legen Sie das Röhrchen für 15 min bei 98 °C in einen Wärmeblock, um die Zellen zu lysieren und die Enzyme in den Trophozoiten zu inaktivieren. HINWEIS: Dieser Schritt inaktiviert DNasen, die in Naegleria trophozoites reichlich vorhanden sind. DNasen können die Fähigkeit beeinträchtigen, natives CERE und den molekularen Klon in Schritt 4 nachzuweisen. Die DNA-Ausbeute wird verringert, wenn in Schritt 3.4 mehr als ~3 x 106 Zellen verwendet werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Höchstgeschwindigkeit (16.000 x g) bei 4 °C für 10 Minuten, um den Schmutz zu pelletieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Überstände in ein neues Röhrchen.</li>
	<li>Ethanol fällt die Überstände mit 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat (pH 7,5), 3 Volumen absolutem Ethanol und 1 μl 10 mg/ml Glykogen als Träger aus.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr mehrmals um und stellen Sie es mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 °C auf.</li>
	<li>Erwärmen Sie die Proben auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 min bei 16.000 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70%igem Ethanol durch Zentrifugation für 5 min bei 16.000 x g (bei Raumtemperatur).</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und trocknen Sie das Pellet 5 Minuten lang an der Luft.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das getrocknete Pellet in sterilem deionisiertem (DI) Wasser. Normalisieren Sie das Volumen auf 10.000 Trophozoiten pro μl.</li>
	<li>Bis zur Verwendung in der PCR bei -80 °C lagern.</li>
</ol>4. PCR-Nachweis von transformierten Trophozoiten
<ol><li>Verwenden Sie 20.000 Zelläquivalente DNA, 600 nM-Primer (Tabelle 1) und Taq-Polymerase und führen Sie die PCR24 durch. HINWEIS: Primer, die zwischen nativem CERE und kloniertem CERE unterscheiden, sind in Tabelle 1 aufgeführt, ebenso wie die PCR-Bedingungen. Abbildung 3 zeigt die Position der Primer auf den Konstrukten. Die PCR erfordert eine Optimierung in Abhängigkeit von den verwendeten Primern sowie dem verwendeten spezifischen PCR-Mix.</li>
	<li>Mikrowelle 0,8% Agarose in 1x Trisbase, Essigsäure und EDTA (TAE) Puffer, bis die Agarose aufgelöst ist.</li>
	<li>Die Agarose auf ~50 °C bei Raumtemperatur abkühlen lassen.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung in eine Gelgießschale, die einen Kamm enthält, um Vertiefungen zu bilden.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur ruhen, bis es fest ist.</li>
	<li>Legen Sie das Gel in das Elektrophoresegerät.</li>
	<li>Dekantieren Sie 1x TAE in die Elektrophoresekammer, bis das Gel bedeckt ist.</li>
	<li>Den Kamm entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 6x Ladefarbstoff (0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylolcyanol, 30 % Glycerin) zu den Proben und laden Sie das Gel. Verwenden Sie eine DNA-Leiter, um die Größe des PCR-Produkts zu bestimmen.</li>
	<li>Bringen Sie die Elektrode an, schalten Sie die Stromversorgung ein und lassen Sie das Gel ~1,5-2 h lang bei 80 V laufen.</li>
	<li>Schalten Sie das Gerät aus und entfernen Sie das Gel.</li>
	<li>Färben Sie das Gel mit DNA-Farbstoff (z. B. 10 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid) in 100 mL DI-Wasser für 10 min.</li>
	<li>Entfärben Sie das Gel 20 Minuten lang in DI-Wasser.</li>
	<li>Visualisieren Sie das Gel auf einem ultravioletten (UV) Lichtsystem und dokumentieren Sie die Ergebnisse.</li>
</ol>

Verwendung eines CERE-basierten Vektors für die Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten

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</ol>

Es wurden keine finanziellen Interessenkonflikte erklärt.

Das hierin skizzierte Protokoll ist sehr einfach, obwohl jedes Konstrukt wahrscheinlich einen gewissen Grad an Optimierung erfordert, insbesondere des DNA-Transfektionsreagenz-Verhältnisses, abhängig von der Art des Konstrukts und der verwendeten Naegleria-Spezies . Wir haben nur ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz mit diesem Protokoll getestet, aber es ist wahrscheinlich, dass mehrere andere wirksam sein können. Da ein vollständiger Klon des CERE verwendet wird, der einen funktionellen Ursprung der Replikation enthält und sich somit autonom repliziert, verfügt das Konstrukt über alle notwendigen eukaryotischen Replikationsmechanismen. Wenn ein partieller Klon in den pGEM-Vektor eingefügt würde, würde der transfizierte Klon voraussichtlich sehr bald nach der Transfektion verloren gehen, wenn er keinen funktionellen eukaryotischen Replikationsursprung enthält, ähnlich wie der leere pGEM-Vektor (Abbildung 2B). Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass das Vorhandensein von prokaryotischer DNA die Fähigkeit des molekularen Klons, vom Trophozoiten erhalten zu bleiben, nicht beeinträchtigt.
Obwohl es einen Fall von Transfektion von N. gruberi Trophozoiten25 gab, ist das in der vorliegenden Studie verwendete Insert erheblich größer (~17 kbp) als das, was in der vorherigen Studie transfiziert wurde (<1 kbp). Es ist zwar nicht bekannt, welche maximale Plasmidgröße von den Naeglerien toleriert werden kann, aber unveröffentlichte Daten aus unserem Labor haben gezeigt, dass Amöben einer anderen Gattung (Willaertia) CERE enthalten, die etwa 24 kbp groß sind.
Ein wichtiger Schritt, um sicherzustellen, dass dieses Protokoll DNA innerhalb des Trophozoiten nachweist, ist der DNase-Behandlungsschritt (Schritt 2.9), der sicherstellt, dass verbleibende DNA (d. h. DNA, die nicht transfiziert wurde) aus den Kulturen eliminiert wird. Es wurden einige Qualitätskontrollverfahren durchgeführt, um die Integrität des Protokolls zu gewährleisten. Zunächst wurden die Konstrukte sequenziert. Zweitens wurden die PCR-Produkte auch sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und sicherzustellen, dass es keine Kontamination des Assays gab, und um zu bestätigen, dass die PCR-Produkte nicht das Ergebnis einer Fehlzündung waren.
Während die erfolgreiche Transfektion eines Plasmids mit eukaryotischem Replikationsursprung nachgewiesen werden konnte, ist aus Abbildung 4 klar, dass es nach der ersten Passage der Trophozoiten zu einer Verminderung des PCR-Signals kommt. Die transfizierten Trophozoiten wurden im Laufe der Zeit einer qPCR unterzogen und es wurde festgestellt, dass der pGRUB-Spiegel von etwa 1.600 Kopien in Passage 1 auf 35 in Passage 7 abfällt (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass das transfizierte Plasmid wahrscheinlich in den nächsten Passagen verloren gehen wird. Dies ist nicht unerwartet, da das transfizierte Plasmid den Trophozoiten fremd ist und entweder als unnötig oder schädlich für das Überleben der Amöben angesehen werden würde.
Es besteht ein grundlegender Mangel an Wissen über die CERE der Naegleria. Bei der Mehrzahl der CERE-Sequenzen in GenBank handelt es sich um Teilsequenzen, wobei das Hauptaugenmerk auf der rDNA und den internen transkribierten Spacern (ITS) liegt, die zur Identifizierung von Gattungen (ITS1) und Arten (ITS2) verwendet werden1,26,27. Während die Sequenz der rDNA-Untereinheiten zwischen Naegleria sp. hoch konserviert ist, ist die NRS der Naegleria sp. variiert stark, sowohl in der Größe als auch in der Reihenfolge, und reicht von ca. 5,5 kbp bis 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. Die Funktion des NRS in Naegleria ist weitgehend unerforschtes Gebiet, aber es wird angenommen, dass es regulatorische Elemente enthält, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen Ursprung der Replikation, einen Promotor und eine Terminationssequenz17. Basierend auf den vollständigen CERE-Sequenzen in GenBank ist ein gemeinsames Merkmal von Naegleria CERE das Vorhandensein von Repeat-Regionen in der NRS, die A-T-reich sind. Die Funktion dieser Regionen ist derzeit nicht bekannt.
Die Fähigkeit, Naegleria-Trophozoiten zu transfizieren, ermöglicht die Untersuchung verschiedener Aspekte der CERE-NRS-Biologie, insbesondere der Dynamik und der Anforderungen der CERE-Replikation. In Escherichia coli wurden G-Quadruplexe in den Promotorregionen einiger Gene identifiziert28. G-Quadruplex-Strukturen wurden auch in den Promotoren einer Vielzahl von Eukaryoten identifiziert, darunter Mäuse, Ratten, Menschen und nicht-menschliche Primaten29. Die In-silico-Analyse mehrerer verschiedener CERE-Sequenzen in voller Länge zeigt, dass mehrere Bereiche des NRS voraussichtlich G-Quadruplex-Strukturen bilden. Ein Bereich der vorhergesagten G-Quadruplex-Strukturen in der NRS mehrerer Naegleria sp. liegt stromaufwärts des Anfangs des 18S-Gens. Die Fähigkeit, Trophozoiten zu transfizieren, würde die Erforschung der Identifizierung der Promotorregion der rDNA in der CERE von Naegleria durch Löschen/Mutieren von Sequenzen stromaufwärts der rDNA ermöglichen. Ebenso könnten ähnliche Studien durchgeführt werden, um Sequenzen zu identifizieren, die die rDNA-Transkription beenden.
Die Beibehaltung des CERE in voller Länge in den Trophozoiten für eine Reihe von Passagen wird Studien ermöglichen, die sich auf die Identifizierung des minimalen Bereichs des NRS konzentrieren, der für die Replikation des CERE benötigt wird. Während eine Region des CERE als mutmaßlicher Ursprung der Replikationidentifiziert wurde 20, ist nicht bekannt, ob sekundäre Strukturen außerhalb der Region für die CERE-Replikation erforderlich sind oder ob die Region signifikant abgeschnitten werden könnte und der Ori funktionsfähig bleibt. Die repetitiven Elemente in der NRS finden sich in allen Naegleria sp., die bis heutesequenziert wurden 15,16,17,18,19,20. Der Zweck dieser Sequenzen ist derzeit nicht bekannt. Ob sie als regulatorisches Element existieren oder ob sie gelöscht werden, ob sich die CERE-Replikate in den Trophozoiten wiederholen werden, ist noch nicht bekannt. Die sich wiederholenden Sequenzen sind bei Naegleria speziesspezifisch, aber ob die Sequenzen einer Art bei einer anderen Art funktionieren können, ist nicht bekannt. Kurz gesagt, es gibt unzählige Fragen zur CERE-Biologie, die jetzt mit der hier beschriebenen Technik beantwortet werden können.

Die Gattung Naegleria umfasst über 45 Arten, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass alle Vertreter der Art identifiziert wurden1. Naegleria kann in verschiedenen Formen existieren: als Trophozoiten (Amöben), als Flagellaten oder, wenn die Ressourcen stark begrenzt sind, als Zysten 1,2,3,4. Die Gattung Naegleria ist bekannt für ihre eine besonders gefährliche Art, Naegleria fowleri, bekannt als "die gehirnfressende Amöbe" (besprochen in 1,2,3,4,5,6,7), die die Ursache der fast überall tödlichen primären Amöben-Meningoenzephalitis ist.
Naegleria kodieren ihre rDNA auf dem CERE, das sich im Nukleolus befindet. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von drei Naegleria-Spezies bestätigt das Fehlen von rDNA im Kerngenom 8,9,10,11. Basierend auf den begrenzten CERE-Sequenzen in voller Länge reicht die CERE-Sequenz von etwa 10 kbp bis 18 kbp Länge. CERE jeder Naegleria-Spezies tragen jeweils ein einzelnes rDNA-Cistron (mit der ribosomalen 5,8-, 18- und 28S-DNA) auf jeweils etwa 4.000 CERE pro Zelle 12,13,14. Abgesehen von rDNA verfügt jede CERE über eine große Nicht-rDNA-Sequenz (NRS). Die CERE-Größen variieren zwischen den Arten; Die Unterschiede sind hauptsächlich auf die unterschiedliche Länge der NRS zurückzuführen, da die rDNA-Sequenzen in der Gattung 1,15,16,17,18,19,20 hoch konserviert sind. Die Kartierung eines einzigen Ursprungs der DNA-Replikation innerhalb des N. gruberi CERE NRS21 unterstützt die Hypothese, dass Naegleria CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert.
N. gruberi ist eine nicht-pathogene Amöbe, die häufig zur Untersuchung der Biologie von Naegleria verwendet wird. Wir haben eine Methodik zur Transformation von N. gruberi Trophozoiten mit einem CERE-Klon der gleichen Spezies entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass Naegleria amoebae CERE innerhalb der Trophozoiten tolerieren und unabhängig voneinander replizieren. Dies wurde erreicht, indem N. gruberi mit einem Volllängenklon von N. gruberi CERE in Trophozoiten umgewandelt und das Schicksal des Spender-CERE-Klons mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verfolgt wurde. Einen allgemeinen Überblick über das Protokoll gibt Abbildung 1. Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass der Spenderklon durch mindestens sieben Passagen in der Gewebekultur nachgewiesen werden kann, sowie durch Enzystierung und Exzystierung aufrechterhalten werden kann. Diese Studien bilden die Grundlage für ein Mittel, um zu analysieren, wie sich CERE repliziert, und um seine Verwendung als Vektor zur Transfektion von Naeglerien zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Kulturflaschen aus zerstoßenem Eis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, T-75</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatte, 6-Well-Corning</td><td></td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Elektropherese-Gel-Gerät</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Eisenchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Magneisum Chlorid</td><td>Fisher</td><td>Scientific M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Nukleinsäure</td><td>Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Elektropharese Netzteil</td><td>Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>MCB Reagenzien</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, Basis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blau, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Reagenz</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

transfektion eines molekularen klons von naegleria gruberi rdna in n. gruberi trophozoiten

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Alle ribosomalen Gene von Naegleria trophozoiten werden in einem geschlossenen zirkulären extrachromosomalen ribosomalen DNA (rDNA) enthaltenden Element (CERE) aufrechterhalten. Während wenig über CERE bekannt ist, zeigt eine vollständige Genomsequenzanalyse von drei Naegleria-Spezies eindeutig, dass es im Kerngenom keine rDNA-Cistronen gibt. Darüber hinaus wurde ein einzelner DNA-Replikationsursprung im N. gruberi CERE kartiert, was die Hypothese unterstützt, dass CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert. Diese CERE-Eigenschaft deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, manipuliertes CERE zu verwenden, um fremde Proteine in Naegleria trophozoites einzuführen. Als ersten Schritt zur Erforschung der Verwendung eines CERE als Vektor in Naegleria haben wir ein Protokoll zur Transfektion von N. gruberi mit einem molekularen Klon von N. gruberi CERE entwickelt, der in pGEM7zf+ (pGRUB) kloniert wurde. Nach der Transfektion konnte pGRUB in N. gruberi Trophozoiten für mindestens sieben Passagen sowie durch Enzystierung und Exzystierung leicht nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden Trophozoiten mit dem Rückgratvektor pGEM7zf+ ohne die N. gruberi-Sequenzen (pGEM) transfiziert. pGEM wurde nach der ersten Passage nach der Transfektion in N. gruberi nicht nachgewiesen, was auf seine Unfähigkeit zur Replikation in einem eukaryotischen Organismus hinweist. Diese Studien beschreiben ein Transfektionsprotokoll für Naegleria trophozoiten und zeigen, dass die bakterielle Plasmidsequenz in pGRUB die erfolgreiche Transfektion und Replikation des transfizierten CERE-Klons nicht hemmt. Darüber hinaus wird dieses Transfektionsprotokoll entscheidend für das Verständnis der minimalen Sequenz des CERE sein, die seine Replikation in Trophozoiten antreibt, sowie für die Identifizierung regulatorischer Regionen in der nicht-ribosomalen Sequenz (NRS).

Die PCR von Trophozoiten, die mit pGRUB transfiziert wurden, zeigt, dass das transfizierte CERE durch mindestens sieben Passagen der Trophozoiten sowie durch Enzystung und Exzystment nachgewiesen wird (Abbildung 4). Die in der PCR verwendeten Primer glühen sowohl an den pGEM-Vektor als auch an die CERE-Sequenz, wodurch sichergestellt wird, dass die PCR kein natives CERE nachweist. Die PCR nach Transfektion von pGEM in Trophozoiten zeigte, dass pGEM negativ war (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass das leere Plasmid nicht von den Amöben zurückgehalten wurde. Abbildung 4 zeigt, dass pGEM durch die erste Passage verloren ging - die nachfolgenden Passagen, die Enzystierung und die Exzystierung waren alle negativ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm des Transfektionsverfahrens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg"> Abbildung 2: Trophozoiten von N. gruberi (Stamm NEG-M) in Kultur. (A) Unter Standardkulturbedingungen bei 25 °C sind Trophozoiten von N. gruberi morphologisch amöid und haften an den Kulturflaschen/-platten. Der Pfeil zeigt einen Pseudopoden, der verwendet wird, um den Trophozoiten in die Richtung zu treiben. (B) Nach der Inkubation der N. gruberi-Kultur auf Eis werden die Trophozoiten morphologisch rund und nicht anhaftend. (C) Nach einer Inkubation in Enzystationsmedien für 24-48 h werden N. gruberi Trophozoiten enzystiert. Maßstabsbalken: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg"> Abbildung 3: pGRUB-Konstrukt zur Transfektion von N. gruberi (NEG-M). Das CERE von N. gruberi (EBM-Stamm, 14.007 bp; rot) wurde in pGEM7Zf(+) (2.997 bp; grün) kloniert, was zu einem Konstrukt von 17.004 bp führte. Pfeile auf jedem Plasmid zeigen die Position der PCR-Primer an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg"> Abbildung 4: PCR-Ergebnisse zum Nachweis von transfiziertem pGRUB und pGEM in N. gruberi Trophozoiten. Die PCR zeigt, dass pGRUB in transfizierten Trophozoiten durch mindestens sieben Passagen, Enzystment (En) und Exzystment (Ex), nachgewiesen wird. pGEM geht nach der ersten Passage der Trophozoiten verloren. P1 = Durchgang 1, P7 = Durchgang 7. Negative Kontrollen (neg) erhielten in der PCR keine DNA, während Positivkontrollen (pos) entweder pGRUB oder pGEM in die PCR eingegeben werden. Die erwarteten Produktgrößen betragen 656 bp (pGRUB) und 337 bp (pGEM). Die Abbildungen auf der linken Seite von Feld A zeigen die Größe der hellsten Banden der DNA-Leiter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name der Grundierung</td>
			<td colspan="2">Sequenz - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Produktgröße</td>
		</tr><tr><td>pGEM-vorwärts</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 bp</td>
		</tr><tr><td>pGEM-Rückwärtsgang</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 bp</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-vorwärts</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 bp</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-Umkehr</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: PCR-Primer und Bedingungen, die in diesen Studien verwendet wurden.
Ergänzende Datei 1: Die Sequenz des 17.004-Basenpaar-pGRUB-Konstrukts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.

Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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