Name: Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Thrombozytenmigration mit RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Erfahren Sie, wie Thrombozytenmigration mit RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern untersucht wird. Diese Methode zeigt, wie wandernde Thrombozyten Kraft aufbringen, um Bindungen zu lösen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Bildgebung der Migration einzelner Thrombozyten mit einem dreischichtigen Beschichtungssystem

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+thrombosis--insidious%2C+unpredictable+and+deadly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Arterial thrombosis--insidious, unpredictable and deadly.</a> Nat Med. 17, 1423-1436 (2011).</li>
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<li>Palecek, S. P., Loftus, J. C., Ginsberg, M. H., Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-ligand+binding+properties+govern+cell+migration+speed+through+cell-substratum+adhesiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness.</a> Nature. 385, 537(1997).</li>
<li>Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+integrin+tension+and+cellular+force+at+submicron+resolution+with+an+integrative+tension+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor.</a> J Vis Exp. (146), e59476(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosin-5&prime;-diphosphat-Natriumsalz (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Blutzähler</td><td>Sysmex</td><td>XN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bottomless 6 Kanal Sticky Slide</td><td>IBIDI, Sticky Slides VI0.4</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]</td><td>Peptid international</td><td>PCI-3697-PI</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhren</td><td>Corning Marke&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>FITC-Konjugat Neutravidin</td><td>Thermofisher</td><td>A2662</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrast- und Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener</td><td>116531</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotin(50%)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotin (50%)</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-lysin)- transplantiert-poly(ethylenglykol)-copolymer</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin I2 Natriumsalz (PGI2)</td><td>Abcam</td><td>ab120912</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>BANDELIN</td><td>SONNOREX RK514M</td><td></td></tr><tr><td>Ttriton X-100 20% v/v</td><td>Cayman Chemikalie</td><td></td><td></td>600217</tr><tr><td>U46619</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-PG023-0001)</td><td></td></tr></tbody></table>

ein in vitro assay zur untersuchung der thrombozytenmigration mit rgd-funktionalisierten avidin-biotin-ethern

An In Vitro Assay to Study Platelet Migration Using RGD-Functionalized Avidin-Biotin Tethers

Aktivierte Thrombozyten haften und verteilen sich leicht auf PLL-PEG-Biotin-Neutravidin-FITC-Biotin-cRGD-beschichteten Objektträgern (Abbildung 1C und Abbildung 2A; 0 min und 5 min) und polarisieren anschließend, indem sie ein Lamellipodium an der Vorderkante bilden (Abbildung 2A; 10 min). Während dieses Prozesses wanderte der Pseudokern (dunkler Bereich in der Mitte der Blutplättchen) von der Mitte zur Rückseite der Blutplättchen (Abbildung 2A). Polarisierte Blutplättchen beginnen dann ohne offensichtliche Richtungsabhängigkeit zu wandern (Abbildung 2A; 15 min und 20 min und Abbildung 2B). Wir beobachteten, dass Thrombozyten, die auf PLL-PEG-Biotin-Neutravidin-FITC-Biotin-cRGD-Beschichtungen migrieren, die Neutravidin-FITC-Biotin-PLL-PEG-Bindung aufbrechen können, was sich in der Verringerung der Fluoreszenzintensität entlang des Migrationspfads zeigt (Abbildung 1C und Abbildung 2A,B). Darüber hinaus reichert sich der gestörte Neutravidin-FITC-Biotin-cRGD-Komplex auf der Thrombozytenoberfläche an (Abbildung 2A,B). Dieses Phänomen ähnelt früheren Befunden, bei denen wandernde Blutplättchen Fibrinogen aus dem Substrat entfernten und es in ihrem offenen kanalikulären System (OCS) akkumulierten4.
Um zu untersuchen, wie die Ligandendichte die Thrombozytenmigration beeinflusst, wurde die cRGD-Dichte durch Variation des Verhältnisses von PLL-PEG-Biotin zu PLL-PEG in der ersten Beschichtungsschicht angepasst. Diese Daten zeigen, dass Mausplättchen bei einer Konzentration von 2,5 % PLL-PEG-Biotin eine optimale Migration erreichen. Die Migration ist sowohl bei niedrigeren (1%) als auch bei höheren (10%) Konzentrationen von PLL-PEG-Biotin reduziert (Abbildung 3A,B). Diese substratabhängigen Veränderungen des Migrationsverhaltens gehen mit Veränderungen in der Thrombozytenmorphologie einher (Abbildung 3C). Bei niedrigen Ligandendichten (1 %) breiten sich die Thrombozyten nicht ausreichend aus, was durch eine geringe projizierte Thrombozytenfläche und einen geringen Thrombozytenumfang belegt wird (Abbildung 3C). Dies deutet auf eine unzureichende Integrinaktivierung und Outside-In-Signalgebung hin7. Folglich sind die Blutplättchen nicht in der Lage, Kräfte auf die cRGD-Liganden auszuüben, das Substrat nicht umzugestalten und migrieren nicht (Abbildung 3A,B).
Bei einer mittleren Ligandendichte (2,5 %) kommt es zu einer signifikanten Zunahme der Thrombozytenfläche und des Thrombozytenumfangs (Abbildung 3C). Die Blutplättchen breiten sich effektiv aus, zerstören mechanisch die labilen cRGD-Liganden und migrieren (Abbildung 3A,B). Bei hohen Ligandendichten (10 %) nimmt die Spreizung jedoch zu, die Thrombozyten polarisieren jedoch nicht, was durch ein reduziertes Aspektverhältnis angezeigt wird (Abbildung 3C). Unter diesen Bedingungen bleiben die Blutplättchen an das klebrige Substrat gebunden und wandern nicht, da sie die labilen cRGD-Liganden nicht brechen können (Abbildung 3A,B).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Thrombozytenmigration entscheidend von den Hafteigenschaften des Substrats abhängt. Plättchen können nur wandern, wenn sie ausreichend mit adhäsiven Liganden interagieren und gleichzeitig Zugkräfte erzeugen, die stark genug sind, um die Zugtoleranz des adhäsiven Substratszu überwinden 4,6,7,8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Beschichtungsverfahren und Live-Bildgebung der Thrombozyten-Substrat-Interaktion. (A) Foto der zusammengesetzten Kammer. (B) Grundsatz des Protokolls. Links: Schematische Darstellung der Beschichtung. Plasmabehandelte Glasdeckgläser wurden mit drei Schichten beschichtet. Die erste Schicht ist das Gemisch aus PLL-PEG und PLL-PEG-Biotin (das PLL-PEG-Rückgrat ist inert für die Zellen und verhindert eine unspezifische Bindung). Die zweite Schicht besteht aus Neutravidin-FITC und die dritte Schicht aus Biotin-cRGD. Neutravidin-FITC überbrückt PLL-PEG-Biotin und Biotin-cRGD. Blutplättchen binden über Integrine in der Plasmamembran an das Biotin-cRGD. Rechts: Illustration der Entbindung von Biotin-Avidin durch Thrombozytenintegrine. Blutplättchen üben durch Integrin-cRGD-Bindung Kräfte auf das Substrat aus und brechen entweder die obere cRGD-Biotin - Neutravidin-FITC - Bindung oder die untere Neutravidin-FITC - PLL-PEG-biotin - Bindung. Ein Bruch der unteren Bindung zwischen Neutravidin-FITC und Biotin-PLL-PEG führt zu einem verminderten Fluoreszenzsignal, während ein Bruch der oberen Bindung zwischen Biotin-cRGD und Neutravidin-FITC dies nicht tut. (C) Zeitreihen, die die Thrombozytenmigration und den Abbau labiler cRGD-Liganden zeigen. Bereiche mit reduzierter Fluoreszenz zeigen die Migrationsspuren von Blutplättchen an (siehe auch Abbildung 2A), und Bereiche mit erhöhter Fluoreszenz deuten auf eine FTIC-Neutravidin-Biotin-cRGD-Akkumulation auf migrierenden Blutplättchen hin. Maßstabsleiste: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Immunfluoreszenz-Bildgebung der Thrombozytenmigration, die durch das remodellierte Substrat kodiert wird. (A) Repräsentative Filmsequenz der einzelnen Thrombozytenmigration. Links: Phasenkontrastbilder von wandernden Blutplättchen. Blutplättchen polarisieren, indem sie an der Vorderkante ein Lamellipodium bilden und anschließend migrieren. Rechts: Neutravidin-FITC wurde vom Substrat entfernt, so dass der "Fußabdruck" der Thrombozytenmigration zurückblieb. Rupturiertes cRGD-Biotin-Neutravidin-FITC reichert sich im Zentrum der wandernden Blutplättchen an. (B) Repräsentative Bilder der Thrombozytenmigration auf ligandenlabilen cRGD-Biotin-Avidin-Beschichtungen. Ober: Mit Phalloidin (Alexa FluorTM 594) gefärbte Blutplättchen zeigten eine große Lamellipodiumbildung und eine polarisierte Form, die an wandernde Blutplättchen erinnerte. Migrierende Blutplättchen brechen die cRGD-Biotin-Neutravidin-FITC-Bindung auf, wodurch Migrationswege auf dem Substrat entstehen, die durch ein reduziertes FITC-Signal angezeigt werden. Unten: beschnittenes Bild mit größerer Vergrößerung. (C) Die Migrationspfade wurden in Fidschi manuell mit gelben Linien gezeichnet. Maßstabsbalken: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Das Verhältnis von PLL-PEG-Biotin zu PLL-PEG bestimmt die Thrombozytenmigration und -form. (A) Repräsentative Bilder von Thrombozyten auf 1%, 2,5% und 10% PLL-PEG-Biotin-Beschichtungen, Maßstabsbalken: 5μm. (B) Quantifizierung der Thrombozytenadhäsion, der Migrationseffizienz und des Migrationsabstands, n = 4 unabhängige Experimente; Mittelwert/SD; One-Way-ANOVA/Tukey; **p &lt; 0,01; p &lt; 0,001; p &lt; 0,0001, ns: nicht signifikant (C) Quantifizierung der Deskriptoren der Thrombozytenform (Fläche, Umfang, Zirkularität und Aspektverhältnis), n = 4 unabhängige Experimente; Mittelwert/Min-Max; One-Way-ANOVA/Tukey; **p &lt; 0,01; p &lt; 0,001; p &lt; 0,0001, ns: nicht signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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