Name: Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Single-Cell-Transkriptomik und Organoid-Technologie kombiniert werden, um die zelluläre Heterogenität des Dünndarms zu analysieren. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Biomarker und Mechanismen intestinaler Erkrankungen.

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Die Autoren danken den Zuschüssen U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 und NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Integration von Einzelzell-Transkriptomik mit humanen Darmorganoiden

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<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li>
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<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Mit Hilfe von Einzelzellgenomik-Plattformen können komplexe biologische Systeme, wie z. B. aus Gewebe gewonnene HIO-Kulturen, die das Darmepithel modellieren, so aufgebrochen werden, dass individuelle zelluläre Beiträge zur biologischen Gesamtreaktion erzielt werden 4,5,6. Auch zelluläre Heterogenität und seltene Zellpopulationen können identifiziert und abgefragt werden. Der zelluläre Input muss optimiert werden, um den Output mit einzelzellulären transkriptomikbasierten Plattformen zu maximieren. Hier beschreiben wir Protokolle, die sehr brauchbare und qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen liefern, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, nachgelagerte qualitativ hochwertige Transkriptomdaten zu erhalten. Die Vertrautheit mit dem Protokoll ist von größter Bedeutung, und es wird empfohlen, mehrere Übungsläufe durchzuführen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren. Es wird empfohlen, dass vor der Verwendung der Zellen für die Bibliotheksvorbereitung reproduzierbare Einzelzellsuspensionen erzielt werden. Die Geschwindigkeit, mit der das Protokoll umgesetzt wird, ist von größter Bedeutung, da die Geschwindigkeit direkt proportional zu den Durchführbarkeitsergebnissen ist. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Anzahl der gleichzeitig gehandhabten Proben zu begrenzen. Es wird empfohlen, sich mit der Entität in Verbindung zu setzen, die die Bibliotheken vor dem Initiieren dieser Protokolle vorbereitet, um Unterstützung bei der Problembehandlung zu erhalten.
Die Lebensfähigkeit von HIOs beeinflusst direkt die DNA-Bibliothek, die zur Sequenzierung gesendet wird. Die Zellviabilität des HIO hängt von mehreren Schritten bei der Herstellung der Einzelzellsuspension ab, einschließlich Dissoziation, Zentrifugation, Puffer, Pipettieren und Zählgenauigkeit. Das Ziel der Vorbereitung der HIOs für die Plattform ist es, die Aufrechterhaltung der Zellviabilität mit der Probenqualität in Einklang zu bringen. Entscheidend für die Erzielung qualitativ hochwertiger Daten ist die Minimierung von zellulären Aggregaten, toten Zellen, nicht-zellulären Nukleinsäuren und biochemischen Inhibitoren der reversen Transkription. Sterbende Zellen erhöhen das Nukleinsäurerauschen und tragen zur Zellverklumpung bei, was zu Daten- und Plattformfehlern führt 7,8,9,10,11,12. Das Filtern mit einer geeigneten Filtergröße kann dazu beitragen, große Aggregate zu entfernen und die Datenqualität zu verbessern.
Mehrere Faktoren müssen berücksichtigt werden, um den HIO-Zelltod bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu minimieren. Es ist notwendig, mindestens 80 % lebensfähige Zellen zu erhalten, und >90 % Lebensfähigkeit ist noch wünschenswerter. Proben mit einer hohen Anzahl nicht lebensfähiger Zellen können durch Strategien zur Entfernung abgestorbener Zellen, wie z. B. säulenbasierte Mikrokügelchen, verbessert werden, obwohl diese aufgrund von Verlusten während der Handhabung mehr Ausgangszellen und größere Probenvolumina erfordern. HIOs reagieren besonders empfindlich auf Puffer und erleiden den Zelltod, wenn sie in bestimmten Puffern zu lange bei RT verbleiben. Organoide Medien führen zu einem geringsten Zellverlust und einer geringsten Aggregatbildung. Pipettieren kann auch die Lebensfähigkeit von HIOs während der Dissoziation beeinträchtigen. Reguläre Bohrungsspitzen können Organoide scheren und so helfen, in einzellige Suspensionen zu dissoziieren. Ein zu schnelles Pipettieren mit einer regulären Bohrungsspitze kann jedoch zu einer Schädigung der HIO-Zellen durch die Scherkräfte führen. Langsames Pipettieren mit Spitzen mit breiter Öffnung minimiert die Belastung der HIO-Zellen und verbessert die Anzahl der lebensfähigen Zellen flussabwärts erheblich. Zentrifugieren, Waschen und Resuspendieren sind weitere Faktoren, die die Qualität von HIO-Einzelzellsuspensionen beeinflussen können. Die schwingende Becherzentrifugation führt zu einer schonenderen Pelletierung der HIO-Zellen, was zu einer geringeren Anzahl toter Zellen führt und gleichzeitig den Zellverlust minimiert. Schließlich ist die Zählgenauigkeit zur Bestimmung der Konzentration unerlässlich, um sicherzustellen, dass die maximale Anzahl von Zellen die Plattform für die Bibliothekssynthese erreicht. Die Beachtung dieser Details führt zu einer Minimierung der Belastung der HIO-Zellen während des Isolationsprozesses und gewährleistet die höchste Wahrscheinlichkeit einer Datenrückgabe nach der Verarbeitung.
Obwohl die Einzelzell-Transkriptomik ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um biologische Profile und Reaktionen auf Einzelzellebene zu analysieren 4,5,6, gibt es mehrere Einschränkungen, die bei der Anwendung der Technologie zur Analyse menschlicher Darmorganoidkulturen berücksichtigt werden müssen. Erstens kann es aufgrund der technischen Variabilität, die während der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung eingeführt wird, oder aufgrund von Batch-Effekten, die sich aus der Probenvorbereitung ergeben, zu erheblichen transkriptionellen Variationen kommen. Darüber hinaus kann die Sequenzierung zu einer Abdeckungsverzerrung führen, wenn die Sequenzierungstiefe über Gene oder Zellen hinweg ungleichmäßig ist. Dies führt zu Herausforderungen beim Nachweis niedrig exprimierter Gene oder bei der Identifizierung seltener Zellpopulationen. Zweitens kann die Identifizierung von Zelltypen aufgrund der zellulären und transkriptionellen Heterogenität der Organoidkulturen und eines weniger differenzierten zellulären Profils im Vergleich zum nativen Darmepithel schwierig sein. Die Kopplung von transkriptionellen Reaktionen an funktionelle Phänotypen ist ebenfalls eine Herausforderung und erfordert eine zusätzliche Validierung mit anderen Ansätzen oder Assays. Drittens beinhaltet dieser Ansatz keine Berücksichtigung des räumlichen Kontexts oder der zeitlichen Dynamik der Zellen. Das Dissoziationsverfahren beseitigt die Möglichkeit, Zell-Zell-Interaktionen aus den Transkriptionsdaten abzuleiten. Es liefert nur eine einzige Momentaufnahme des zellulären Zustands und kein biologisches Kontinuum. Schließlich können transkriptionelle Ansätze für Einzelzellen kostspielig sein und spezielle Computerwerkzeuge und bioinformatisches Know-how erfordern. Dieser Ansatz ist jedoch nach wie vor ein dominierendes Werkzeug auf dem neuesten Stand der Technik, um die zelluläre Heterogenität zu verstehen und neue Zelltypen zu identifizieren.

Das Dünndarmepithel besteht aus zwei unterschiedlichen Zonen: der Krypta, in der sich die Darmstammzelle (ISC) befindet, und den Zotten, die aus differenzierten Zellen der sekretorischen und absorptiven Linie bestehen. Zu dieser Komplexität kommt die regionale Spezifität des Epithels hinzu, die einzigartige funktionelle Eigenschaften zwischen den Regionen des Dünndarms bietet. In Pionierarbeit wurden Kulturbedingungen geschaffen, in denen sowohl die menschliche Dünndarmkrypta als auch die Zottenzonen ex vivo aus chirurgischem Gewebe oder Gewebebiopsien erzeugt werden können1. Diese Kulturen schließen die Lücke zwischen Tierversuchen und klinischen Studien und enthüllen bisher unerkannte Zellbiologie, Biochemie und Physiologie des Magen-Darm-Trakts. Die HIOs werden als sphärische 3D-Strukturen unter Verwendung eines Mediums mit Wachstumsfaktoren vermehrt, die die Lebensfähigkeit von Stammzellen fördern, und extrazellulären Stützmatrizen. Diese Bedingungen führen zu einem kryptenartigen HIO-Modell, das hauptsächlich aus Vorläuferzellen und Stammzellen besteht. Die Entfernung der Wachstumsfaktoren fördert die ISC-Differenzierung (zottenähnliches Modell) und die Produktion reifer Darmepithelzellen (Kelch, enteroendokrine, Büschel, Enterozyten) in geeigneten Verhältnissen zusammen mit Zellproliferation und -differenzierung, Polarisation, Barriereintegrität, regionalen spezifischen Merkmalen und angemessenen physiologischen Reaktionen2. HIO-Kulturen sind genetisch stabil und können in ihrem kryptenartigen Zustand unbegrenzt vermehrt werden. Der einfache Zugang zur apikalen Oberfläche dieser Kulturen wird durch Kulturbedingungen ermöglicht, die das Wachstum in einem Monolayer-Format ermöglichen3. HIOs ermöglichen es auch, die individuelle Variabilität des Wirts wie Genetik, Alter, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit und Krankheitsstatus in biologische Analysen einzubeziehen. Analytische und funktionelle Bewertungsinstrumente sind identisch mit denen, die in Ansätzen verwendet werden, die sich auf transformierte Zelllinien konzentrieren, und umfassen eine Vielzahl molekularer Techniken wie Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik.
Die Einzelzell-Transkriptomik revolutioniert unser Verständnis der Biologie und Physiologie des Dünndarms, indem sie Einblicke in die individuellen Beiträge jedes Zelltyps zu einem biologischen Prozess bietet. Pionierarbeit mit dieser Technologie hat eine Landschaft der Zelltypen geschaffen, die im nativen menschlichen Darm vorkommen 4,5,6. Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen ermöglichen die Erforschung der Transkriptionslandschaft einzelner Zellen, so dass die Zellheterogenität in den Vordergrund der wissenschaftlichen Erforschung rückt. In einigen Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen werden mikrofluidische Partitionierung und Barcoding verwendet, um cDNA-Bibliotheken aus zellulären polyadenylierten mRNAs zu generieren, die aus bis zu 10.000 Zellen pro Probe gewonnen werden. Auf dieser Plattform bilden Tröpfchen, die einzelne Zellen, barcodierte Oligonukleotide, reverse Transkriptionsreagenzien und Öl enthalten, ein Reaktionsvesikel, das dazu führt, dass alle cDNAs einer einzelnen Zelle denselben Barcode haben. Die barcodierten cDNAs können dann mittels Next Generation Sequencing effizient sequenziert werden. Die generierten Daten können durch Software und Visualisierungstools verarbeitet werden, die die Barcode-Sequenzen in Visualisierungskarten und Transkriptionsprofile einzelner Zellen umwandeln. Zellpopulationen können anhand öffentlich zugänglicher Datenbanken des menschlichen Dünndarmepithels identifiziert werden 4,5,6. Obwohl viele Studien diese Plattform genutzt haben, um Darmorganoide von Mäusen auf Einzelzellebene zu untersuchen, hinkt die Analyse der einzelzellulären Transkriptionsreaktionen von HIOs 7,8,9,10,11,12 hinterher.
Hier stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Dünndarm-HIOs für die Verarbeitung auf Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen zur Verfügung (Abbildung 1). Wir stellen Kultivierungs- und Differenzierungsrichtlinien sowie Medienkomponenten zur Verfügung, die für die epitheliale Differenzierung optimiert wurden. Wir skizzieren Zellrückgewinnungsmethoden für drei verschiedene Kulturformate: dreidimensionale (3D) und Monolayer-Kulturen entweder auf Kunststoff- oder auf Membranzellkultureinsätzen. Wir stellen Beispiel-Clustering-Daten zur Verfügung, die mit Open-Source-Software gewonnen wurden, um differentiell exprimierte Gene in jedem Cluster abzuleiten.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS Ca- Mg-Corning</td><td></td> <td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Transwell</td><td>Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 & micro; m Zellensieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Flowmi Spitzensieb</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Flowmi Spitzensieb</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500</td></tr><tr><td>nM Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1X</td></tr><tr><td>Chrom Next GEM Einzelzelle 3' GEM, Bibliothek & Gel Bead Kit v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000128</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533-5MG</td><td>33 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Corning Zellrückgewinnungslösung&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>1X</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>L-WRN konditioniertes Medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, phenolfrei</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Maus rekombinante EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1X</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>500 &micro; M</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>72308</td><td>10 & Mikro; M</td></tr></tbody></table>

verwendung menschlicher darmorganoide zum verständnis des dünndarmepithels auf der ebene der transkription einzelner zellen

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

Die Einzelzell-Transkriptomik hat unser Verständnis der Zellbiologie des menschlichen Körpers revolutioniert. Modernste humane Dünndarm-Organoidkulturen liefern ex vivo Modellsysteme, die die Lücke zwischen Tiermodellen und klinischen Studien schließen. Die Anwendung der Einzelzell-Transkriptomik auf humane Darmorganoide (HIO)-Modelle enthüllt bisher unerkannte Zellbiologie, Biochemie und Physiologie des Magen-Darm-Trakts. Die fortschrittlichen Einzelzell-Transkriptomik-Plattformen verwenden mikrofluidische Partitionierung und Barcoded, um cDNA-Bibliotheken zu generieren. Diese barcodierten cDNAs können von Next-Generation-Sequencing-Plattformen einfach sequenziert und von verschiedenen Visualisierungstools zur Erstellung von Karten verwendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Kultivierung und Unterscheidung von humanen Dünndarm-HIOs in verschiedenen Formaten und Verfahren zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus diesen Formaten, die für den Einsatz in Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen geeignet sind. Diese Protokolle und Verfahren erleichtern die Verwendung von Dünndarm-HIOs, um ein besseres Verständnis der zellulären Reaktion des menschlichen Darmepithels auf transkriptioneller Ebene im Kontext einer Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen zu erhalten.

Einzelzellsuspensionen wurden aus 2-3 Vertiefungen mit Membranzellkulturinsert, Monolayern und 3D-HIOs gepoolt, um eine ausreichende Zellausbeute zu gewährleisten und die Variation von Well zu Well zu reduzieren. Einzelzellbibliotheken wurden unter Verwendung von Reagenzien erstellt, die spezifisch für die Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattform sind. und sequenziert mit gepaarten End-Reads auf einer Next-Generation-Sequencing-Plattform, 30.000 Reads/Zelle. Die Reads wurden mit Hilfe von Analysewerkzeugen für die Einzelzellgenomik kartiert, gezählt und analysiert. Minderwertige Zellen mit mehr als 20 % mitochondrialen Lesevorgängen oder weniger als 200 gezählten Genen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Um die Qualität der Zellen zu beurteilen, haben wir die Anzahl der Gene, UMIs und prozentualen mitochondrialen Lesevorgänge pro Zelle aufgetragen (Abbildung 3); Hochwertige Zellen enthalten etwa 3500 Gene, 15.000 UMIs und 10 % mitochondriale Reads. Nach der Filterung erhielten wir je nach HIO-Wachstumsformat 4000 bis 9500 Einzelzellen. Unüberwachtes Clustering und UMAP-Dimensionsreduktion identifizierten unterschiedliche Cluster, die erwartete Zelltypen repräsentieren, einschließlich absorbierender Enterozyten und sekretorischer Zellen (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Protokollschritte. Schaltpläne, die die wichtigsten Schritte bei der Beschichtung von HIOs in verschiedenen Formaten für den Arbeitsablauf von Einzelzelldaten beschreiben. Dieses Bild wurde mit Biorender erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig02.jpg"> Abbildung 2: Hellfeldbilder. HIOs, die für die Verarbeitung bereit waren, wurden mit einem Hellfeldmikroskop bei 5-facher Vergrößerung abgebildet. Links: 3D-Organoide; Mitte, 96-Well-Platte; Richtig, Transwell. Maßstabsstäbe = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig03.jpg"> Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Daten. Beispielmetriken von analysierten Einzelzellen, die aus jejunalen HIOs isoliert wurden, die als Monoschichten auf 96-Well-Platten gezüchtet wurden. Violin-Diagramme zeigen die Anzahl der Gene (nFeature_RNA), UMIs (nCount_RNA) und prozentualen mitochondrialen Lesevorgänge (percent.mt) pro Zelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig04.jpg"> Abbildung 4: UMAPs von analysierten Einzelzellen. (A) Insgesamt wurden 9952 Einzelzellen aus differenzierten jejunalen HIOs isoliert, die in 96-Well-Platten gezüchtet wurden. (B) Insgesamt wurden 5623 Einzelzellen aus differenzierten jejunalen HIOs isoliert, die auf Membranzellkulturinsertionen gezüchtet wurden. (C) Insgesamt wurden 4402 Einzelzellen aus differenzierten ilealen 3D-HIOs isoliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>WRNE Wachstumsmedium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Differenzierungsmedium</td>
		</tr><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>WRNE-Medium ohne L-WRN-konditioniertes Medium, Nicotinamid und SB202190</td>
		</tr><tr><td>*Y-27632 (5 mM) optional</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>A 83-01 (500 μM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Erweitertes DMEM/F12</td>
			<td>45 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nr. B27</td>
			<td>2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF (50 μg/ml)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>50 ng/ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gastrin (10 μM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>10 nm</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMax (100-fach)</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES 1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-WRN Con- Medien</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>~50%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N2</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-Acetylcystein (500 mM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>500 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nicotinamid 1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>ca. 10 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>SB202190 (10 mM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gesamtvolumen</td>
			<td>100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CMGF - Mittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Erweitertes DMEM/F12</td>
			<td>500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>100-mal</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1 M Hepes</td>
			<td>5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien.

Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

Forschung

JoVE Journal

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Biologie

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

In diesem Videoprotokoll erklären wir Schritt für Schritt die lentivirale Transduktion in Organoiden des primären Darmepithels und die Verarbeitung und nachgelagerte Analyse dieser Kulturen mittels quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Menschliche Darmorganoide müssen innerviert werden, um die Struktur und Funktion des nativen menschlichen Darms besser rekapitulieren zu können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein enterisches Nervensystem in diese Konstrukte einzubauen.

Innervation menschlicher Darmorganoide

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Erfahren Sie, wie Single-Cell-Transkriptomik und Organoid-Technologie kombiniert werden, um die zelluläre Heterogenität des Dünndarms zu analysieren. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Biomarker und Mechanismen intestinaler Erkrankungen.

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

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