Name: Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie Lichtblattmikroskopie für hochauflösende Bildgebung früher Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht zelluläre Auflösung und reduziert Photobleichung bei der Untersuchung embryonaler Entwicklungsprozesse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinertes Multiview-Lichtblattmikroskopie-Protokoll für Zebrafischembryonen

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Version: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>Latexkügelchen, Carboxylat-modifiziertes Polystyrol, fluoreszierend rot, 0,5 &mu; m mittlere Partikelgröße, wässrige Suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>Für die in vitro Transkription von H2A-mKirschplasmid</td></tr><tr><td>Kaliumchhlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Schlauch AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Wandstärke +/-0,05&nbsp;</td><td>Adtech-Innovationen bei Fluorkunststoffen</td><td>STW15</td><td>PTFE-Rohre</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Zeiss LightSheet 7 System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lichtblattmikroskopie: bildgebung und montagestrategien für frühe zebrafischembryonen

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Die präzise Ausrichtung der Probe ist ein wesentlicher Bestandteil der effizienten Nutzung eines Mikroskopie-Setups. Bei der Verwendung eines Multiview-Lichtplattensystems ist das manuelle Ausrichten der Proben jedoch oft nicht möglich, da die Proben in einem Röhrchen vorbereitet werden müssen. Um zu überprüfen, ob es stereotype Positionen gibt, die Embryonen innerhalb des Chorions einnehmen, wurden Zebrafischembryonen mit 70% Epibolie (etwa 7 h nach der Befruchtung (hpf)) abgebildet, da die Zeitrafferbildgebung von der Gastrulation bis zu den frühen Somitenstadien im Mittelpunkt dieser Studie stand. Als die Proben unmittelbar vor der Bildgebung bei 70% Epibolie vorbereitet wurden, zeigten die Embryonen keine spezifische Orientierung, die häufig bei Proben beobachtet wird. Da dies oft nicht erwünscht ist, wurden die Proben lange vor der Gastrulation vorbereitet und in Mikrozentrifugenröhrchen bei der entsprechenden Temperatur bis zum Beginn der Bildgebung gelagert. Unter diesen Bedingungen konnten die Embryoorientierungen bei 70 % Epibolie (N = 3; n = 87 Embryonen) eingeteilt werden in (1) Horizontal, wenn die tierisch-pflanzliche (AV) Achse des Embryos orthogonal zur Längsachse des Polymerschlauchs war, (2) Vertikal, wenn die AV-Achse parallel zur Längsachse des Polymerschlauchs war, und (3) Schräg, wenn sich die AV-Achse in einem spitzen Winkel befand (Abbildung 3A). Die horizontale Position war am wenigsten vertreten, während die vertikale und die schräge Position gleichermaßen beobachtet wurden (Abbildung 4).
Wenn die Embryonen in den Eileitern belassen wurden, waren die Embryonen in diesen jeweiligen Positionen bis zu 90% Epibolie stabil, danach änderten die meisten Embryonen ihre Ausrichtung. Daher war eine zweite Runde der Dokumentation der Orientierungen im Knospenstadium der Embryogenese (ca. 10 hpf) erforderlich, um die veränderten Orientierungen zu berücksichtigen. Dies wurde an unabhängig voneinander präparierten Proben durchgeführt. Für die Bildgebung früher Somitenstadien wurde zuvor berichtet, dass ein Embryo mit seinem Notochord orthogonal zur Längsachse der Polymerröhre die ideale Orientierung darstellt, da er die Visualisierung mehrerer bilateraler Somiten ermöglicht, die sich entlang der Achse15 bilden. Bei der Probenvorbereitung vor der Gastrulation (N = 3, n = 93 Embryonen) wiesen etwa 25 % der Embryonen diese Ausrichtung auf (Abbildung 4) und diese Embryonen blieben in dieser Ausrichtung mindestens bis zum 8-Somiten-Stadium stabil, was mit früheren Berichtenübereinstimmt 15. Die übrigen Embryonen zeigten im Knospenstadium verschiedene andere Orientierungen (klassifiziert in Abbildung 3B und Abbildung 4); Viele von ihnen orientierten sich jedoch während der frühen Somitenbildung in die horizontale Position um. Interessanterweise zeigte ein ähnlicher Prozentsatz der Embryonen im Knospenstadium eine horizontale Ausrichtung, unabhängig davon, ob die Probe vor der Gastrulation, bei 70% Epibolie oder unmittelbar vor dem Knospenstadium vorbereitet wurde. Daher scheint der Zeitpunkt der Probenvorbereitung für die horizontale Ausrichtung, die für die Bildgebung von Somitenstadien von Interesse ist, weniger kritisch zu sein, im Gegensatz zu dem, was bei der Bildgebung bei 70% Epibolie beobachtet wurde.
Der Vorteil eines Multiview-Systems ist die Möglichkeit, dieselbe Probe aus mehreren Blickwinkeln zu betrachten. Bei Zebrafischembryonen in den genannten Stadien ist jedoch nicht klar, wie viele Aufrufe erforderlich sind, um eine zelluläre Auflösung über den gesamten Embryo zu erhalten. Um dies zu charakterisieren, wurden Zebrafischembryonen mit einem 20x/1 NA-Objektiv im Detektionsarm mit einem Zoomfaktor von 1 abgebildet, was einer Lichtschichtdicke von 4,57 μm entsprach. Unter diesen Einstellungen deckte der Embryo das gesamte Sichtfeld einer sCMOS-Kamera mit einer Pixelgröße von 6,5 μm und einer Fläche von 1920 x 1920 Pixeln ab. Die Mikroinjektion von mRNA für ein histonmarkiertes Fluorophor (H2A-mCherry) in Embryonen im 1-Zell-Stadium, die aus einer transgenen Linie mit markierten Aktinfilamenten (Utr-GFP) gewonnen wurden, ermöglichte die Visualisierung sowohl der Zellkerne als auch der Zellmembranen im Embryo. Um die Multiview-Fusion von Embryonen mit unterschiedlichen Winkelintervallen durchzuführen, wurde eine 360°-Aufnahme der doppelt transgenen Embryonen sowie der Kügelchen in der Röhre in allen 30° (n = 3 Embryonen bei 70% Epibolie; n = 3 Embryonen im Knospenstadium) oder 45° (n = 3 Embryonen bei 70% Epibolie; n = 3 Embryonen im Knospenstadium) in Abständen von etwa 100 Scheiben in jedem Winkel und einem Schnittintervall von 2 μm durchgeführt. Durch das Überspringen alternativer Winkel während der Bildverarbeitung lieferten die 30°- und 45°-Aufnahmen zusätzlich die 60°- und 90°-Datensätze.
Die aufgenommenen Bilder wurden dann anhand der Perleninformationen registriert, und die Registrierungsdetails wurden in den Embryodatensatz übertragen, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Die erfolgreiche Registrierung mit dem BigStitcher-Plugin wurde für die verschiedenen Erfassungen mit Ausnahme des 90°-Datensatzes erreicht, was wahrscheinlich auf eine geringere Abdeckung der Probe aus jedem Winkel zurückzuführen ist. Um dies zu überwinden, wurden die Embryonen alle 90° mit etwa 400 Scheiben in jedem Winkel und einem Schnittabstand von 2 μm sowohl im Epibolie- als auch im Knospenstadium abgebildet, was erfolgreich registriert wurde (n = 3 Embryonen pro Stadium).
Der nächste Schritt bestand darin, eine Multiview-Fusion und Dekonvolution der registrierten Datensätze durchzuführen. Dies geschah mit 4-fachem Downsampling, um die Berechnung zu beschleunigen. Wie bei der Darstellung von Zellkernen aus Einzelansichten und einem rekonstruierten Embryo mit mehreren Ansichten zu sehen ist (Abbildung 5), decken die Einzelansichten ein kleineres Sichtfeld ab, das bei der Fusion ein Bild des gesamten Embryos ergab. Für die Darstellung wurden Kerne mit Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon) detektiert, einem auf Fidschi basierenden Plugin, das in Fidschi im Abschnitt "Manage Update Sites" des Menüs "Hilfe" hinzugefügt und nach dem Hinzufügen unter dem Plugins-Menü aufgerufen werden kann. Für die Detektion wurden zunächst die entsprechenden Bilder in das XML/hdf5-Format konvertiert und dann die nukleare Detektion mit dem 'Detection'-Plugin von Mastodon mit einem DoG-Detektor (Durchmesser 6 μm und Qualitätsschwelle 80) durchgeführt.
Unter den verschiedenen fusionierten Bildern zeigte der 90°-Datensatz einen sehr hohen Hintergrund tiefer in der Probe, was ihn für eine Quantifizierung ungeeignet machte. Im Gegensatz zu kleineren Proben wie Drosophila-Embryonen, die in anderen Studien häufig mit einem 90°-Intervall abgebildet wurden 9,22, wird dies daher nicht für die Bildgebung früher Zebrafischembryonen mit einem 20x/1 NA-Objektiv empfohlen. Zwischen den 30°-, 45°- und 60°-fusionierten Datensätzen gab es qualitativ keinen wesentlichen Unterschied in der Kerninformation (Abbildung 6B, obere Reihe); feinere Strukturen wie Zellgrenzen schienen jedoch mit dem 30°-fusionierten Datensatz im Vergleich zum Rest viel besser aufgelöst zu sein (Abbildung 6C, obere Reihe).
Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurde Mastodon verwendet, um Kerne in den fusionierten Bildern zu erkennen, die aus der Bildgebung alle 30°, 45° und 60° erhalten wurden. Für die Analyse wurden drei Regionen in den fusionierten Bildern ausgewählt, jeweils eine in einer Tiefe von 20 μm (Abbildung 6A), 50 μm und 100 μm von der Oberfläche des Embryos. Um die Effizienz der Kerndetektion über Bilder hinweg zu vergleichen, wurde die Detektion wie oben beschrieben durchgeführt, mit identischen Parametern über fusionierte Bilder aus verschiedenen Winkelintervallen. In allen analysierten Regionen wurde jeder Kern unabhängig von fusionierten Bildern detektiert, die aus der Bildgebung alle 30°, 45° oder 60° gewonnen wurden (Abbildung 6B, untere Reihe). Somit können kugelförmige Strukturen wie Kerne in jedem der oben genannten Winkelintervalle ohne Informationsverlust abgebildet werden.
Zur Analyse von Zellgrenzen wurde der Tissue Analyzer23 verwendet, ein FIJI-Plugin, das routinemäßig zur Segmentierung der Zellen24, 25 und 26 verwendet wird. Ähnlich wie Mastodon kann das Tissue Analyzer-Plugin im Abschnitt "Manage Update Sites" des Menüs "Hilfe" in FIJI hinzugefügt und nach dem Hinzufügen unter dem Plugins-Menü aufgerufen werden. Die Zellgrenzen wurden unter Verwendung des Watershed-Algorithmus mit Standardparametern und einer starken Unschärfe von 1,5 bis 2 je nach Gewebetiefe und einer schwachen Unschärfe von 1 segmentiert. Diese Parameter wurden über alle Analysen hinweg konstant gehalten, was einen einfachen Vergleich ermöglicht. Beim manuellen Vergleich der segmentierten Bilder mit den ursprünglichen Eingabebildern wurden Fehler beobachtet, bei denen die Software entweder eine Zellgrenze nicht erkannte oder nicht vorhandene Zellgrenzen zeichnete (Abbildung 6C, untere Reihe). Die Anzahl der Fehler, die vom Gewebeanalyse-Plugin gemacht wurden, wurde auf die Gesamtzahl der in der Region erkannten Bindungen normalisiert und als "Grenzsegmentierungsfehler" berechnet. Während diese Fehler in allen analysierten Bereichen vorhanden waren, stieg die Anzahl der Fehler in fusionierten Bildern, die aus der Bildgebung in Winkelintervallen von 45° und 60° gewonnen wurden, im Vergleich zu 30° drastisch an (Abbildung 6D). Dies deutete darauf hin, dass die Auflösung in den fusionierten Bildern mit zunehmendem Winkelintervall zunehmend schlechter wurde. Für die Segmentierung feinerer Strukturen wie Zellgrenzen ermöglicht ein engeres Winkelintervall eine einfachere Weiterverarbeitung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg"> Abbildung 1: Probenvorbereitung mit Polymerröhrchen. (A) Ein Polymerröhrchen aus den gelagerten Mikrozentrifugenröhrchen wird mit einer Pinzette entnommen. (B) Befestigen Sie das Röhrchen an der Spitze einer 200-μl-Mikropipette. (C) Aspirieren von Embryonen mit Hilfe einer Pipette in das Röhrchen. (D,E) Ein Polymerröhrchen mit Embryonen im Knospenstadium, die am Boden des Röhrchens sichtbar sind. (F) Die Polymerröhrchen werden mit E3 auf eine Petrischale gelegt, um die Agarose zu verfestigen. (G) Lagerung der Polymerröhrchen in einem mit E3 gefüllten Mikrozentrifugenröhrchen. (H) Zusammengebauter Probenhalter mit dem montierten Polymerröhrchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg"> Abbildung 2: Workflow für die Multiview-Bildanalyse und Registrierung mithilfe von Perlen. (A) Die Multiview-Bildanalyse-Pipeline. (B) Das Bild zeigt das "Multiview Explorer"-Fenster in BigStitcher, einem FIJI-Plugin, in dem jede Ansicht als einzelne Zeile angezeigt wird und Informationen über den Winkel, den Kanal, die Registrierung, die Interessenpunkte und die PSF enthält. Alle im Protokoll besprochenen Befehle werden angezeigt, wenn eine Ansicht ausgewählt und mit der rechten Maustaste geklickt wird, wie im Popup-Menü dargestellt. Die ausgewählten Ansichten können im BigDataViewer-Fenster visualisiert werden, wie gezeigt. (C) Ein repräsentatives Bead-Bild vor (links) und nach der Registrierung (rechts), das aus der Bildgebung in 30°-Winkelabständen gewonnen wurde. Alle Winkelansichten wurden ausgewählt und angezeigt. Maßstabsbalken: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg"> Abbildung 3: Überblick über die Standard-Embryoorientierungen. Repräsentative Bilder der Orientierungen, in die die Embryonen innerhalb des Chorions bei 70% Epibolie (A) und Knospenstadien (B) fallen. Die obere Reihe in jedem Panel zeigt Hellfeldbilder, die aus dem Lichtblattsystem gewonnen wurden, und die untere Reihe zeigt repräsentative Cartoons. Die Pfeile in (B) zeigen die Position des Notochords an, der zur Identifizierung der Ausrichtung verwendet wurde. Ap, Tierstange; Vp, pflanzlicher Pol; A, anterior; P, posterior. Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg"> Abbildung 4: Statistik der verschiedenen Embryonenorientierungen. (A) Die gestapelte Spalte zeigt den prozentualen Anteil der Embryonen an, die bei der Probenvorbereitung vor der Gastrulation mit 70 % Epiboly in die angegebenen Orientierungen fallen. (B) Die gestapelten Säulen zeigen den prozentualen Anteil der Embryonen, die in den Knospenstadien bei der Probenvorbereitung vor der Gastrulation (links), bei 70 % Epibolie (Mitte) und im Knospenstadium (rechts) in die angegebenen Orientierungen fallen. N, die Anzahl der unabhängigen Gelege, aus denen Embryonen gewonnen wurden; n, die Gesamtzahl der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg"> Abbildung 5: Darstellung der Zellkerne eines rekonstruierten Embryos mit mehreren Ansichten. (ein)Das 3D-Streudiagramm stellt Zellkerne dar, die in einem mit Multiview rekonstruierten Embryo nachgewiesen wurden, der im Winkelintervall von 30̛° abgebildet wurde. Jeder Kreis stellt einen Kern dar, und der Schwerpunkt der Kernpositionen wird dargestellt. Die nuklearen Koordinaten wurden mit Mastodon, einem FIJI-Plugin, ermittelt. (B) 3D-Streudiagramme von Zellkernen aus drei repräsentativen Ansichten desselben Embryos - die Darstellungen sind 60° voneinander entfernt. Die Farben für jeden Zellkern wurden nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg"> Abbildung 6: Vergleich von Informationen auf zellulärer Skala in fusionierten Bildern. (A) Das Bild links zeigt einen Schnappschuss eines mit Multiview rekonstruierten Embryos in einer Tiefe von 20 μm über der Oberfläche. Der gelbe Kreis zeigt die Region, die für die weitere Analyse verwendet wird. Maßstabsleisten: 50 μm (in allen Panels). (B) Repräsentative Rohbilder von Zellkernen in einer Tiefe von 20 μm von der Oberfläche des Embryos aus drei Datensätzen, die alle 30°, 45° bzw. 60° abgebildet wurden (oben). Zellkerne, die in den gleichen Bildern von Mastodon, einem FIJI-Plugin (unten), entdeckt wurden (in grün). (C) Repräsentative Rohbilder in einer Tiefe von 20 μm von der Oberfläche des Embryos aus drei Datensätzen, die alle 30°, 45° bzw. 60° unter Verwendung des Aktinmarkers Utr-GFP (oben) abgebildet wurden. Grenzen, die von Tissue Analyzer, einem FIJI-Plugin, segmentiert wurden, werden für dieselben Bilder angezeigt (unten). Pfeile zeigen Fehler an, die der Tissue Analyzer bei der Grenzsegmentierung gemacht hat, wobei der gelbe Pfeil eine fehlende Begrenzung und der weiße Pfeil falsch erkannte Grenzen darstellt, wenn visuell keine Grenzen zu existieren scheinen. (D) Der Boxplot zeigt den prozentualen Prozentsatz der Fehler, die der Gewebeanalysator zwischen rekonstruierten Embryonen gemacht hat, die alle 30°, 45° und 60° in verschiedenen Tiefen abgebildet wurden. Fehlerbalken zeigen das 1,5-fache des Interquartilsabstands an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt die Probenvorbereitung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Es demonstriert auch eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung, die die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht.

Probenvorbereitung für die Lichtblattmikroskopie: Einbetten lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von...

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Hier stellen wir eine neue Technik vor, um Hühnerembryonen ex ovo für die Zeitrafferbildgebung mittels Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie zu kultivieren. Das getauchte Filterpapiersandwich ist eine Variante der etablierten Filterpapierträgertechnik1, die die Kultivierung von Hühnerembryonen ermöglicht, die vollständig in ein flüssiges Kulturmedium getaucht sind.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit Ex Ovo Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Erfahren Sie Lichtblattmikroskopie für hochauflösende Bildgebung früher Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht zelluläre Auflösung und reduziert Photobleichung bei der Untersuchung embryonaler Entwicklungsprozesse.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Weitere Videos entdecken